巫师340突变诱发物获得方法

巫师3-40%突变诱发物获得?法

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几种拟南芥突变体鉴定方法

HY5‐215 The Arabidopsis HY5 gene encodes a bZIP protein that regulates stimulus‐induced development of root and?hypocotyl, Genes Dev. 1997 Nov 15; 11(22): 2983–2995. In the genome of hy5‐215, the splicing acceptor site of the first intron (=G) was replaced by A, suggesting that this mutation causes aberrant RNA processing In hy5‐215, the nucleotide g‐1117 (white letter), which is the last nucleotide in the first intron, is replaced by an a HY5‐215的突变位点与野生型相比，并没有酶切位点的变化。引物在有一个错配位点的情况下，可以产生一个新的酶切位点PsiI，从而将野生型、杂合、纯合进行区分。 Design proper primers and choose proper a enzyme by dCAPS Finder 2.0 (https://www.360docs.net/doc/13127070.html,/dcaps/dcaps.html)

HY5proF GAGAGAATATGCGAGTGAATGAC Len 22 TM 54 HY5proR TCTAAAGTCTCTTTTATGTTTTA T A Len 25 TM 50.8 PsiI: 但是，实验室并没有PsiI ，所以只能再去寻找新的内切酶。在设计的引物有2 个错配位点时，可以产生新的酶切位点，AluI 将野生型切断。 HY5-215 F CGTATCTCCTCATCGCTTTCAATAG Len 25 TM 60.0 HY5-215 R GTCCCGCTCTTTTCCTCTTTATC Len 23 TM 60.8 AluI:

线虫的EMS诱变和突变体筛选2015

线虫的EMS诱变和突变体筛选摘要：秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种被广泛研究的模式生物，其性状容易辨别，突变型多且容易获得。本实验用EMS诱变剂对同步化后的N2型怀卵成虫线虫进行不定向诱变，筛选出一系列的突变体，再通过对亲代突变体的子代进行进一步的筛选，筛选出F1、F2、F3突变体，最后获得性状稳定的、能够稳定遗传的突变体，可以将突变体至于-80℃保存。本次试验涉及到的生物技术有：无菌操作技术，同步化技术，EMS诱变技术，显微操作技术等。将获得的突变体与野生型作对比，可以在显微镜下观察到性状明显的突变体，将突变体转移、传代、保留，最后获得稳定的突变体。关键词：秀丽隐杆线虫同步化EMS诱变无菌操作技术突变体 1.引言秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）是一种以细菌为食，居住在土壤中，无毒无害、可以独立生存的线虫。它有如下几个特点：①其个体小，成体仅1mm长，雌雄同体全身共有959个细胞，雄性线虫全身共有1031个体细胞；②为雌雄同体：雄性个体仅占群体的0.2%，可自体受精或双性生殖；③染色体组简单：只有5对常染色体和1对性染色体；④基因组便于研究：基因组大小仅为100Mb，并且内含子少，基因密度高；⑤生活周期短且随温度变化：线虫整个的生命周期仅3天（25℃）。野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。温度越高，生活周期越短；⑥有大量突变株；⑦繁殖能力强：成虫一生可产300个受精卵；⑧易于保存：可以用-80℃冰箱长期保存线虫作为模式生物，与酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠和拟南芥等一起，为生命科学的发展做出了极大的贡献。它与其他模式生物相比，有自身优势，如：①它只有消化系统和呼吸系统，并且肉眼可见，容易研究；②它是目前最适合大规模药物筛选的多细胞动物，③它的研究成本低：既提供了一个完整动物实验系统，又避免了小鼠模型的高价费时等。但也有其缺点，如：①线虫的神经元细胞对RNAi不敏感；②线虫没有心脏、获得性免疫系统、呼吸系统等，所以一些人类疾病无法在线虫中模拟；③鉴于线虫与人类种间距离太远，线虫的作用仍是在药物研发初期，快速粗筛，提供线索，需要再经过哺乳动物模型的“细筛”。基于线虫的自身体积小并且结构简单的优势，国内外众多的科研机构都在以线虫作为研究材料，在RNAi、衰老、药物筛选、功能基因组学等领域进行研究。研究发现，线虫中大约有35%的基因是在人体中具有等同作用，并且有大量人类遗传疾病同源基因，只有大约58%是线虫特有的，所以，从理论上讲, 只要人类疾病的靶蛋白或调控途径是物种间保守的, 就可能利用模式生物来进行研究。目前，已经有许多成功的线虫病理模型，如：溶酶体病，阿尔茨海默症(Alzheimer’s, AD)，多囊肾病(polycystic kidney disease)，Duchenne 肌营养不良症，过氧化物体生物合成缺陷等。甲基磺酸乙酯，简称EMS，是一种重要的致癌物之一，生物学上可以用来创建突变体库。本实验就是将EMS作为诱变剂来获得线虫的突变体。线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上。这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。此外，线虫还有许多组织特异性标记的品系，如在线虫中负责协调前后运动的D型运动神经元。我们通过对排卵时期的线虫进行诱变，观察诱变后线虫突变体表形，对突变体后代进行筛选，探究影响突变型基因的显隐性，

