《酶工程》复习大纲答案详解

《酶工程》复习大纲

试题题型：名词解释，判断题，选择题，简答题，论述题，实验设计题。

第一章酶工程基础

一、名词解释：

酶：指生物体产生的具有催化活性的生物大分子。

酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或服务于其它目的地一门应用技术。

转换数：酶使底物每分钟变化的分子数。

催化周期：单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值，即每摩尔酶单位时间催化底物转化为产物的摩尔数。

酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。

比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或RNA所拥有的酶活力单位数。

酶活国际单位IU: 1961年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，每分钟内能转化1μmol底物或催化1μmol产物形成所需要的酶量为1个酶活力单位，即为国际单位（IU）。

催量kat：每秒钟转化 1 摩尔底物（被反应物）所需的酶活力为1个katal ,简称 kat

二、问答题

1、酶催化的特点有哪些？

高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高,使得反应速率更快；

专一性：一种酶只能催化一种或一类底物,如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽、二肽酶可催化各种氨基酸脱水缩合形成的二肽；

温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的.

活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等. 有些酶的催化性与辅因子有关.

易变性：由于大多数酶是蛋白质,因而会被高温、强酸、强碱等破坏

2、影响酶催化作用的因素有哪些？

◇1温度：酶促反应在一定温度范围内反应速度随温度的升高而加快；但当温度升高到一定限度时，酶促反应速度不仅不再加快反而随着温度的升高而下降。在一定条件下，每一种酶在某一定温度时活力最大，这个温度称为这种酶的最适温度。

◇2酸碱度：每一种酶只能在一定限度的pH范围内才表现活性，超过这个范围酶就会失去活性。

◇3酶浓度：在底物足够，其它条件固定的条件下，反应系统中不含有抑制酶活性的物质及其它不利于酶发挥作用的因素时，酶促反应的速度与酶浓度成正比。

◇4底物浓度：在底物浓度较低时，反应速度随底物浓度增加而加快，反应速度与底物浓度近乎：成正比，在底物浓度较高时，底物浓度增加，反应速度也随之加快，但不显著；

当底物浓度很大且达到一定限度时，反应速度就达到一个最大值，此时即使再增加底物浓度，反应也几乎不再改变。

◇5抑制剂：能特异性的抑制酶活性,从而抑制酶促反应的物质称为抑制剂。

◇6激活剂：能使酶从无活性到有活性或使酶活性提高的物质称为酶的激活剂。

3、试述米氏方程和米氏常数Km的意义。

米氏方程就是表示在酶促反应中底物浓度与反应速率的关系式V=(Vmax*[S])/(Km+[S])；其中V是反应速率 Km即米氏常数 Vmax是酶反应最大速率[S]是底物浓度；

米氏方程表示一个酶促反应的起始速度（v）与底物浓度（S）关系的速度方程。

其意义为：①方程反映了反应性质、反应条件、反应速度之间的关系；

②反映了反映速度与底物浓度之间的关系，当[S]远大于Km时,反应速度与底物浓度无关;

③反映了酶反应速度与酶浓度的关系,当[S]远大于Km时,v=k2[E0]为线性关系，酶活正比

于酶浓度。

4、测定酶活力时终止酶活力的方法有哪些？

终止法是在恒温系统中进行酶促反应，间隔一段时间后，终止酶反应，然后测定反应物的消耗量或产物的生成量，从而计算出酶的活性。可以加热变性、强酸、强碱、三氯乙酸、SDS、乙醇等使酶失活或终止反应。催化反应的底物或产物可用化学法、放射性化学法、酶偶联法等方法进行测定。

5、如何绘制双倒数曲线（L-B作图法）？

一个酶促反应速度的倒数（1/v）对底物浓度的倒数（1/[s]）的作图。X和Y轴上的截距分别代表米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）的倒数

第二章酶的发酵工程

一、名词解释

组成酶：根据酶的合成方式和存在时间, 微生物细胞内的酶可分为组成酶和诱导酶, 组成酶是细胞内一直存在的酶, 它的合成仅受遗传物质控制即受内因控制。

诱导酶：根据酶合成的方式，微生物细胞内的酶可以分为诱导酶和组成酶两类。诱导酶是在环境中有诱导物(通常是酶的底物)存在的情况下，由诱导物诱导而生成的酶。

协同诱导：加入一种诱导剂后微生物能同时或几乎同时合成几种酶，它主要存在于较短的代谢途径中，合成这些酶的基因由同一个操纵子控制。

顺序诱导：指第一种酶的底物会诱导第一种酶的合成，而第一种酶的产物又可诱导第二种酶的合成，依此类推合成一系列的酶。先后诱导合成分解底物的酶和分解其后各中间代谢产物的酶.

