狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法
摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法
狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征
RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白
，亦称基质蛋白(Matrix，简称M)，是狂犬病毒的最小结构蛋白。病毒的中央核心是一个直径为40nm的核衣壳，核衣壳(Nucleocaps)由病毒核酸(-ssRNA)和紧密包在其外面的蛋白组成，呈紧密的连续性螺旋形式，它充满在由脂蛋白外壳形成的空间内，有30一35个卷曲。每个病毒约有1800个紧密排列的核蛋白。另外两种核衣壳核心的蛋白为大转录酶蛋白或称RNA多聚酶(Polymerase，简称L)和磷蛋白(Phosphoprotein，简称P)。N、P和L三种蛋白总称为核糖核酸蛋白(Ribonueleoprotein，简称RNP)[6]。
2、狂犬病病毒基因组结构
RV基因组为不分节段的单股负链RNA，分子质量约为4.6×106，大小约为12kb，由7个功能区组成，包括3′先导区、5个连续的结构基因和5′非转录区。其中约91％的核苷酸为结构基因，由3′端poly（A）→5’端AACA依次为N、P、M、G、L，其长度分别为1421、991、804或805，1675或2059、2069，和6429 或6384个核苷酸，对应的开放读码框（(Open reading frame ,ORF）大小依次为1353、894、609、1575、6429个核苷酸，分别编码核蛋白（NP）、磷蛋白（PP）、基质蛋白（MP）、糖蛋白（GP）和依赖RNA的RNA多聚酶（LP）。在狂犬病病毒3ˊ端有一段58个核苷酸的先导序列，第59位核苷酸是N基因mRNA5ˊ端的起始位点,第一个开放阅读框架是第71位的ATG起始密码子和第1424位的TAA终止密码子之间延伸,编码病毒的核蛋白,核蛋白基因高度保守又高效表达,可以用于狂犬病毒感染的诊断和调查。各结构基因之间的间隔区核苷酸分别为2、5、5、423nt[7]。其中G－L之间的居间序列为伪基因，在某些类型的病毒中可以转录出第6个mRNA。
3、狂犬病病毒的实验室检测
3.1病毒形态学观察
电镜观察:病毒颗粒呈圆柱体，底部扁平，另一端钝圆,整个病毒粒子的外型呈子弹状，直径75nm，长130~200nm。表面有1072~1900个突起，排列整齐，于负染标本中表现为六边形蜂房状结构。
3.2 组织病理学检测
狂犬病引起的脑炎主要体现在病毒对神经的广泛侵入, 但只局限于细胞损伤
[10狂犬病毒G,N基因的表达]。组织病理学变化为一定程度的脑水肿,不存在其他特异的组织病理学变化。据Jogai S.等[8]报道,Adlochi Negri于1903在狂犬病感染组织内观察到胞浆内嗜酸性包涵体,这些包涵体被命名为Negri小体,因此可通过检测Negri小体来确诊狂犬病。Negri小体大多出现在海马回、大脑皮质锥体细胞和浦肯也氏细胞中,较少出现在丘脑、桥脑、髓质、脊髓和感觉神经节等神经组织中。组织切片及海马回、脑干、小脑新鲜组织涂片经Sllers，苏木精-伊红，Mann或其他物质染色后，可观察到Negri小体的存在。Negri小体是典型的圆形或椭圆形有嗜碱性颗粒的嗜酸性物质[9]。
该方法优缺点：当组织学检查发现有狂犬病特征性病变时,通过检测内基氏小体,能达到简便、快速地确诊。然而从感染病毒的动物标本中检测Negri小体，只有50% ~80%的检出率。因此,镜检Negri小体,虽然快速而且容易操作,但检测方法的敏感度不够。
3.3 生物学检测
3.3.1乳鼠颅内接种分离狂犬病病毒法
此方法最初用于狂犬病的诊断是在1935年[10]。改良后MIT,即小鼠病毒中和试验(MVNT)被广泛用于疫苗接种动物和人的抗体检测[11][12]。依照WHO狂犬病专家委员会推荐[13],荧光抗体实验检测阴性的结果的脑样品必须再次经MIT证实。
狂犬病病毒具有较强的嗜神经性,可采用小鼠颅内接种法分离病毒后,再进行狂犬病特异性抗原的检测。MIT具体操作方法为:采集脑或唾液腺等病料加缓冲盐水研磨成10%乳剂,无菌处理后离心,取上清液脑内接种5~7日龄乳鼠,性别、品种不限，每只0. 03 mL,每份标本接种4~6只。乳鼠在接种后继续由母鼠同窝哺养, 3~4 d后如发现哺乳减少,痉挛,麻痹死亡,即可取脑检查包涵体。如经7 d 仍不发病,可杀死其中2只,剖取鼠脑作成悬液,如上传代。如第二代仍不发病,可再传代。连续盲传三代总计观察4周而仍不发病者,作阴性结果报告。也可应用3周龄以内的幼鼠,如上作脑内接种。可疑动物脑组织或唾液腺组织可用于病毒的分离,从流行病学角度考虑,检查唾液腺中的病毒更为重要,但脑组织的病毒检出率更高。在欧、美等发达国家,小鼠接种试验逐渐被细胞培养所取代,但小鼠接种试验仍然是发展中国家用以确诊狂犬病的重要检测方法。
MIT方法优缺点：小鼠接种试验敏感，准确率高，适于不具备组织培养条件的实验室检测、分离狂犬病病毒,但耗时较长,仅凭动物发病症状不足以确定为狂犬病病毒感染,常常需要配合免疫荧光法（见下文）作特异性鉴定。
3.3.2细胞培养分离技术
20世纪70年代中期以来,各实验室相继用地鼠肾传代细胞(BHK-21)、鸡胚细胞、鼠成神经细胞瘤细胞(NAC1300)、鼠神经瘤细胞(MNa)和其他传代或原代细胞系分离狂犬病病毒街毒。CIT技术逐渐取代了MIT，是因为CIT技术费用较低，敏感、易于操作，与MIT相比所需时间大大缩短，即从MIT的30天缩短到RTCIT 的4天[14]。有研究表明,MNa和NAC1300细胞分离街毒的敏感性并不低于MIT法[15][16]，如果接种物中含有少量的街毒,颅内接种小鼠,仅有50%的分离率,而用CIT 检出达99%,但BHK-21细胞分离街毒的敏感性较MNa和NAC1300细胞低。一般来讲,在细胞培养中,感染狂犬病毒的细胞不出现明显的细胞病变(cytoPathiceffect,cPE),但可在接种3~5天时,通过免疫荧光染色（见下文）来检测狂犬病毒是否存在.当病料样品如唾液、脑脊液中所含病毒量很少时,则需要延长培养时间或进行传代培养[17]。
该方法的优缺点:周期短、敏感、成本低,适合大量样本的检测;但本方法需配合免疫荧光进行特异性诊断,需在具备组织培养条件的实验室中进行;样品严重污染细菌或腐败致使样品中病毒失活,会导致病毒分离失败。
3 .4狂犬病病毒抗原抗体检测
3.4.1 荧光抗体试验
荧光抗体实验(Fluorescent Antibody Test, FAT) 狂犬病病毒感染的细胞内有由狂犬病病毒核衣壳聚集形成的包含体。据Dean DJ.等[18]报道, 荧光抗体试验于1958年开始应用,且在20世纪70年代用作狂犬病诊断的常规方法。目前利用荧光抗体实验对抗原进行检测的方法已经渐渐取代了对包含体的检测，该方法是狂犬病参考实验室诊断最常用、最精确、快速和最可靠的方法[19]。FAT操作方法为:脑或神经组织印片、涂片或冰冻切片,与经过异硫氰酸荧光素标记的狂犬病病毒抗血清或免疫球蛋白相互作用,然后在荧光显微镜下进行检查,狂犬病病毒阳性标本中分布有大量的黄绿色荧光颗粒,呈不同的形状和大小,较大的圆形或椭圆形发出强烈荧光者为Negri小体,沙粒或细小的灰尘荧光粒子及丝状荧光
物
,则为神经元或树突中含有的狂犬病病毒颗粒,荧光颗粒大小范围为0. 24~27Lm。以多克隆抗体为基础建立的FAT,其敏感性及特异性不及MIT,但是,如果利用单克隆抗体,可以增加本方法的特异性,并能区别狂犬病病毒和其他的狂犬病病毒属成员[20][21]。
荧光抗体试验的优缺点：耗时短,整个荧光抗体试验操作仅需30min,若加上涂片、固定,得出结果仅需1~2 h; 敏感性和特异性好;但是需要荧光显微镜、高质量的荧光标记抗体，以及具有良好素养的技术员。
3.4.2免疫组织化学
上个世纪80年代以来,应用各种类型的免疫组织化学方法,在用福尔马林固定病理标本的切片上进行狂犬病毒病毒抗原检测,用以研究狂犬病毒病毒致病机理以及人和动物狂犬病的诊断研究上[22][23][24][25][26][27]