科创-突变体鉴定

项目编号东北农业大学大学生科技创新基金申请书项目名称：拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540 的突变体鉴定项目主持人：李松所在学院：生命科学学院研究起止时间：2008年11月1日至2009年11月1日东北农业大学教务处制

项目名称拟南芥AtbZIP1转录因子基因At5g49540 的突变体鉴定研究起止时间2008.11~2009.11 申请金额1000元项目主持人姓名李松学号A09060068所在学院生命科学学院所学专业生物技术学生类别二年级年级班级生物技术指导教师（1）姓名才华职称讲师所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程指导教师（2）姓名纪巍职称助教所在学院生命科学学院研究领域植物基因工程项目组成员姓名刘维学号A0960072 专业班级生技062 姓名肖松学号A09060086 专业班级生技062 姓名王鹏姬学号A09060080 专业班级生技062 姓名卢清瑶学号A09060073 专业班级生技062

一、项研究的目的意义、国内外研究概况、主要创新之处 1．研究的目的意义基因功能的主要研究方法包括：(1)克隆相关基因，进行异体超表达研究(Meyer 等2000，2004；Schulze等2003); (2)利用T-DNA插入突变技术，获得目的基因敲出突变体(Bouche 和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)，再通过筛选出的纯合突变体，研究目的基因的功能(Meyer等2004)。与前者相比，后者具有许多优势(Meyer 等2004)，已成为反向遗传学研究的主要手段(Bouche和Bouchez 2001；Parinov和Sundaresan 2000)。 bZIP类转录因子普遍存在于动植物及微生物中，是植物中一类很大的转录因子家族，在拟南芥中就有75个家族成员，在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中起到重要的作用。本研究利用已购买的拟南芥AtbZIP1基因的突变体作为实验材料，利用“三引物法”在DNA水平上对突变体进行插入纯合鉴定；在此基础上，对插入纯合的突变体，提取其RNA并进行RT-PCR，在RNA水平上鉴定T-DNA插入是否抑制了AtbZIP1基因的表达，最终获得不表达AtbZIP1基因的拟南芥突变体。本研究可为利用突变体进行功能互补研究AtbZIP1基因的功能提供突变体材料，进而为研究AtbZIP1转录因子在植物生长发育以及抗逆境胁迫的过程中所起的作用奠定基础。 2．国内外研究概况 1)突变体鉴定的方法的研究现状反向遗传学研究的首要条件是获得大量基因敲除突变体，建立一套快速、可靠的T-DNA插入突变体鉴定方法对其进行鉴定很重要。目前，鉴定方法主要有2种(https://www.360docs.net/doc/13127070.html,/tdnaprimers.html): “三引物法”和“双引物法”。 “三引物法”的原理如图1 所示，即采用三引物(LP、RP、LB)进行PCR 扩增。野生型植株(wild type, WT)目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入，所以其PCR 产物仅有1 种，分子量即从LP到RP的大小; 纯合突变体植株(homozygous lines, HM)目的基因的两条染色体上均发生T-DNA 插入，而T-DNA 本身的长度约为17 kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP (或RP)为引物进行扩增的产物，分子量即从LP 或RP 到T-DNA 插入位点的片段的长度再加上从LB 到T-DNA载体左边界的片段的长度;杂合突变体植株(heterozygous lines, HZ)只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA 插入，所以PCR 扩增后可同时得到