终产物阻遏：催化某一特异产物合成的酶，在培养基中有该产物存在的情况下常常是不合成的，即受阻遏的。

分解代谢物阻遏: 大肠杆菌在含有能分解的两种底物（如葡萄糖和乳糖）的培养基中生长时，首先分解利用其中的一种底物（葡萄糖），而不分解另一种底物(乳糖)，这是因为葡萄糖的分解代谢产物阻遏了分解利用乳糖的有关酶合成的结果，此作用即为分解代谢产物阻遏。

葡萄糖效应: 由于葡萄糖常对分解利用其他底物的有关酶的合成有阻遏作用，故分解代谢产物阻遏又称为葡萄糖效应。

二、问答题

1、常见的产酶微生物有哪些？（P22）

细菌、放线菌、酵母菌和霉菌

2、对产酶菌种有哪些要求？

（1）酶的产量高

（2）容易培养和管理，产酶细胞容易生长繁殖，适应性较强，便于管理

（3）菌株遗传性要稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，保证生产的稳定性

（4）菌株能利用廉价原料，发酵周期短，生产成本低

（5）发酵产物利于酶产品的分离纯化，最好是分泌型的胞外酶

（6）菌株安全可靠，不是病原菌，不产毒素及其他有害物质，不影响生产人员的身体健康。

（7）基因工程菌株必须符合安全性要求。

3、从微生物产酶的上、中、下游阶段调控来分析，可通过哪些措施来提高产酶量？（包括优良产酶菌种的选育、设备的选型、发酵方法的选择、发酵工艺的控制、添加诱导物、解除阻遏物、添加表面活性剂和产酶促进剂、选择先进的分离纯化设备和技术等）（P32）

改善菌种，选择优良菌种，产酶能力高使其酶产量提升

选择通风搅拌设备匹配、容量尽可能与产酶菌种匹配的发酵罐

采用连续发酵的方式，连续加入培养物并不断的提取酶产物防止其次级代谢产物堆积。

添加一些表面活性剂，增加产酶细胞的透过性，打破胞内酶合成的反馈平衡

加诱导物（酶的作底物、酶的反应产物、酶的底物类似物）

解除阻遏物（采用难以利用的碳源，或采用分次添加的碳源的方法使培养液中的碳源保持在不至于引起分解代谢物阻遏的浓度；对于末端产物阻遏的酶，可通过控制末端产物的浓度使阻遏解除）

添加表面活性剂（非离子型，对酶分子有一定的稳定作用）

添加产酶促进剂（指那些非微生物生长所必需，能提高酶产量但作用机制尚未阐明的物质，可以是酶的激活剂或稳定剂，也可能是产微生物的生长因子，或有害金属的螯合剂）

选择先进的分离纯化设备和技术

4、结合酶生物合成的四种模式，试论述如何提高酶的生物合成量。

酶生物合成的模式分为4种，即同步合成型、延续合成型、中期合成型和滞后合成型。

（1）遗传控制

①诱变育种

a. 使诱导型变为组成型：选育组成型突变株

b. 使阻遏型变为去阻遏型

c. 解除反馈阻遏：选育营养缺陷型突变株、选育结构类似物抗性突变株

d. 解除分解代谢物阻遏：选育抗分解代谢阻遏突变株

②基因工程育种：改变细胞调节基因，使菌种由诱导型变为组成型；增加结构基因的拷贝

数，增加细胞专一性酶的生产。

（2）条件控制

①添加诱导物酶的作用底物、作用底物的前体、反应产物、酶的底物类似物或底物修饰物

②降低阻遏物浓度:

产物阻遏：除去终产物；添加阻止产物形成的抑制剂

分解代谢物阻遏：避免使用葡萄糖、避免培养基过于丰富、添加一定量的cAMP

②添加表面活性剂: 离子型( Tween－80),对细胞有毒害作用;

非离子型( TritonX－100),增加细胞通透性.