。它是以狂犬病特异性单克隆抗体和多克隆抗体作为一抗(Primary antibodies),以过氧化酶或亲和素-生物素蛋白标记的种属特异性抗体为二抗(secondary antibodies)。研究结果表明, 该方法的敏感度与FAT相同或更高,高于Negri 小体组织学检测方法。其它报道也证明过氧化酶标记的方法能获得更好的检测结果[28]曾经有报道,使用亲和素-生物素复合物(Avidin-biotin complex,ABC))和过氧物酶-抗氧化物酶(Peroxidase-antiperoxidase,PAP)结合操作,这两种方法可迅速增强酶促反应，进一步提高其敏感度。
直接免疫过氧化物酶技术或者ABC和PAP系统的优缺点：可以用福尔马林固定的标本作为检测的材料,并且还有相对简单,对材料的处理容易、风险较小等优点[29]。然而这些方法的操作过程耗时较长，所需的试剂和仪器相对较贵,而且某些试剂有毒或具有致癌性，因而并没有被广泛应用。
3.4.3酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 最初应用于免疫后动物和人血清中抗狂犬病毒抗体的效价滴定,后来经改进也应用于狂犬病抗原检测。可通过检测脑组织中的狂犬病病毒核衣壳做出诊断。该方法1986年由Perrin P建立,其敏感性及特异性与FAT有很好的相关性(96%),灵敏度略低于FAT[30]。本方法通过狂犬病病毒特异性多克隆抗体捕获狂犬病病毒核蛋白,结合ELISA捕获系统可以检测血清1型(PV株),血清3型(Mokola)株,和欧洲蝙蝠
狂犬病毒血清
1型(PV株)。检测狂犬病病毒抗体的 ELISA 法主要有利用酶标记的抗抗体，检测与固相抗原结合的待检抗体为主要原理的间接ELISA。该法的关键在于包被抗原的纯度，一般采用纯化的病毒G蛋白作为包被抗原。鲁晓知等[31]应用间接混合夹心 ELISA（IMEIA）检测人血清中的抗狂犬病病毒抗体；任雅萍等[32]采用抗体捕捉法对传统间接法进行了改进。Cliquet 等[33]建立了定量间接ELISA法检测狂犬病疫苗免疫动物后的血清抗体，该方法以全病毒包被酶联反应板，以辣根过氧化物酶标记金黄葡萄球菌蛋白 A（HRP-SPA）检测抗体。该方法已被 OIE 推荐为体外检测抗狂犬病病毒抗体的标准方法，其优点在于病毒无需纯化，检测抗体不受种属限制，适合人群及野外动物免疫情况的调查。为了克服间接ELISA的缺点，Sugiyama 等[34]建立了一种新的 c-ELISA，该方法以初步纯化的灭活病毒抗原包被酶联反应板，标记抗 N 蛋白单克隆抗体作为竞争示踪。该方法与中和试验（Virus neutralization test，VN）具有较高的一致性，相关系数为 0. 90，可以检测不同种属的动物血清。双抗原夹心 ELISA 是利用酶标记抗原代替间接法中的酶标记二抗，检测的是包括 IgG、IgM 等在内的总抗体，可避免血清中非特异性 IgG 的吸附以及类风湿因子的干扰产生假阳性反应，从方法学的原理上解决了间接法的缺陷。Yang 等[35]于 2006 年首次建立了双抗原夹心检测法（DAS-ELISA）。近年来出现了新型的间接免疫过氧化物酶病毒中和反应测定法（Indirect immunperoxidase virus neutralization，IPVN），Ogawa 等[36]对方法进行了标准化，特异性及敏感性均较高，与现行的国际标准方法检测水平相当，可替代原有方法。
该法的优缺点：适于对腐败的标本进行抗原检测,并且无需昂贵的荧光显微镜,操作简单、重复性好,适合作现场流行病学调查,也可做狂犬病疫苗或狂犬病病毒的鉴别诊断。但是敏感性有所降低,操作过程中要接触到有毒害和致癌作用的试剂。
3.4.4胶体金免疫层析法
胶体金免疫层析法(Gold-immunochromatography Assay, GICA) 胶体金免疫层析法( GICA)是上世纪90年代新发展起来的用于临床样品检测的方法。它是层析法与免疫胶体金技术相结合并且集免疫反应和色谱层析于一体的一种诊断技术
,本方法可以达到对抗原浓缩的作用,灵敏度较高。主要原理为,用胶体金代替酶标记抗狂犬病病毒抗体,吸水纤维上的金-抗狂犬病病毒抗体与样品中狂犬病病毒抗原结合后,沿硝酸纤维素膜迁移,硝酸纤维素膜上用羊抗鼠IgG(对照线)和抗狂犬病病毒单克隆IgG(检测线)划线包被,在包被有抗狂犬病毒单克隆抗体处形成“抗狂犬病病毒抗体-狂犬病病毒-金标抗体”的抗原抗体复合物而出现红色线。2004年,徐葛林等[37]人研制的GICA测试条特异性良好,检测可疑狂犬病犬唾液样品GICA与酶免疫检测(EIA)符合率达88.2%。高明华等[38]采用间接法研制了胶体金检测试纸条用于检测RV抗体；Shiota等[39]用直接法研制了检测人血清中RV抗体的胶体金免疫层析试纸条；范晓娟等[40]采用SPA法制备了检测RV抗体的胶体金试纸条。
该法优缺点：其优点包括特异、快速、便捷、不需专业技术人员操作和贵重仪器设备等，特别适合临床现场检测无需洗涤,大大减少了污染机会;不需要仪器设备,易于操作,适合野外诊断;所需时间短,仅为20分钟;但成本较高。
3.4.5乳胶凝集试验
荧光抗体试验虽是检测狂犬病病毒的标准方法,但对细胞完整性有严格要求,对已遭受破坏的组织或者是不能进行切片的组织，荧光抗体试验并不适合,且在野外情况下,不适用该方法。据Kasempimolpom等[41]报道,乳胶凝集反应能成功的在患病狗的脑和唾液中检测出狂犬病毒抗原。这种方法用从高免马血清中提取的抗狂犬病毒IgG包被乳胶颗粒,来检测患病动物脑和唾液中的病毒。Madhusudana 等[42]报道,通过对狗的已知阳性和阴性脑和唾液样品中病毒抗原的检测,比较LAT和FAT的检测结果,前者敏感性高达95.2%,特异性高达98.7%,阳性符合率为97.6%,阴性符合率为97.4%。经改良后这种方法也能用于中和抗体的检测和滴定，该方法是使用狂犬病毒糖蛋白包被乳胶微球来捕获动物和人血清中的抗体,据报道该方法具有很高的特异性(100％)和敏感性(95.4%)[43]。
该法的优缺点：该试验适应性强，特异性强，但是需制备并纯化马的抗狂犬病高免血清,然后包被乳胶,进而检测动物唾液和脑的狂犬病病毒。
4 狂犬病病毒核酸检测
4.1 原位杂交
原位杂交法（(In situ hybridization,ISH）是指用特定标记的已知序列核
酸为探针，与组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸序列进行精确定量定位的技术。
分子生物学的发展推动了应用原位杂交检测狂犬病病毒RNA的技术发展。病毒的单链RNA可被DNA探针检测,探针可依据病毒基因组RNA、也可依据编码五个病毒结构蛋白的一个mRNA或多个mRNA来设计。根据特异的基因型设计探针可确定福尔马林固定组织中狂犬病病毒的基因型。Jackson等和warner等[44]建立了检测狂犬病病毒特异性RNA的原位杂交法；Praveena PE等[45]建立了原位多聚酶链式反应(in situ PCR)，根据狂犬病毒N基因的保守区域核昔酸序列,制备了用地高辛(digoxigenin)标记的双链核酸探针,来与神经组织细胞和神经纤维中的病毒核酸杂交,当在神经原内和神经纤维上出现兰色斑点时即为阳性信号。
该方法直接以病毒的RNA作为检测对象，敏感快速，但是病毒的RNA容易被RNA酶降解，实验时需采取适当措施加以防止。
4.2反转录聚合酶链式反应
对于腐烂变质待检样品,不能用组织学检查、荧光抗体试验及原位杂交检测,但可采用RT-PCR技术来诊断。该方法对样品的纯度要求低，可以从脑组织、脑脊液、唾液、皮肤及其他组织中扩增出狂犬病病毒特异性核酸序列。还可通过针对每一个基因型设计特异性引物或对RT-PCR产物限制性长度的片断的多态现象的分析。据David D.等[46]报道,利用RT-PCR,可根据不同基因型设计特异性引物,鉴别狂犬病病毒。引物一般选择在N基因,因为狂犬病病毒中该基因最保守，另外,L基因的某些区域同样很保守,也可用于特异性引物设计的靶基因。由于其他方法的局限性或敏感度较低,RT-PCR尤其适用于狂犬病的活体检验。Whitby JE.等[47]将RT-PCR和PCR-ELISA相结合,可区分经典的狂犬病病毒和欧洲蝙蝠狂犬病病毒。该方法采用生物素标记、与扩增产物互补的2个特异探针与地高辛标记的扩增产物混合杂交,固定在微量板上,然后用抗地高辛结合氧化酶的抗体检测。结果显示,该法比Southern杂交敏感100倍,整个步骤可在10 h内完成,具有快速、敏感和简便等优点。