利用不同理化条件诱变获得果蝇突变体的研究

利用不同理化条件诱变获得果蝇突变体的研究赵颖，马志红，赵航渊，马雅钦，李承贤，赵宝存，齐志广（河北师范大学生命科学学院，河北石家庄050024）摘要：以野生型黑腹果蝇和白眼突变体为材料，采用紫外线、热激和EMS的方法分别在幼虫、蛹、成虫等发育阶段进行诱变处理，结果表明，紫外线照射白眼果蝇的蛹2h，可使羽化当代出现无翅果蝇，其子二代可出现纯合致死的残翅突变型和可遗传的双焦翅突变型；而紫外线照射成蝇虽使果蝇有突变体出现，但突变体要么死亡要么其后代性状恢复正常。热激白眼果蝇幼虫2h可引起遗传突变，并能得到稳定遗传的突变体，4h、8h可引起不能稳定遗传的突变；热激果蝇蛹和成蝇也能引起遗传突变。用含0.5%EMS的培养基培养对果蝇雌蝇的卵细胞影响较大，其后代的突变体较多，而对雄蝇的精子影响则相对较小，后代几乎没有突变体出现。关键词：果蝇紫外线热激EMS 突变体 The research of fruit flies’ mutants which are produced by different physical and chemical methods ZHAO Ying，MA Zhihong，ZHAO Hangyuan，MA Yaqin，LI Chengxian，ZHAO Baocun，QI Zhiguang (College of Life Science,Hebei Normal University,Hebei Shijiazhuang 050024,China) Abstract: Taking the wild black abdomen fruit flies and the mutants with white eyes as materials, we carried on c- oercion processing separately in fruit flies’ developmental stages as larva, cocoon and prosopons using the ultravi- olet ray, high temperature and the EMS methods. The result indicated that the fruit flies with white eyes after ultra- violet ray shone their cocoons by 2h would turn into the fruit flies without wings, their second filial generation wo- uld be dead if they had the homozygosis of crippled wings or would be the mutants with double burnt wings that m- ay inherit. In despite of it have the mutants to appear after ultraviolet radiation shone prosopons, but the mutan- ts either died or their generation’s character restore d normal. The larva of fruit flies with white eyes by processed 2h in high temperature were possible to cause the mutants that may inherit, but it can’t cause the mutants that may inherit by processed 4h or 8h;The cocoons and prosopons of fruit flies by processed in high temperature were also possible to cause the mutants that may inherit. The female fruit flies' egg cells were more affected than the male's sperms after they ate the culture medium included the 0.5%EMS,and the female’s generation had more mutants. But relatively it is small to the male's sperm influence, the descendant did not have the mutant to appear nearly. Key words: fruit flies the ultraviolet ray processed in high temperature EMS mutant 果蝇作为模式动物具有繁殖周期短，易于培养，染色体数目少，其细胞与动物细胞具有一致性等特点，深受科研工作者钟爱。近几年涉及果蝇的研究进展很多，主要涉及到果蝇的中枢神经元离子通道的基因的电生理学、果蝇的基因组研究、果蝇的脑机制研究、免疫果蝇心脏基因功能鉴定等许多方面。【1-6】这些工作对人类的神经退行性疾病、X染色体易碎症、线粒体疾病、血液、失眠和心脏发育和心脏病研究有重要意义。例如研究人员发现果蝇的一种基因PVR有助于发育中的血细胞的生存，此基因与哺乳动物细胞中相应的基因家族比较显示出惊人的保守性。科学家们诱导分离出一种PVR缺失的突变果蝇，并经进一步研究证实剔除PVR的功能会增加果蝇血细胞系中细胞的死亡率。果蝇和脊椎动物中的血细胞生成机制具相似性，这为白血病的研究提供了有利的条件，使得果蝇可作为一个用于研究血细胞生成的简单遗传模式系统。又如威斯康星州大学医学院