④添加产酶促进剂：酶促进剂对不同细胞、不同酶的效果各不相同，需通过试验选用适当

的产酶促进剂并确定最适浓度,其作用机制并未阐明清楚。如添加植酸钙镁可使桔青霉素生产磷酸二酯酶的量提高10－20倍。

5、如果要筛选酸性蛋白酶或酸性淀粉酶高产菌株，请制定初筛和复筛实验方案（策略）。

第三章酶的分离工程（不作考核）

第四章固定化酶与细胞

一、名词解释

固定化酶：用物理或化学手段定位在限定的空间区域，并使其保持催化活性，可重复利用的酶。

固定化细胞：固定化细胞技术是利用物理或化学手段将游离状态的细胞固定或定位在限定的空间区域，并使其保持固有的催化活性。

构象效应：酶在固定化过程中，由于酶与载体相互作用使酶的活性中或变构中心的构象发生变化，从而导致了酶与底物结合能力或酶催化底物转化的能力降低，导致

酶活性下降，这种效应被称为构象效应。

屏蔽效应：酶经固定化后，载体会成为底物或者其他效应物结合到活性中心或者变构中心

的空间障碍，降低了酶与底物或其他效应物结合，从而影响酶的催化活性。

微扰效应：由于载体固有的性质使紧邻固定化酶的区域发生微环境变化，使酶的催化能力Array及酶对效应物作出调节反应的能力发生改变，这种效应被称为微扰效应。

分配效应：由于载体的亲水或者疏水特性以及带电特征使底物、产物或其他效应物在固定化酶所处微观环境和宏观体系间发生不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，

从而影响了反应速度。

外扩散限制：底物、产物和其他效应物从宏观体系穿过包围在固定化酶周围近乎停滞的液膜层（又称为Nernst层）到固定化酶表面所受到的限制。

内扩散限制：底物、产物和其他效应物从固定化颗粒表面进入颗粒内部酶活性位点受到的一种限制。

二、问答题

1、固定化酶具有什么优点？

极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。

以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。

反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化。

绝大多数情况下提高了酶的稳定性。

较能适应于多酶反应。

酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。

3、评价固定化酶固定效果的参数有哪些？

由于选用的固定化方法不同，固定化酶的活力和性质也有所不同，因此需要对不同的固定化方法进行评价。评价的指标主要有：

（1）固定化酶的比活每克（毫克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。

（2）操作半衰期是衡量稳定性的指标。指在连续使用的条件下，固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）。固定化酶的操作半衰期是影响其实际应用的重要因素。

(3)偶联效率＝（加入的蛋白量－溶液中残留的蛋白量）/加入的总蛋白量×100％

(4)活力回收＝(固定化酶活力/投入的总酶活力)×100％

(5)相对酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值。

(6)酶载量单位载体所固定的酶活力（或酶蛋白量）。

（7）酶的固定化效率与酶的活力回收率；酶的固定化效率：是指酶与载体结合的百分率。酶活力回收率：指固化酶的总活力与用于固化酶的总酶活力的百分率。

4、固定化酶活力降低的可能原因有哪些？（P87）

一般来说，固定化酶的活力比游离酶的低。固定酶的活力要低于等摩尔游离酶的活力的原因可能是：

（1）酶分子在固定化过程中，由于构象效应造成活性中心或调节中心空间构象发生变化或者由于屏蔽效应造成酶活性中心无法结合底物。

（2）有部分活性中心的氨基酸残基参与了与载体的结合，导之部分酶完全丧失活性。

（3）酶活性未参与反应，但与载体结合后使酶与底物的结合和产物的扩散存在位阻效应。5、固定化对酶反应体系产生了哪些影响（效应）？

为了便于分析，通常在固定化酶体系中作两个预先的假设：一是酶在载体表面或多孔介质内的分布是完全均匀的；二是整个系统各向同性。在上述条件下，固定化对反应体系造成以下效应。○1构象效应

○2屏蔽效应

○3微扰效应

○4分配效应

○5扩散限制效应（外扩散限制和内扩散限制）

6、固定化酶的表观米氏常数Km受哪些因素的影响？（P89）

固定化可以使酶分子的空间构象发生一定程度的改变，可以影响到酶分子与底物的亲和力，造成酶分子Km值的变化，由于构象改变引起的Km值变化很难经行预测，其受载体的类型、固定化方法等因素的制约。