研究表明,半巢式PCR可在36 h内从有狂犬病临床症状的病人唾液和皮肤中检测出经典狂犬病病毒(genotype 1),而荧光抗体试验在相同的样本和脑脊髓液中不能检测到病毒。Heaton PR等[48]用半巢式PCR检测狂犬病病毒,利用
Southern-blot杂交和半巢式PCR成功地筛选了7个狂犬病病毒基因型中的
6个,用一般的PCR方法检出率为93%,而用半巢式PCR的检出率达100%。
该方法的优缺点是：敏感、特异、结果可靠,节省时间,在3h内便可以得出结果,适合用于临床确诊。但是,与所有的PCR检测技术一样,该方法的高度敏感性和特异性是建立在严格的质量控制基础之上的, 对环境要求高，易出现假阳性。
4.3实时荧光定量PCR
随着分子生物学技术的不断进展,荧光实时定量PCR技术自1992年由Higuchi第一次提出后,经过不断发展完善,到目前为止已经非常成熟。国内外应用这一技术已经建立了多种检测RV的荧光定量PCR方法。标记方法也由最初单一的染料法,发展到特异性更高的探针法,如TaqMan、Molecular、Beacon、Fret 等,其中由于TaqMan探针的广泛使用,实时定量PCR的方法也称为TaqMan法。目前, TaqMan探针已被用于病毒定量[49],其结果具有高特异性与高敏感性。
针对我国狂犬病的流行特点，许运斌等[50]针对RV N基因保守序列设计并合成了一套简并引物和TaqMan探针，在优化反应条件的基础上，建立了检测RV 核酸的一步法荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法，他们建立的qRT-PCR与套式RT-PCR的符合率为100％。检测29份新鲜和5份腐败的临床犬脑组织样品，qRT-PCR与套式RT-PCR均检测出12份阳性的新鲜样品和5份阳性的腐败样品。高志强等[51]建立了古典狂犬病病毒荧光RT-PCR检测技术，并应用该技术对宠物医院提供的犬唾液样品进行了检测，结果显示荧光RT-PCR试验结果同病毒分离检测结果均为阴性，没有发现阳性样本，但从采集的流浪犬唾液样品中检出了阳性样本。陆专灵等[52]根据 GenBank 中的狂犬病病毒 M 基因序列，选择保守区域设计引物，通过对 SYBR-GreenⅠ实时荧光 PCR 反应条件进行优化，建立了用于检测狂犬病病毒的 SYBR-GreenⅠ实时荧光 PCR 方法。Crepin P等研究表明，采用常规的RT-PCR方法可从唾液样品或CSF样品中检出狂犬病病毒核酸，而且有时与死后确诊结果符合率达100％[53]。Supaporn W等[54]利用TaqMan 实时定量RT-PCR对非神经样本进行狂犬病病毒RNA检测的特异性为100％。Wakeley P R等[55]建立了TaqMan实时荧光RT-PCR
用于检测狂犬病病毒，结果其灵敏度高于常规的RT-PCR方法，与套式RT-PCR 灵敏度相同。结合TaqMan基因型特异探针的RT-PCR的方法能快速有效鉴别病毒，实时荧光定量RT-PCR检测唾液样品比传统RT-PCR的灵敏度高。
该法是一种敏感、快速、重复性好的高通量检测手段，但是需要昂贵的专业仪器，因此限制了其在基层检测实验室的推广使用。
4.4基因芯片技术
基因芯片技术是在20世纪80年代中期开始出现的，目前已经广泛应用于药物的研究与开发、基因表达谱分析、发现与疾病相关的新基因等诸多方面。其测序原理是杂交测序方法，通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。张伟等[56]在探针反相杂交技术的基础上，融合基因芯片的基本原理、核酸分子碱基互补配对的原则和酶联显色技术的基本原理建立了RV低密度基因芯片。检测160份可疑犬的血的结果表明该方法比ELISA和RT-PCR灵敏度高、特异性强。王振全等[57]在靶基因的上游引物5′端标记了生物素Biotin，提高了杂交特异性和灵敏度。诊断基因芯片由于在每份检测样品中都设置阳性和阴性参照，并通过分子杂交进行确认，有效地克服了PCR易被污染的缺点。
该法还引进计算机分析软件进行分析、确诊，大大降低了在结果判断过程中的主观因素，使各个实验室得到的结果具有可比性，而且诊断基因芯片检测样本量越大，成本越低；不仅快速、准确、敏感，而且可以同时进行多种病毒的检测，使其具有高通量、高度平行性和高速性的特点。
4.5恒温扩增技术
核酸扩增技术是生物医学领域病原体确认的常用检测技术。近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR 技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用。环介导等温扩增技术（LAMP）是日本学者Notmomi等[58]于2000年首先报道的一种新的核酸扩增技术。LAMP技术采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及1种具有链置换活性的DNA 聚合酶，在恒温条件（一般为60℃~65℃左右）下，1h内其扩增效率可达到109~1010个数量级。
已有报道Saitou Y等[59]和Hayman D T等[60]通过使用RT-LAMP法来检测狂犬病病毒。许丹[61]等，针对狂犬病病毒基因?型核蛋白保守区设计4条识别靶序列上6个位点的特异性引物,在链置换聚合酶(Bst酶)作用下,60℃恒温1 h内完成扩增。反应特异性强、灵敏度高。17份临床样本的检测结果显示在狂犬病病毒的检测中,LAMP法和传统PCR法的敏感性一致,阳性检出率均为23.5%。黄元等[62]，针对狂犬病病毒的核衣壳蛋白基因（N基因）和大专录酶蛋白基因（L基因）中的高度保守区段分别设计了一套引物，建立了检测狂犬病病毒的快速一步法反转录-环介导恒温扩增（RT-LAMP）方法。提取总RNA后，加入BstDNA聚合酶及反应成分，于63℃恒温水浴箱中放置60min，80℃5min终止反应，加入荧光染料SYBR GREEN Ι，根据颜色变化肉眼判定结果。结果显示，两套引物对狂犬病病毒RNA进行RT-LAMP检测，均有良好的特异性，灵敏度均比RT-巢式PCR高10倍以上。
区别于传统的PCR方法，属于恒温扩增的LAMP技术不需要昂贵的PCR仪器，具有特异性强、等温灵敏、操作简单、扩增反应时间较短且易于观察结果，利于在基层实验室推广使用等优点，但是其有容易被污染的缺点。因此，如果开发一种拥有可靠、快速、等温灵敏等优点的恒温扩增检测技术，将会有巨大的实际应用前景。
5.总结
从发现狂犬病至今，该病一直被认为是世界上最可怕的人兽共患病之一，在亚、非、拉等发展中国家每年仍有数万人被其夺去宝贵的生命。由于本病可通过暴露后免疫接种来控制,因此对与人暴露相关的动物进行早期病毒检测极为重要。血清学检测方法成本低廉，方便快捷，其中以重组蛋白为诊断抗原的血清学方法是一种发展趋势。以RT-PCR方法为代表的检测病毒核酸的方法，准确方便，但是易出现假阳性且需要昂贵仪器设备。而以LAMP为代表的恒温扩增方法易于推广，不需特殊仪器，具有高的灵敏度、特异性和可靠性，具有广泛的实际应用前景。
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9.流感病毒的快速检测方法
流感病毒的快速检测方法 一、RT-PCR快速诊断方法 （一）生物安全要求 （二）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二、免疫荧光方法检测流感病毒 （一）原理 （二）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四、快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
呼吸道病毒试题
一、名词解释 1.抗原漂移 2.抗原转变； 3. 神经氨酸酶（neuraminidase，NA) 4. 血凝素（hemagglutinin， HA) 二、填空 1.呼吸道病毒包括、、、、、、等。 2.流感病毒根据抗原的不同，可分为、、三型。 3.决定流感病毒亚型的特异性抗原是和。 4.流感病毒的核酸类型是，其显著特点是 5.流感病毒的核心由，和组成。 6.流感病毒的结构由，和组成。其吸附细胞的结构是，成熟病毒自细胞膜上的释放依赖的水解作用。 7.流感病毒的包膜镶嵌着2种糖蛋白刺突，即呈柱状的和呈蘑菇状的。 8.麻疹病毒感染除引起麻疹外，少数患者尚可并发严重中枢神经系统疾病，即 和。 9.腮腺炎病毒除引起患者双侧或单侧腮腺肿大炎症外，20%男性患者并发，5%女性患者并发。 10.孕妇在妊娠5个月内感染风疹病毒后临床表现多为，而其胎儿或新生儿易患综合征。 11.腺病毒为双链线状DNA，无包膜病毒，其蛋白衣壳由240个壳粒和12个壳粒共同构成20面立体对称球状体，并在20面体每一顶角壳粒各伸出一纤维隆起。 12.少年儿童和成人普通感冒及上呼吸道感染大多由或感染引起。 三、单选题 1. 流行性感冒的病原体是 A.流行性感冒杆菌