拟南芥突变体购买流程-完全图解

最近要购买一批拟南芥突变体，想请教有经验的虫友购买拟南芥突变体的具体流程，例如我需要一个APETALA1的突变体，应到哪个网站进行搜索，怎样进行选择订购，越具体越好，有截图就更好了，谢谢大家了！ Step 1. 打开NCBI主页：https://www.360docs.net/doc/13127070.html,/ 打开的页面如下：如下得到如下页面：

进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图：记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因接下来开始查找APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。。。。。。但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法它的搜索界面一目了然,使用也很方便。下面介绍SALK突变体库的使用方法： Step 2：打开SALK主页：https://www.360docs.net/doc/13127070.html,/ 点击T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：

显示如下，所有信息全在如下窗口中从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向) 点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：

《巫师3：狂猎》突变系统的解锁方法以及该任务全流程攻略

《巫师3：狂猎》突变系统的解锁方法以及该任务全流程攻略今天小编给大家带来的是《巫师3：狂猎》突变系统的解锁方法以及该任务全流程攻略，一起来看看吧! 在陶森特有一处路标名为奶奶的家，在路标附近的公告栏处，叶奈法会给白狼寄信，然后开启一个名为“面对改变”的支线任务。任务的第一步，白狼会来到城市墓园寻找莫吕的墓碑，任务点周围全是墓碑，所以需要玩家挨个挨个的看，具体位置在一颗大树的正下方。找到墓碑后，白狼利用自己的感官能力来寻找关于莫吕教授实验室地点的线索。

随后任务需要叶奈法之前给你的地图来寻找确切地点，地图在背包中打开即可进行下一步任务。更多相关资讯请关注：巫师3：狂猎专题找到地点后，下一步就是跟随地图来到九之谷的水下遗迹。这个入口很好找，来到任务地点，到水底一眼就会发现。

洞内的路不算很复杂，所以在这里也不做过多介绍。来到遗迹深处，白狼只能通过石门才能继续探索，于是在我们利用感官能力时白狼会说出：通过弓弩来射击四块石头就能打开石门。在距离地面最近的三块石头都可以通过阿尔德之印来敲击，悬挂在空中的第四块石头直接对准扔炸弹就好了。随后便来到传送门的房间，进入房间会有一头石像鬼复活，将其击杀后把掉落的道具放在祭坛上，便会启动房间的传送门。第一个传送门是雕像正对面，然后自己爬到三楼，跟随地图的指示进入相对应的传送门就来到莫吕教授的实验室。

在实验室用找到两颗水晶(很好找)，听完教授的故事后，因为需要突变的巨型蜈蚣蛋白才能启动机器，巨型蜈蚣蛋白不是从蜈蚣怪身上掉落，需要往洞穴深处走，在蜈蚣卵上采集。任务条件完成，最后就是白狼脱光衣服用自己来实验诱发突变。

突变体构建

突变体构建 1.定点突变：快速，高效，简便设计原理：引物与模板链退火，pfu DNA聚合酶合成突变链。DpnⅠ酶体外降解非突变型质粒模板（甲基化质粒模板）设计引物：引物包含5’端重叠区和3’端延伸区。引物长度：除突变点之外，两条引物的长度大约为30个核苷酸，5’端重叠区包含15-20个碱基，3’端延伸区包含至少10个碱基。突变引物：突变点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区；反向突变引物5’端。退火温度的计算不包括突变碱基。如图： 5’’3’-TACTGGTACTAATGCGGTTCGCGC G 延伸区重叠区 2.嵌合型突变体的构建：将一个基因与另一个基因，互换构建嵌合型突变变体，可以通过overlapping PCR的方法获得。 ●原理：比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。 A的序列为5-atgcatgctagctagaacgct acgctgactaccccctgatc-3， B的序列为5-atgctagtagctagcccccc cc aggggataattttttaaaacg-3。 ●首先我们要设计引物，假设引物的序列为： A1:5-atgcatgctagctagaacgct-3 A2:5-ggggggctagctactagcat gatcagggggtagtcagcgt-3 B1:5-acgctgactaccccctgatc atgctagtagctagcccccc-3 B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3 （设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。） ●步骤：（1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因（2）回收A，B基因（3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。