载体的带电性质可以影响固定化酶的表观Km值。

固定化酶载体的疏水性强弱同样会影响到底物在酶催化微环境的浓度分配，进而影响固定化酶的表观Km值。

酶的表观Km值还受溶液中离子强度的影响。

7、载体的带电荷性质如何影响固定化酶最适pH的变化？

酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力－pH曲线常常会发生偏移。带负电荷的载体固定化的酶的最适pH向碱性偏移，带正电荷的载体固定化的酶的最适pH向酸性偏移。

8、载体的亲疏水性质如何影响固定化酶动力学参数表观Km值的变化？

固定化酶载体的疏水性强弱同样会影响到底物在酶催化微环境的浓度分配，进而影响固定化酶的表观Km值，如果载体的疏水性较强，疏水性底物在酶催化的微环境的分配增加，使固定化酶的表观Km值降低，对于亲水性底物在酶催化的微环境的分配相对减少，造成酶的表观Km值增加；反之，如果亲水性载体用于固定化酶，对于疏水性底物的表观Km值会值增加，对亲水性底物的表观Km值降低。

第五章化学酶工程

一、名词解释

酶分子改造：通常把改变酶蛋白一级结构的过程称为改造。

酶分子修饰：通过各种方法可使酶分子结构发生某些变化，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。

模拟酶：用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的化学反应过程，从原理的本质定义为是用人工方法合成具有酶性质的一类催化剂。

肽酶：是模拟天然酶的活性部位，人工合成的具有催化活性的多肽。

抗体酶：又称催化抗体，是一种新型人工酶制剂，是抗体的高度特异性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化能力的免疫球蛋白。

印迹酶：通过分子印迹技术产生类似于酶的活性部位的空腔，对底物产生有效的结合作用的一类人工模拟酶。

二、问答题

1、简述酶化学修饰的目的。（P101）

酶化学修饰的目的在于：人为地改变某些天然酶的性质，创造某些天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的特性，概括起来有：

（1）提高生物活性。

（2）增强酶的稳定性。

（3）降低酶类药物的抗原性。

（4）改变酶学性质。

2、在酶的化学修饰过程中应考虑哪些因素？（P101）

(1)被修饰酶。开始设计酶化学修饰反应时，对被修饰酶的活性部位、稳定条件、侧链基团性

质及酶反应的最适条件等应尽可能全面了解。

(2)修饰剂的选择。要求修饰剂具有较大的相对分子质量，对蛋白质的吸附有良好的生物相容

性和水溶性，修饰剂表面具有比较多的活性基团。

(3)修饰反应条件的选择。修饰反应一般要选择在酶稳定的条件下进行，尽可能少破坏酶的必

需集团，选择酶与修饰剂的结合率和酶活回收率都较高的反应条件。对反应条件中酶与修饰剂的分子比例、反应温度、pH、时间、溶剂性质和离子强度等在确定反应条件时也必须考虑。

3、简述酶分子侧链上的修饰功能基团主要有哪些？

酶的化学修饰主要是对一些活泼性比较强的氨基酸侧链基团进行修饰。主要包括：氨基（赖氨酸残基）、羧基（谷氨酸、天冬氨酸残基）、羟基（丝氨酸、苏氨酸残基）、巯基（半胱氨酸残基）、咪唑基（组氨酸残基）、胍基（精氨酸残基）、酚基（酪氨酸残基）、吲哚基（色氨酸残基）、甲硫基（蛋氨酸残基）。

4、简述常用的酶分子表面化学修饰方法。（P107）

（1）聚乙二醇对酶的修饰，该类修饰剂是既能溶于水，又可以溶于绝大多数有机溶剂的两亲分子，且在没有免疫原性和毒性，在体内不残留。

（2）右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯对酶的修饰：○1溴化氰法；，○2高碘酸法

（3）糖肽对酶的修饰：糖肽一般是通过纤维蛋白酶或蛋白水解酶降解纤维蛋白或γ—球蛋白而得。糖肽结构上有氨基，这些氨基经合适的方法活化后能与酶分子中的氨基发生反应而以共价键结合实现对酶的修饰。