B.流感病毒 C.副流感病毒 D.呼吸道合胞病毒 E.鼻病毒 2. 普通感冒的最常见病原是 A.流感病毒 B.副流感病毒 C.腺病毒 D.风疹病毒 E.鼻病毒和冠状病毒 3. 可引起全身感染的呼吸道病毒是 A.流感病毒 B.麻疹病毒 C.鼻病毒 D.冠状病毒 E.腮腺炎病毒 4. 麻疹疫苗的接种对象为 A.新生儿 B.二月龄婴儿 C.四月龄婴儿 D.六月龄婴儿 E.八月龄婴儿 5. 亚急性硬化性全脑炎（SSPE)是一种由
狂犬病防治知识培训测试题及答案
狂犬病暴露处置技术培训试题 姓名：单位：分数： 一.填空题（每空1.5分，共30分） 1. 狂犬病是由感染人体引起的一种传染病，发病后病死率达。 2. 狂犬病病毒是一种侵犯中枢神经系统,引起____ 和 ____ 狂犬病的病原体. 3. 人被犬、猫等宿主动物咬、抓伤后，凡不能确定伤人动物为健康动物的，应立即进行受 伤部位的彻底清洗和消毒处理。用或彻底冲洗伤口至少分钟。 彻底冲洗后用涂擦伤口。 4. 狂犬疫苗接种程序为：、、、、天各注射一支狂犬疫苗，成 人、儿童用量。婴幼儿可在大腿前外侧肌肉内注射。禁止注射。对于Ⅲ类暴露及免疫功能低下者Ⅱ类以上的暴露，接种疫苗的同时要在伤口周围浸润注射或。 5. 注射动物源性抗血清前必须严格进行试验。若为阳性，可逐步加量注射，用完全量或改用注射。 二．单选题（每题3分，共30分） 1. 关于狂犬病病毒不正确的描述是（） A. 狂犬病毒为弹状病毒科 B. 狂犬病毒是非嗜神经性病毒 C.不会引起化脓性脑炎 D. 在中枢神经细胞胞浆内形成内基小体(Negri Bodies) E.病毒对外界抵抗力不强,56℃30分钟即可杀灭 2. Ⅲ类暴露及免疫功能低下者Ⅱ类以上的暴露,最正确的处理措施是（） A.注射狂犬病毒免疫血清＋抗病毒药物 B.注射大剂量丙种球蛋白＋抗病毒药物 C.清创＋抗生素 D.清创＋注射狂犬病被动免疫制剂＋接种疫苗 E.清创＋注射狂犬病毒免疫血清 3. 狂犬病标本采集叙述正确的是（） A.从事标本采集和运送的工作人员均要进行暴露前免疫 B.在狂犬病病人入院后，尽可能早期采集标本 C.用于病原学检测的标本，以脑组织阳性率最高 D. A＋B＋C E. B＋C. 4. 狂犬病病毒最不可能感染的动物是（） A.狗 B.猫 C.蝙蝠 D.家禽 5. 发展中国家的狂犬病主要传染源是（） A.狼 B.猫 C.犬 D.患者 6. 狂犬病临床表现有：（）
精选-乙型肝炎病毒抗体诊断(胶体金法SOP)标准操作程序
乙型肝炎病毒抗体诊断（胶体金法SOP） 测定标准操作程序 编写者：宿金涛 日期：2012年3月1日 一. 原理：乙型肝炎病毒表面抗原、表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体检测试剂盒（胶体金法）采用胶体金免疫层析分析技术、将五个诊断意义相关的试剂通过一个包装组合在一起，同时进行乙型肝炎病毒五项标志物的检测，在不影响各自性能的情况下，便于客户的储存和使用。 HBsAg检测试剂采用双抗体夹心法，试剂含有被事先固定于膜上测试区(T)的抗体。 测试时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的胶体金颗粒结合的抗HBsAg抗体反应。然后，混合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，胶体金抗体在层析过程中先于标本中的HBsAg结合，随后家何物会被固定在膜上的抗HBsAg抗体结合，在测试区内（T）会出现一条紫红色带。这条带是HBsAg抗体-HBsAg-HBsAg抗体金标粒子的复合物在膜上结合形成的。如是阴性，则测试区内（T）将没有紫红色带。无论HBsAg是否存在于标本中，一条紫红色带都会出现在指控内（C）。质控区内（C）所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 HBsAb检测试剂双抗原夹心法，试剂含有被事先固定于膜上测试区（T）的乙肝表面抗体。 测试时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的胶体金颗粒结合的HBsAg反应。然后，混合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，胶体金抗体在层析过程中先于标本中的HBsAg结合，随后结合物会被固定在膜上的HBsAg抗体结合，在测试区内(T)会出现一条紫红色条带。这条带是HBsAg-HBsAb-HBsAg金标粒子的复合物在膜上结合形成的。如果阴性，则测试区内(T)将没有紫红色条带。无论HBsAg是否存在于标本中，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 HBeAg检测试剂采用双抗体夹心法，试剂含有被事先固定于膜上测试区（T）的乙肝e抗体。 测试时，标本滴入试剂加样处，标本与预包被的胶体金颗粒结合的HBeAg抗体反应。然后，混合物随之在毛细效应下向上层析。如是阳性，胶体金抗体在层析过程中先于标本中的HBeAg结合，随后结合物会被固定在膜上的HBeAg抗体结合，在测试区内(T)会出现一条紫红色条带。这条带是HBeAg抗体-HBeAg-HBeAg抗体金标粒子的复合物在膜上结合形成的。如果阴性，则测试区内(T)将没有紫红色条带。无论HBeAg抗体是否存在于标本中，一条紫红色条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的紫红色条带是判定是否有足够标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。 HBeAb,HBcAb检测试剂才有竞争抑制法，试剂含有被事先固定于膜上测试区(T)的抗体。
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法 摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。 关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法 狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。 据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。1、狂犬病病毒形态特征 RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白，亦称基质蛋白(Matrix，简称M)，是狂犬病毒的最小结构
含量测定分析方法验证的可接受标准简介
审评四部黄晓龙 摘要：本文介绍了在对含量测定所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接受 标准，以利于判断该分析方法的可行性。 关键词：含量测定分析方法验证可接收标准 在进行质量研究的过程中，一项重要的工作就是要对质量标准中所涉及到的分析方法进行方法学验证，以保证所用的分析方法确实能够用于在研药品的质量控制。为规范对各种分析方法的验证要求，我国已于2005年颁布了分析方法验证的指导原则。该指导原则对需要验证的分析方法及验证的具体指标做了比较详细的阐述。但是文中未涉及各具体指标在验证时的可接受标准，国际上已颁布的指导原则中也未发现相关的要求。另一方面，大多数药品研发单位在进行质量研究时，已逐步认识到分析方法验证的必要性与重要性，大都也在按照指导原则的要求进行分析方法验证，但验证完后却因没有一个明确的可接受标准，而难以判断该分析方法是否符合要求。本文结合国外一些大型药品研发企业在此方面的要求，提出了在对含量测定方法进行验证时的可接受标准，供国内的药品研发单位在进行研究时参考。 1．准确度 该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。 可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的 相对标准差（RSD）应不大于2.0%。 2．线性