PCR突变技术方法概览

PCR突变技术方法概览 1基于PCR 的体外诱变技术定点突变的方法很多，而基于PCR 的定点突变技术由于其突变效率高，操作简单，耗时短，成本低廉等优点而倍受瞩目。近十年来，基于PCR 的定点突变技术获得了长足的发展，目前运用此技术已能实现各种类型的基因突变。基因突变实验包括以下几个步骤:1目的基因全序列变异文库的构建;2利用高通量表达筛选载体从变异文库中筛选表达突变体;3表达突变体的鉴定和表达研究。 1.1 重叠延伸PCR（over-lap extension PCR OE-PCR）这种方法运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型的限制，利用OE-PCR不仅能实现基因点突变，还能便利地实现大片段的插入及删除及插入。其基本原理如图（1）所示。首先设计两个PCR 反应以产生两个含突变位点的DNA 片段，随后将上述两个PCR 产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互引物延伸得到完整的含突变的基因，对第一次PCR 产物进行纯化处理可显著提高突变效率。 OE-PCR 不足之处在于：○1一个突变需要两对引物，3次PCR，并且需对中间产物进行纯化。相对而言步骤较烦琐，不经济；○2由于DNA 二级结构及互补链的竞争等因素的影响，有时两个中间产物难于有效地相互结合导致目的产物得率很低；○3当利用Taq 聚合酶进行PCR 反应时，经常在PCR 产物末端加上腺苷酸，这一多余的腺苷酸一方面导致两个中间产物难于有效地相互结合，另一方面可能会插入基因中导致产生非预期的移码突变。针对这些不足，后来许多学者对OE-PCR 进行了改进。1997年，Urben等提出一步重叠延伸PCR 法（one-step overlap extension PCR），使得三个PCR 反应得以在一个试管里进行，并且省略了烦琐的中间产物纯化过程。其原理是首先将待突变的DNA 以相反的方向克隆到两个载体中，这两个载体除了多克隆位点相反外其余均相同（例如pUC18,19）。这样便得到两个模板。将这两个模板，两个突变引物及一个与载体互补的通用引物置于一个试管中进行一次PCR 反应即可得到含突变的目的基因。1997年，Warrens等利用不对称PCR 反应产生单链中间产物，消除了互补链的竞争性影响，显著提高了目的产物的得率。1990年,Horton等用T4DNA聚合酶处理中间产物，降低了移码突变的发生率。由于OE-PCR几乎没有任何特殊条件的限制，而且成功率很高，因此运用非常广泛。

拟南芥突变体购买流程-完全图解

Step 1. 打开NCBI主页：打开的页面如下：如下得到如下页面：进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图：

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我们主要是从 ABRC 订购，点击进入页面，填写要求的相关信息，万事大吉。祝实验顺利！

基因定点突变方法及其应用

基因定点突变方法及其应用摘要：本文综述了基因定点突变的三种方法，在此基础上的一些改进方法及其应用，并对这三种方法进行了比较。关键词：定点突变；寡核苷酸引物；PCR；盒式突变 Methods of Site-directed Mutagenesis and Their Application Abstract: In the paper，methods of site-directed mutagenesis，some advanced methods on the basic methods and their application are present. At the same time，the comparison are made . Key words: site-directed mutagenesis；oligonucleotide；PCR；cassette mutagenesis 定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变牢高、简单易行、重复性好的特点；除用于改变核苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能的关系之外，还能够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明正常状态下基因的调控机理、疾病的病因和机理。随着分子生物学研究的突飞猛进，基因定点突变技术成为一项重要的分子生物学实验技术手段，在生物和医学领域中的应用非常广泛。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变等[1]。 1常用定点突变方法 1.1核苷酸引物介导的定点突变其原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。主要的过程(见图1)：①将待突变基因克隆到突变载体上；②制备含突变基因的单链模板；③引物与模板退火5’端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA，④合成突变链：在DNA聚合酶的催化