5、在酶分子的表面化学修饰中，常用的大分子修饰剂有哪些？

聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清蛋白。

6、修饰酶的性质发生了哪些变化？

首先要强调的是，我们对酶进行修饰的目的就是要改变酶的结构和特性，而且要使这种改变

朝着对人类有用的方向进行。不管是从理论上分析还是从实际修饰的结果来看，酶经修饰之后，性质朝任何方向改变的可能性都存在，而且多数改变都是不利的。酶修饰之后，性质的变化因酶、修饰剂和修饰方法的不同而出现很大的差异。

（1）热稳定性用前面介绍的一些修饰剂对酶进行修饰，在多数情况下可以提高酶的稳定性。但PEG没有明显的提高。

（2）抗原性抗原性是药物用酶必须解决的问题。在前面介绍过的修饰剂中，被认为可以消除酶的抗原性的修饰剂只有PEG和人血清白蛋白。

（3）对各类失活因子的抵抗力由于酶修饰之后，表面会带上修饰剂而受到保护，因此，酶修饰之后，抵抗蛋白酶水解和其它失活因子的能力普遍增强。

（4）在生物体内的半衰期由于修饰之后，稳定性和对抗各种失活因子的能力增强，因此，半衰期也普遍延长。

（5）修饰酶的最适pH

（6）修饰酶的动力学性质

7、抗体酶具有什么特点？

①能催化一些天然酶不能催化的反应抗体酶的多样性决定了抗体酶的催化反应类型多样性；催化抗体的构建，表明可通过免疫学技术，为人工酶的设计和制备开辟一条新的、实用化的途径。这种利用抗原-抗体识别功能，把催化活性引入免疫球蛋白结合位点的技术，或许可能发展成为构建某种具有定向特异性和催化活性的生物催化剂的一般方法。

②有更强的专一性和稳定性抗体酶作为一种具酶和抗体双重功能的新型大分子用作分子识别元件，具有优于酶和抗体的突出特点。因为配体底物与抗体酶的活性部位结合后，会立即发生催化反应，释放产物，所以每一次分子反应之后，抗体的分子识别位点都可以再生，这就使催化抗体能够作为一种可以连续反复使用的可逆性分子。

③化作用机制不同

酶催化机制是“锁钥学说”（Lock and Key）及“诱导契合学说”（Induced-Fit）；而抗体酶的催化剂至目前还没有完全搞清楚。Janda曾提出“识别开关”或“诱饵开关”（Bait and Switch）机制，即抗体将底物“钓进”抗体结合部位，然后使其与抗体结合，打开底物转化为反应过渡态的“开关”，导致共价键断裂，形成产物，还有待研究。

8、试述采用诱导法制备抗体酶的一般步骤。

首先合成稳定反应的过渡态类似物，将此化合物作为半抗原与载体蛋白相连，然后免疫动物制备单克隆抗体，由它诱导产生的单克隆抗体可以按预定的方向获得催化活性。

9、简述分子印迹聚合物的制备方法。

所谓分子印迹是制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。这个化合物叫印迹分子或叫模板分子。印迹技术包括下列内容：

①选定印迹分子和功能单体，使两者发生互补反应。

②与印迹分子发生互补作用的单体与其它单体共同发生聚合反应。

③将印迹分子从聚合物中去除。这样形成的聚合物内就保留有和印迹分子的形状、大小完全一样的空穴，印迹的聚合物能维持相对于印迹分子的互补性，因此，该聚合物能以高选择性重新结合印迹分子。分子印迹也叫主-客体聚合作用或模板聚合聚合作用，制得的分子聚合物称为分子印迹聚合物。

10、简述生物印迹酶的基本制备过程。（P140）

将酶溶解于含有其配体的缓冲溶液中，使其构象发生改变，有利于与底物结合，再将此酶液冷冻干燥形成酶粉，用有机溶剂冲洗干酶粉除去配体后，将其过滤并真空干燥，在无水或微水有机溶剂中，由于酶的记忆功能，这种新构象仍能保持，致使结合配体的能力大大提高。