线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为： 在80％至120％的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。 可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。 3．精密度 1）重复性 配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。 2）中间精密度 配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。 4．专属性 可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于2.0。以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。 5．检测限 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。 6．定量限 主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%。 7．耐用性 分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变
两种方法检测乙型肝炎病毒五项指标的结果对比
两种方法检测乙型肝炎病毒五项指标的结果 对比 作者：龙青文，何建军，马家驹，何秀琳，肖金平 【关键词】酶联；血清乳胶；定性分析 ［关键词］酶联；血清乳胶；定性分析 乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)、e 抗原(HBsAg)、e抗体(HBeAb)、核心抗体(HBcAb)的检测在许多方面如诊断乙肝判断愈后、筛选献血员、乙肝的流行病学调查、判断人群对乙型肝炎的免疫水平，对食品、保育及饮水管理行业人员定期进行健康体检等起着重要的作用。故选择一种特异、敏感、稳定的实验室检测方法检测乙型肝炎病毒的五项指标显得尤为重要。现将56例检测者血清同时用酶联免疫法和血清乳胶层析法对比检测结果报告如下。 １材料与方法 1.1 标本来源56例受检者中，男29例，女27例，最大年龄72岁，最小年龄29岁，平均年龄46岁；来自健康体检人群15例，其中13例检测具有阳性结果，2例各项指标均为阴性、另41例为门诊检查结果有阳性的患者，均系血清标本。
1．2 方法酶联免疫法用乙型肝炎病毒(HBsAg，HBsAb，HBeAg、HBeAb，HBcAb)诊断试剂盒，由上海华泰生物工程实业有限公司生产，48人份，批号20040503，按说明书操作。乙肝两对半血清/血浆乳胶层析法检测试剂板由ACONLaboratories.Inc.SanDiegoCA92121USA提供，批号200407029，按说明书操作。 1.3 质量控制酶联免疫法每项检测项目均设阴、阳性对照各2孔，每空加入阴性对照(或阳性对照)各1滴，并设有空白对照1孔。乳胶层析法各项检删项目均设质控区(C)。 1.4 检测结果判定标准：酶联免疫法是根据颜色的变化，作定性分析。此法HBsAg、HBsAb、HBeAg呈黄色为阳性反应，无色为阴性反应，阳性对照为黄色，阴性对照为无色。HBeAb、HBcAb无色为阳性，黄色为阴性，阳性对照为无色，阴性对照为黄色。乳胶层析法HBsAG、HBsAb、HBeAg在测试区内(T)出现一条红色条带则是阳性结果，不出现红色条带则为阴性。HBeAb、HBcAb结果则相反，强阳性标本测试区内(T)将没有红色条带，弱阳性标本测试区内(T)将有一条非常弱的红色条带，阴性标本测试区(T)将会出现明显的红色条带。无论相应的待测物质是否存在于标本中，质控区(C)都会出现红色条带。两种检测方法结果对比分析用卡方检验两两比较进行统计学处理。
病毒性传染病快速检测方法的原理及发展趋势 答案
病毒性传染病快速检测方法的原理及发展趋势 人副流感病毒的病原学特征及流行病学规律 1、HPIV的治疗中（）只能在早期使用 B、利巴韦林、干扰素和蛋白酶抑制剂 2、下列有关于HPIV的说法中，错误的是（） E、HPIV已成为能够导致最沉重疾病负担及影响经济的病毒之一 3、HPIV的实验室检测手段有（） A、LLC-MK2（恒河猴肾细胞） 4、有关HPIV的病原学特征说法错误的的是（） B、病毒粒子呈多形性、无包膜，直径约125～250nm 5、下列关于几个亚型的HPIV的季节流行特征的说法中，错误的是（） C、HPIV2的几乎每年均可检出，发病高峰期为春夏季
人呼吸道合胞病毒的病原学特征及流行病学规律 1、下列选项中（）属于HRSV的实验室检测 B、Hep-2细胞单层 2、（）是目前临床上唯一用于治疗HRSV感染的药物 A、利巴韦林 3、下列关于HRSV的临床表现中错误的是（） B、大多数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎 4、HRSV的致病机包括（） E、以上都是 5、HRSV的病原学特征不包括（） B、HRSV病毒粒子呈球形和棒状两种形态，病毒颗粒约120~300 nm 人禽流感病毒及实验室检验技术
1、血凝（HA）试验原理是HA能与人或其它动物多种红细胞表面（）受体结合引起红细胞凝集 B、N－乙酰神经氨酸酶 2、中国流感/人禽流感监测信息系统至少有（）个国家级网络实验室 A、60 3、人禽流感病毒检测接种鸡胚，样本需要在温度33-35℃、湿度40-60%条件下孵育（） A、2-3天 4、以下哪项不属于人禽流感病毒核酸检测方法（） D、鸡胚接种 5、微量血抑（HI）试验应制备相应亚型的（）个血凝单位的抗原 B、8
副流感病毒
副流感病毒 副流感病毒是一种常见的易被忽略的呼吸道感染病原体，主要引起婴幼儿、儿童及免疫抑制人群严重的呼吸道感染。 在成人患者中，副流感病毒感染也可以导致一系列呼吸道疾病，包括上呼吸道感染、慢性疾病的急性加重、肺炎等，临床表现多样，病原学表现与其他常见呼吸道感染表现相似。此外，缺乏血清学的保护，也促使了副流感病毒的反复感染。 副流感病毒的生物学特性 副流感病毒（PIV）是一类具有多形性、有包膜的单股负链 RNA 病毒，属副黏病毒，分为 4 种亚型，PIV-1 和 PIV-3 属于呼吸道病毒属，而 PIV-2 和 PIV-4 属于腮腺炎病毒属。病毒直径 125-250 nm，包膜由脂质和糖蛋白组成。糖蛋白有两种：一种为血球凝集素 - 神经氨酶蛋白（NH），具有红细胞凝集活性和神经氨酶活性；另一种为融合蛋白（F 蛋白），具有促进细胞融合的作用和溶血特性。 发病机制 PIV 所致疾病的发病机制是由病毒复制和宿主免疫应答所介导。高水平的病毒复制可能会引起呼吸道上皮细胞的改变，在 PIV 感染患者中发现了呼吸道上皮细胞周转和黏液细胞增生与粘液分泌增加有关。像其他呼吸道病毒感染一样，宿主免疫反应——天然免疫、抗体反应、T 细胞反应也与其有关。
PIV 最初感染鼻腔假层状粘液气道上皮，而后通过口咽，进入气道。疾病的严重程度也与 PIV 的感染部位有关，轻度感染一般局限于上呼吸道，严重感染 PIV 一般入侵下呼吸道，导致较为强烈的免疫应答。而病毒血症仅仅在免疫功能不全患者中发生。 流行病学 随着时间的推移，四种亚型的发生率都有所不同，但三项回顾性研究都表明 PIV-3 感染是临床最易导致感染的亚型。四种亚型表现出明显的季节性，PIV-1 感染两年一次流行，奇数年的 9-12 月显著增加；而 PIV-3 的爆发出现在每年的 4-6 月。当 PIV-1 未流行的年份，PIV-3 表现活跃，除了春季流行外，在 10-12 月也有发生；与 PIV-3 相似的是，PIV-2 每年发生，但规模较小；PIV-4 较少被分离和检测，故很难得出流行病学数据。 免疫功能不全人群 PIV 感染对造血干细胞移植 (HSCT) 、血液恶性肿瘤 (HM) 、实体器官移植和 HIV 患者造成了巨大的感染负担，也是 HSCT 和HM 患者最常见的死亡原因之一。多项研究表明成人及儿童 HM 和HSCT 患者中 PIV 的感染发生率为 4%（0.2%～30%），移植术后 100 天的 PIV 感染率估计为 3-7%。 成人住院患者 在具有免疫功能的住院患者中，PIV 感染的大部分文献都来自于病例研究或小样本研究。研究显示，PIV 导致 2%～15% 成人急性呼吸系统疾病的入院，与呼吸道合胞病毒和流感病毒一样，是成人
风险测定方法简介
风险测定方法简介 在现代风险测定方法中，最具代表性的是奥特曼于1986年提出的“z”计分法。作为一种综合评价风险的方法，“z”计分法首先挑选出一组决定项目风险大小的最重要的财务和非财务的数据比率，然后根据这些比率在预先显示或预测失败方面所起的作用大小给于不同的加权，最后将这些加权数值进行加总，就得到一个综合风险份数值，将其与临界值对比，就可以知道项目的风险程度。 “z”记分法的计算公式如下： Z=1.2X1+1.4X2+3.3X3+0.6X4+X5 X1=(流动资产—流动负债)/（固定资产+流动资产+投资）=流动资本/总资本 X2=积累储备金/（固定资产+流动资产+投资）=保留收益/总资产 X3=(销售收入—生产成本)/（固定资产+流动资产+投资）=税前利润/总资产 X4=(股票数量*股票价格)/（短期债务值+长期债务值）=市场资本化值/债务帐面价值X5=(销售量*销售价格)/（固定资产+流动资产+投资）=销售收入/总资产 根据对历史数据的统计分析，奥特曼得出一个适用于大范围不同类型的临界风险数值。即Z=3.0。Z的得分值高于3.0的较安全，低于3.0的为高风险。经过对大量失败企业的分析，发现如果Z得分值低于1.8，则该项目即使表面还在运行，实际上已注定失败了。然而，随着时间间隔越长，企业发生变化的可能性越大，“Z”计分法的预测效果越差。一般来说，“Z”计分法在一年时间内的准确率为95%，两年时间内的准确率为83%，3年以上的准确率为48%。 用以上五项指标作为神经网络的输入层指标，从而获得一个综合的风险指标。该指标是否可用上述区间范围来判断企业经营的风险程度或相对用的数值区间作为判断的标准。 公司经营风险的神经网络模型。 图书馆Wind咨询或年报。
乙肝病毒传播途径的分析
乙肝病毒传播途径的分析 摘要 ［摘要］乙肝病毒感染是慢性乙肝发病的最常见原因。据世界卫生组织统计，全球20 亿人感染乙肝病毒，35 000万人慢性感染，每年约有60 万人死于乙肝。为了防治乙肝， 乙肝疫苗和免疫球蛋白现在已被许多国家用于乙肝免疫。这大大降低了乙肝的感染率，同时也降低了肝硬化和肝细胞性肝癌的发生率。但由于宫内感染和免疫失败的存在，这两种方法并不能完全阻断乙肝病毒的传播。了解乙肝的宫内传播机制与免疫失败之间的关系对于预防宫内感染和乙肝的垂直传播具有重大意义，作者即对乙肝的宫内传播机制和免疫失败的关系作一综述。 ［关键词］乙型病毒性肝炎; 宫内感染机制; 免疫预防; 乙肝病毒的垂直传播; 文献综述 Hepatitis B virus infection is the most common cause of chronic hepatitis B. According to the World Health Organization, the world's 2 billion people infected with hepatitis B virus, 350 million people with chronic infection, about 600 thousand people die every year. In order to prevent and treat hepatitis B, hepatitis B vaccine and immunoglobulin are now used in many countries for hepatitis B immunization. This greatly reduces the infection rate of hepatitis B, but also reduces the incidence of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. But because of intrauterine infection and the presence of immune failure, these two methods can not completely block the spread of hepatitis B virus. It is of great significance to understand the relationship between the intrauterine transmission mechanism and the immune failure in the prevention of intrauterine infection and the vertical transmission of hepatitis B virus. 乙肝病毒传播途径的分析
狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究
狂犬病毒PV-2061株的病毒滴度测定方法的研究 发表时间：2018-11-22T13:05:51.323Z 来源：《医药前沿》2018年27期作者：李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者） [导读] 建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品 李爽1 姚宇1 李鹤1 田威2（通讯作者） （1辽宁成大生物股份有限公司辽宁沈阳 110179） （2沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳 110015） 【摘要】目的：建立狂犬病毒PV-2061株病毒滴度的快速、准确的检测方法。方法：取12批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，分别采用蚀斑法、免疫荧光法检测病毒滴度，与小鼠脑内注射法进行比较，验证其检测结果的相关性。另取一批狂犬病毒PV-2061株的病毒样品，用蚀斑法和免疫荧光法重复检测6次，比较两种实验方法的精密性。结果：蚀斑法和免疫荧光法测得的结果与小鼠脑内注射法之间呈正相关性;重复测定同一病毒样品，免疫荧光法的变异系数更低，表明免疫荧光的重复性更好。结论：以细胞法替代小鼠法检测狂犬病毒的毒力是可行的。免疫荧光法检测病毒滴度，快速、准确、精密度好，为狂犬病毒PV-2061株的疫苗的研究奠定了基础。 【关键词】狂犬病病毒；免疫荧光法；蚀斑法 【中图分类号】R373.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）27-0251-02 Determination of virus titer of rabies virus PV-2061 strain Li Shuang 1,Yao Yu 1,Li He 1,Tian Wei 2 (Corresponding author) 1. Liaoning Cheng Da biological Limited by Share Ltd, Shenyang , Liaoning 110179 2. School of life sciences and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Liaoning 110015 【Abstract】Objective To establish a fast and accurate method to detect the titer of the PV-2061 strain of rabies virus. Methods The virus samples of rabies virus PV-2061 strain of 12 batches were measured by plaque assay and immunofluorescence, and compared with the intracerebral injection in mice to verify the correlation of the test results. A sample of rabies virus PV-2061 strain