第六章生物酶工程

一、名词解释

定点突变：在基因的特定位点引入突变，即通过添加、插入或删除已知的DNA序列中特定的核苷酸序列。

酶分子定向进化：人为的控制进化条件，模拟天然进化机制来达到体外对酶基因的改造，产生基因多样性，并通过定向筛选技术获取定向选择获取特定性质的酶。

易错PCR：是一种迅速、简便的在DNA序列中进行随机突变的方法，主要特点是能够控制它的突变频率。

连续易错PCR：将一轮PCR扩增得到的有用突变基因作为下一轮的模板进行PCR扩增，连续反复进行随机诱变使每一轮获得的小突变可以积累大部分的有益突变。

DNA改组：用Dnase 1 或者用超声波进行随机切割产生随机大小片段，再从正突变基因库中分离出来所需DNA片段，得到的片段在不加引物的多次PCR循环中，彼此之间互为模板和引物进行扩增，直到连接成为接近目的片段长度的DNA分子，然后再利用基因两端序列为引物扩增获得全长基因，这是来自不同基因之间的重组。

复合酶：复合酶是一种混合物，由多只能跟没组成，用来完成一系列的催化反应。由2种或2种以上单一酶制剂混合而成。

融合酶：指将两个或两个以上的酶分子组合在一起形成的融合蛋白。

二、问答题

1、如何理解酶分子改造的理性设计和非理性设计？

在研究天然酶及其突变体时，通常先获得酶分子特征、空间结构以及结构与功能的关系等方面信息，这些用各种生物化学、光谱学、晶体学等方法来解决，然后根据这些信息进行酶分子的改造，这就是酶分子的理性设计，它包括化学修饰、定点突变等，而不需要准确知道酶蛋白结构与功能等信息，直接通过随机突变、筛选等方法进行酶分子的改造，称为酶分子的非理性设计，如定向进化、杂合进化。

1、简述酶分子定向进化的一般步骤。

酶定向进化通常分3步进行：首先通过随机突变或基因体外重组创造基因多样性；然后导入适当载体后构建突变文库；最后通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶。

3、酶分子定向进化的基本方法有哪些？

①易错PCR

可以用Mn2＋来替代Mg2＋，使PCR时发生突变。

②DNA重组（改组）(DNA shuffling)

重组可以在同一基因的不同突变体之间进行，也可以在不同物种的同源基因间进行。因此，DNA 重组就是把不同来源的同源基因断裂成不同大小的片段，然后对这些片段进行重新组合。

③外显子改组;与DNA改组相似，都是在各自含突变的片段进行交换。

④随机引物体外重组

⑤交错延伸法

⑥临时模板随机嵌合法

4、易错PCR的技术目的和策略有哪些？（调整dNTP浓度、增加Mg2+浓度、添加Mn2+等）

易错PCR是一种迅速、简便的在DNA序列中进行随机突变的方法，主要特点是能够控制它的突变频率。用PCR扩增目的基因时，通过使用低保真度的Taq DNA 聚合酶或改变PCR常规的反应条件，如调整dNTP浓度、增加Mg2+浓度、添加Mn2+等，引起碱基以某一频率进行随机错配而引入多点突变，构建突变体库，然后选择或筛选出所需的突变体。

目的：将一轮PCR扩增得到的有用突变基因作为下一轮的模板进行PCR扩增，连续反复进

行随机诱变，结果使每一轮获得的小突变可以积累大部分的有益突变。

5、简述DNA改组技术的基本原理和操作。

DNA 改组技术又称 DNA 重排技术或有性PCR，指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。通过用DNase 1 或者用超声波进行随机切割产生随机大小片段，再从正突变基因库中分离出来所需DNA片段，得到的片段在不加引物的多次PCR循环中，彼此之间互为模板和引物进行扩增，直到连接成为接近目的片段长度的DNA分子，然后再利用基因两端序列为引物扩增获得全长基因，这是来自不同基因之间的重组。

6、简述交错延伸PCR技术的原理和特点。

这是一种简化的DNA改组法，它在PCR反应中，将含不同点突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂的复性/延伸，反复重复直到形成全长基因片段。

它的主要特点在于能将PCR反应中的常规的退火和延伸合二为一，大大缩短反应时间，结果得到非常短的新生链，又将经过变性的新生链作为引物与体系内同时存在的不同模板退火，继续延伸。由此生成的新生DNA分子中含有大量的突变组合，有利于酶的新性质的产生。

第七章非水相酶催化

一、名词解释

最适水含量：在特定的有机介质反应体系中，催化速度达到最大时的含水量。

水活度Aw：在一定的温度与压力下，反应体系中水的蒸汽压与同样状态下纯水蒸汽压的比值。

疏水参数lgP：lgP是某有机溶剂在正辛醇/水体系中分配系数P的对数，lgP可以定量描述溶剂的极性，可作为有机溶剂的选择标准。

pH记忆：有机溶剂中酶能够保持其冷冻干燥或沉淀前所在缓冲液中的pH.