was also repeated for 6 times by plaque assay and immunofluorescence. The accuracy of the two methods was compared. Results The results of plaque assay and immunofluorescence were positively correlated with the intracerebral injection in mice; Repeated determination of the same virus sample showed that the coefficient of variation of immunofluorescence method was lower, indicating that immunofluorescence was more reproducible. Conclusion It is feasible to detect the virulence of rabies virus by cell method instead of mouse method. The detection of virus titer by immunofluorescence is rapid, accurate and precise, which lays the foundation for the research of vaccine against rabies virus PV-2061 strain. 【Key words】Rabies virus; Immunofluorescent assay;Plaque assay 狂犬病，俗称恐水病，是一种由狂犬病病毒感染引起的人兽共患传染病，一旦感染发病，病死率高达100%。狂犬病至今仍无特效的治疗方法，实施疫苗免疫是预防和控制狂犬病发病最有效的措施[1]。在疫苗生产的各项检测指标中，狂犬病毒毒力的测定是至关重要的，其直接关系到疫苗成品的效价和免疫效果。《中华人民共和国药典》三部（2015版）狂犬病毒滴度检测的方法推荐采用小鼠法。但是由于实验动物之间存在个体差异，实验人员操作的熟练程度等诸多因素均会影响实验结果的准确性。细胞法作为病毒滴度测定的一种替代方法，近年来广受国内外学者的青睐，其中蚀斑法、免疫荧光法等都是比较经典的实验方法。 1.材料和方法 1.1 病毒及细胞病毒株 狂犬病毒PV-2061株第18代，由辽宁成大生物股份有限公司提供，原始毒株来源于ATCC。细胞株：幼仓鼠肾细胞（BHK-21）、非洲绿猴肾细胞（Vero）来源于中科院上海细胞库。 1.2 实验动物 昆明系SPF级小鼠，雄性，体重11～13g，来源于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。 1.3 主要试剂 FITC标记的抗狂犬病病毒特异性荧光抗体购自美国Novus Biologicals公司，浓度0.93mg/ml；新生牛血清购自美国Hyclone公司；甲基纤维素购自美国Sigma公司。 1.4 蚀斑法 1.4.1制备单层细胞将BHK-21细胞浓度调整至1×105个/ml，接种6孔细胞培养板，长满单层备用。 1.4.2病毒滴度测定将狂犬病毒样品5倍稀释，然后进行10倍系列稀释，共6个稀释度（1×10-4、5×10-4、1×10-5、5×10-5、1×10-6、5×10-6），接种至已制备好的6孔细胞培养板中，0.4ml/孔，于5%CO2、37℃的培养箱内吸附90min，每隔15min轻摇板一次，然后加入甲基纤维素覆盖液，4ml/孔，于培养箱中培养7d后，弃去覆盖液，加入结晶紫染色液，2ml/孔，室温30min后弃去染色液，用自来水冲洗至流水无色，晾干，细胞培养板孔内蚀斑清晰可见。统计各孔蚀斑数，计算结果，病毒滴度以lgPFU/ml表示。 PFU/ml=（每孔平均蚀斑数×病毒稀释倍数）/每孔接种病毒量 1.5 免疫荧光法 1.5.1制备单层细胞将Vero细胞调整浓度至1×105个/ml，接种96孔细胞培养板中，长满单层后备用。 1.5.2病毒滴度测定用细胞培养液将待测的狂犬病毒样品以10倍系列稀释，共6个稀释度（1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108），接种至制备好的96孔细胞培养板中，100μL/孔，每个稀释度6孔，每块板上设正常细胞对照孔和病毒阳性对照孔，置5% CO2、37℃培养箱中培养2d后，用PBS洗板3次，室温干燥后加入80%冷丙酮，100μL/孔，4℃固定30min后弃丙酮，置室温干燥，然后用100×稀释的荧光抗体进行染色，50μL/孔，置湿盒内37℃温育30min，洗板3次，甘油封闭，荧光显微镜下观察，计数病毒感染细胞的荧光灶数，细胞浆内有绿色特异性荧光颗粒者为阳性。正常细胞对照无特异性荧光，病毒对照阳性者为有效，以Reed-Muench法计算感染性滴度[2]。 1.6 小鼠LD50测定法 将病毒样品进行10倍系列稀释，脑内接种11～13g的小鼠，每个稀释度注射6只，0.03ml/只。连续观察14d，3天后死亡或呈典型发病症状的小鼠均计入死亡数内，计算LD50。
TCD检查方法简介
1、TCD检查方法简介； 2、TCD能进行检查的项目； 3、TCD在脑血管病的临床应用； 4、TCD 在非脑血管病的临床应用；5、我国TCD存在的问题。 2、TCD检查方法简介脉冲多普勒超声探头，通过不同的检测窗口，TCD可以探测到颅底 Willis环的各条动脉及某些分支，包括大脑中动脉-M1全长及M2起始、大脑前动脉-A1、大脑后动脉P1和P2起始、颈内动脉末端、颈内动脉虹吸段、眼动脉、椎动脉颅内段和基底动脉全长。应用4MHz探头，可以探测到颈部的颈总动脉、颈内动脉起始、颈外动脉起始、锁骨下动脉起始、椎动脉起始、椎动脉枕段、枕动脉、滑车上动脉和颞浅动脉。 TCD能检测到颅内外动脉的示意图如图一所示。 3、图一 4、TCD所探测动脉示意图如图二，在每一个探测点所探测到的是一幅幅独立的频谱图，如 图二所示。TCD频谱图中有以下重要参数：血流速度（收缩期血流速度、舒张期血流速度、平均血流速度）、搏动指数、血流方向和频谱的形态。 5、 图二 6、TCD能进行检查的项目通过上述频谱图的参数，TCD可进行很多项目的检查。 7、1、脑动脉狭窄或闭塞的诊断。通过血流速度增快的绝对值、比较各不同动脉血流速度 之间的差以及频谱形态的改变，TCD可以诊断被检动脉是否有狭窄或闭塞。TCD诊断前
循环颅内动脉狭窄有很高的敏感性和特异性，但对于后循环的敏感性和特异性会差很多，对于熟练的操作者，TCD还可以较准确地诊断颈内动脉起始部及锁骨下动脉的狭窄或闭塞。诊断脑供血动脉狭窄或闭塞是TCD常规检查中最主要的目的甚至也可以说是全部目的。 8、2、侧枝代偿的判断TCD可以准确判断颈内动脉重度狭窄或闭塞后Willis环侧枝代偿的 情况。图三为颈内动脉重度狭窄或闭塞后前交通动脉、后交通动脉和眼动脉侧枝开放示意图这三条侧枝TCD都可以根据相应动脉的血流方向、血流速度和压迫颈动脉试验得以判断。 图三颈动脉闭塞后Willis环侧枝开放示意图 TCD还可以准确判断锁骨下动脉盗血是否存在、盗血程度以及盗血通路。图四为左侧锁骨下动脉重度狭窄或闭塞后，左侧椎动脉盗血II期和III期的TCD频谱示意图、盗血通路为RVA-LVA和盗血通路为BA-LVA的示意图。对于锁骨下动脉盗血而言，与DSA比较，TCD完善了盗血程度（从部分到完全盗血）和侧枝通路（VA→VA、BA→VA以及枕动脉→VA）。 图四、锁骨下动脉盗血及TCD频谱示意图 3、脑血流微栓子监测 当血流中的颗粒流经TCD所检测的动脉时，就可以被检测到，表现为在低强度血流背景信号中出现的一个短暂的高强度信号，称之为微栓子信号，如图五所示。对于TCD在大脑中动脉检测到的微栓子信号，该颗粒可以来源于心脏、主动脉弓、同侧颈内动脉以及被检测的大脑中动脉，TCD可以通过不同的方式来识别栓子源，譬如双通道来鉴别来源于心脏与同侧颈内动脉系统的栓子，通过双深度或多深度鉴别同侧颈内动脉或被监测大脑中动脉的栓子，或通过栓子的特性鉴别被检动脉是否为微栓子信号的起源部位。
乙型肝炎病毒检测技术的研究进展
乙型肝炎病毒检测技术的研究进展 吴淑秋 [关键词] 乙型肝炎病毒检测技术 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界范围内严重的公共卫生问题之一,约5%的世界人口现行慢性感染，在我国乙型肝炎是常见的传染病和多发病之一，主要通过血液、血制品、性传播及母婴传播，是引起肝硬化和肝癌的常见病因。我国一般人群中HBsAg阳性率约为10％左右，乙型肝炎其传染性和病死率均居高不下[1]，已经成为现在最为严重的社会公共卫生问题，严重影响着人们的身体健康。所以乙型肝炎病毒的早期、准确、定量检测对乙型肝炎临床诊断、疗效观察及预防具有重要的意义。随着检测技术的不断发展，对乙型肝炎血清标记物的认识也在不断深入和更新。到目前为止, 乙型肝炎病毒病原学检测主要是电子显微镜技术、免疫学技术和分子生物学技术和基因芯片技术, 现将乙型肝炎病毒几种检测技术作一综述。 1电子显微镜技术 电子显微镜技术主要包括常规电镜法(electron micros-copy, EM)和免疫电镜法(immune electron microscopy,IEM)。 1.1 常规电镜法1970年英国学者Dane等在电镜下发现了完整HBV颗粒即Danes颗粒[2],R De V os等随后用电子显微镜观察18例HBsAg阳性的慢性肝炎患者的肝组织,发现了直径约25 nm的核心抗原(HBcAg)颗粒[3]。常规电镜法的优点是标本用量小、制样速度快、观察比较直观,不过因其观察灵敏度较低而要求病毒在标本中大量存在,所以本检测技术在观察HBV方面的应用受到限制。 1.2免疫电镜法免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物,是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。Takashi等[4]对96例HBsAg阳性患者的肝组织进行免疫电镜观察,发现在肝细胞胞浆和胞核中存在HBcAg和HBeAg。胡莲美等[5]在HBV转基因小鼠血清中发现直径约22 nm的球形HBsAg,以及少量直径约42 nm的Danes颗粒。免疫电镜法较常规电镜法的敏感性高,从而可增加HBV的检出率,但该检测技术的样本制备过程较复杂,对操作者的技能要求较高。 2 免疫学技术
流感病毒的实验室检测方法及进展
·１９０·星堕墅墅盘查！！！！生篁！！鲞釜ｉ塑！里！』曼！！丛！！至！坠：！！塑！！！！：！！：堕！：！ 流感病毒的实验室检测方法及进展 李月越陈杭薇李兵 【摘要】流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其在人群中蔓延快，且具有高发病率及致死率的特点。流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，其确诊还有赖于实验室检查。流感病毒的检测技术大致分为４个方面，即病毒分离培养、血清学诊断、现代免疫学诊断及分子生物学诊断。现分别从以上几个方面对流感病毒实验室检测方法及进展进行综述。 【关键词】流感病毒；检测方法 Ｌａｂ帅ｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓ狮ｄｐ哪哪艄０ｆｄ咖ｔｉＩｌｇｉＩＩｆｌｕ眦ａｖｉｎ麟Ｕｙ访ｙ獬，ＣＨＥＮ协咒ｇ－讹ｉ，ＵＢｉ恕ｇ．＆加仃批，ｚｆｏ，尺Ｐｓ加ｍ￡ｏ删Ｍ毒ｄ觑九８，＆巧ｉ挖ｇＣＤｍ凇挖ｄ＆咒８ｍ￡Ｈｏｓｐｉ￡ｎＺｏ，ＰＬＡ，＆巧锄ｇ１００７００，吼ｉ御 （乃ｒｒ已ｓ户Ｄ行矗ｉ７２９口“腩ｏｒ：（ＨＥ小，Ｈ口ｎｇ一议，Ｐｉ 【ＡｂｓｔＩ’ａｃｔ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓｃａｕｓｅａｎａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｔｈａｔｓｐｒｅａｄｓｅｐｉｄｅｍｉｃａｌｌｙｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｏｆＩｎｆｌｕｅｎｚａｉｓｈｉｇｈｍｏｒｂｉｄｉｔｙａｎｄｍｏｒｔａｌｉｔｙ．ＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｄｅｐｅｎｄｓｏｎｎｏｔｏｎｌｙｃｌｉｎｉｃｉａｌｓｙｍｐｔｏｍｓａｎｄｓｉｎｇｓｂｕｔａｌｓｏｌａｂｏｒａｔｏｒｉａＩｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓ．Ｖｉｒａｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｓｅｒｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｉｍｍｕｍｏｌｏ—ｇｉｃａｌａｓｓａｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏＩｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｒｅｆｏｕｒｍｅｔｈｏｄｓｔｈａｔｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｅｄｆｏｒｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉａｌｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｉｎｔｈｅｆ０１ｌｏｗｉｎｇｔｅｘｔ． 【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ 流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急 性呼吸道传染病，传染性强，蔓延快，其抗原易变异， 对人群尤其是儿童、老年人及机体免疫力低下的人 群有较高的发病率及致死率，危害很大。流感病毒 分为甲、乙、丙三型，其中变异大的、危害重的主要是 甲型和乙型流感病毒，尤以甲型为主，常可引起较大 范围的流行［１］。 流感的诊断不仅要根据临床症状和体征，还需 要实验室检测来证实。病毒诊断技术大致分为４个 方面，即病毒分离、血清学诊断、现代免疫学诊断及 分子生物学诊断瞳］。现分别进行介绍。 ｌ病毒分离培养 病毒分离培养是诊断流感最可靠的方法之一。 因流感病毒能够在鸡胚中良好生长，所以早期多用 鸡胚分离流感病毒，一般用９日龄至１１日龄的鸡胚 通过羊膜腔或尿囊腔接种分离病毒，接种后２４～９６ｈ 收集鸡胚尿囊液，２４ｈ内死亡的鸡胚弃掉，用鸡的 红细胞检测尿囊液或细胞培养液的血凝活性来证实 病毒的增殖和存在，如初次分离不到病毒，可盲传２ 代再进行检测；但近年来，随着分子生物学技术的发 展，发现通过鸡胚所分离到的流感病毒，其抗原性与 原始标本有所不同，而通过马一达犬１肾细胞（ＭＤＣＫ） 作者单位；１００７００北京军区总院呼吸内科 通讯作者：陈杭薇．综述． 分离病毒的抗原性与原始标本相似，另外由于 ＭＤｃＫ细胞对“ｏ”相毒株的敏感性比鸡胚高很多， 故ＭＤＣＫ细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一 种宿主系统，现亦得到较为广泛的应用；ＭＤＣＫ分 离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此 病毒分离现同时采用鸡胚及ＭＤＣＫ细胞两套系 统口］。但无论是以上哪种方法对标本中病毒采集、 运输及保存条件要求均较高，病毒样品如能在４８ｈ 分离，可在４℃保存，如果样品要存放较长时间必须 低温冻存（一７０℃）；且要求标本中的病毒含量高， 必须达到鸡胚或ＭＤＣＫ培养法所需要的病毒含量， 分离培养较为复杂、耗时且不稳定，也不能在普通实 验室进行，要确诊需要较长时间，故对流感早期诊断 及临床指导意义不大。 Ｓｈｉｈ等Ｈ３将一种新的实验室培养技术——离 心培养技术（ｓｈｅｌｌｖｉａｌｃｕｌｔｕｒｅ，ＳＶＣ）应用于流感病 毒的培养，其与传统培养方法没有本质的区别，不同 点为在标本接种后进行长时间的低速离心，使标本 中含病毒的颗粒在外力作用下被压挤吸附于培养细 胞，从而大大缩短了培养时间并提高了敏感性。在 国内倪安平等口］亦采用ＳＶＣ技术快速诊断流感病 毒，结果显示该技术能在２４ｈ内获得流感病毒培养 结果，可以快速确诊流感患者。 郭元吉等［６３建立了一种流感快速诊断方法，具 体为：采集标本经成片ＭＤＣＫ细胞扩增，使细胞表万方数据