分子印迹：由竞争抑制剂导致在酶构象改变在除去抑制剂后在低水条件下仍能保持。这种酶分子记忆原来在水相中的一些特性的现象称为分子印记。

酶的区域选择性：在酶促反应中，底物某一位置上的基团被被酶选择性的转化，而另一位置上的相同基团没有被转化。

溶剂工程：有机介质条件下，酶所处溶剂系统的改变会改变酶的催化活性。这种通过改变反应介质，实现酶催化性质改变的技术称为溶剂工程。

二、问答题

1、酶催化反应的介质有哪些？

（一）水介质

（二）非水介质

①有机介质反应体系

②超临界流体反应体系

③气相介质反应体系

④离子液介质反应体系

2、非水介质中酶催化反应的特点。

（1）在非水系统内，绝大多数有机化合物溶解度高，尤其是能提高非极性底物的溶解度。

(2)非水介质的参与可以改变反应平衡，使酶可以催化在水中不能进行的反应。

（3）能抑制依赖于水的某些不利反应和副产物。

（4）从有机溶剂中分离纯化产物比从水中容易，从低沸点的溶剂中可以更容易地分离纯化产物。

(5)酶在非水体系中的热稳定性和储存稳定性增加，而且可以有效减少反应过程中的微生物污染。

（6）可以控制底物的特异性，区域选择性和立体选择性。

(7)在很多情况下，可以实现游离酶的回收与再利用。

(8)有机溶剂的凝固点一般远低于水，使一些对温度非常敏感的酶在适宜的温度下进行催化反应。

3、简述酶促反应的有机介质体系种类。

根据酶和水的分布特性可以将有机介质反应体系分为以下几种类型：

①酶在与水共融的有机介质体系中催化反应；

②酶在有机介质和水组成的两项体系中催化反应；

③酶在近乎无水的有机溶剂中催化反应，包括非极性有机溶剂-酶悬浮体系和非极性有机

溶剂-PEG修饰酶单相体系

④酶在反胶束体系中催化反应

4、水对有机介质中酶催化反应的影响有哪些？（酶的空间构象、反应速率、平衡及立体选择性）有机介质中水的含量与酶的空间构象、反应速率、平衡及立体选择性等都有直接关系。

（1）水对酶分子空间构象的影响（2）水对有机介质酶促反应速率的影响（3）水对酶催化反应平衡及立体选择性的影响（4）有机介质反应体系中水含量的调控

5、有机溶剂对有机介质中酶催化反应的影响有哪些？（影响的三个方面及其对酶活性、效应物分配、溶剂结构的影响）

有机溶剂主要通过三个方面来影响酶促反应。首先有机溶剂与酶分子直接发生作用，通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象，从而导致酶的活性受到抑制或者失活；其次有机溶剂直接与酶分子周围的水相互作用，造成酶分子必须水的变化和重新分布；再次是有机溶剂影响到底物和产物的分配与扩散，影响反应的进行。

6、有机介质体系中酶活性显著降低的原因是什么？

（1）传质障碍是造成酶活性下降的主要原因之一

（2）有机溶剂可以增加酶促反应的活化能，导致酶活性的下降

（3）有机介质中酶分子活性中心刚性的增加，也是造成酶活性下降的主要原因

7、简述有机介质中酶的稳定性发生了哪些变化？

有机介质中酶分子的刚性增加，同时有机溶剂的引入使一些与水相关的酶蛋白不稳定因素大大降低，使得酶分子在有机介质中的热稳定性、储存稳定性以及对变性剂的耐受性显著提高。

8、试述有机介质中酶的热稳定性提高的原因。

在惰性有机溶剂中许多酶的热稳定性显著增加，酶的热稳定性与溶剂的含水量密切相关，一般随着含水量的增加热稳定性降低。

第八章酶反应器和酶传感器

一、名词解释

酶反应器：以酶作为催化剂进行酶促反应的设备称为酶反应器。

酶传感器：以酶作为分子识别元件上的敏感材料，同各种不同的转换器结合所构成的一类生物传感器，称为酶传感器。

二、问答题

1、试比较教材中6类酶反应器的优缺点。

搅拌罐式反应器:优点：结构简单，内容物混合充分均匀，容易控制温度和pH，传质阻力较低，

能处理胶态底物及不溶性底物，固定化酶容易更换。

缺点：游离酶不能回收重复利用，固定化酶易破损而造成酶的损失。

固定床式反应器：优点：单位体积中所含酶量较多，因而催化效率较高。

缺点：只适用于可溶性底物，胶态底物和不溶性底物则不能使用该反应器；

难以控制温度和pH；底物和产物会产生轴向浓度分布；清洗和更换部分

固定化酶较麻烦；床内压力降较大，底层固定化酶颗粒所受压力较大易

引起酶颗粒的变形或破碎。

流化床式反应器：优点：混合均匀，传质传热效果好，容易控制温度和pH，压力降较小，不易堵塞，能处理黏度较高的反应

缺点：动力成本高，流体动力学参数复杂，难以放大。

鼓泡式反应器：优点：借助气体idea鼓泡作用即可达到反应体系的混合效果，也可以提供酶催

化反应所需要的气体底物，另外还可以降低或消除挥发性产物对酶的抑

制作用，此外，鼓泡式反应器的结构简单，操作容易，剪切力小，传质

传热速率高。

膜式反应器：优点：压降小，酶的容易更换，可承受较大的压力，设备放大比较容易

缺点：反应器中单位体积内催化剂的有效面积小，造成成本相对较高。

喷射式反应器:优点：优点：结构简单，体积小，物料混合效果好，温度高，催化反应速度快，2、2、选择酶反应器类型的依据有哪些？

根据酶的应用形式选择酶反应器

如游离酶多采用搅拌灌式反应器，而固定化酶多采用填充床或流化床反应器。如有气体参与反应，可选用鼓泡式反应器。

根据酶反应动力学性质选择酶反应器

主要考虑底物与酶的混合程度、高底物浓度是否会产生抑制现象、所要达到的底物转化效率和产物是否会对反应产生抑制作用。如有抑制可采用流加式反应器。

根据底物和产物的理化性质选择酶反应器

要考虑的理化性质主要有分子大小、溶解度、粘度、挥发性等。

根据反应操作要求选择反应器

根据酶的稳定性选择反应器

第九章酶及抑制剂的应用

一、名词解释

酶制剂：是指从生物中提取的具有酶特性的一类物质，主要作用是催化食品加工过程中各种化学反应，改进食品加工方法。

酶抑制剂：凡可以减弱、抑制甚至破坏酶活性，但不引起酶蛋白变性的物质都可以称为酶的抑制剂。

不可逆抑制：抑制不能被解除，酶活性不能被恢复的抑制。

可逆抑制：可通过加入其它物质或用其它物理方法（如透析、超虑等）解除的抑制，就称为可逆抑制。

二、问答题

1、试述酶的可逆抑制作用的类型及其动力学参数的变化特点。

可逆抑制通常又可分为三类。

竞争性抑制：抑制剂与底物竞争性地同酶的活性部位结合。如底物类似物。

非竞争性抑制：抑制剂和底物可单独或同时与酶结合，而且互不干扰。如重金属离子与酶分子中的－SH络合。

反竞争性抑制：抑制剂只能在底物与酶结合之后，才能与酶结合。如L－Phe和L－同型Arg 对碱性磷酸酶的抑制作用；肼类化合物对胃蛋白酶的抑制。

2、举5个例子说明酶在医药、农业、食品、轻化工、环保或分子生物技术领域的应用。

以酶活性的变化作为疾病诊断的指标直接检测人体某种酶活性的变化

溶菌酶可以防止因细菌引起的腐败

加酶洗涤剂

分子拼接方面的应用，DNA连接酶、DNA聚合酶

在能源开发领域的应用，如生物柴油加工。

7、学习了《酶工程》课程以后，您对“生活中的酶”有了哪些认识？举3个以上例子说明。8、