利用不同理化条件诱变获得果蝇突变体的研究

利用不同理化条件诱变获得果蝇突变体的研究赵颖，马志红，赵航渊，马雅钦，李承贤，赵宝存，齐志广

（河北师范大学生命科学学院，河北石家庄050024）

摘要：以野生型黑腹果蝇和白眼突变体为材料，采用紫外线、热激和EMS的方法分别在幼虫、蛹、成虫等发育阶段进行诱变处理，结果表明，紫外线照射白眼果蝇的蛹2h，可使羽化当代出现无翅果蝇，其子二代可出现纯合致死的残翅突变型和可遗传的双焦翅突变型；而紫外线照射成蝇虽使果蝇有突变体出现，但突变体要么死亡要么其后代性状恢复正常。热激白眼果蝇幼虫2h可引起遗传突变，并能得到稳定遗传的突变体，4h、8h可引起不能稳定遗传的突变；热激果蝇蛹和成蝇也能引起遗传突变。用含0.5%EMS的培养基培养对果蝇雌蝇的卵细胞影响较大，其后代的突变体较多，而对雄蝇的精子影响则相对较小，后代几乎没有突变体出现。

关键词：果蝇紫外线热激EMS 突变体

The research of fruit flies’ mutants which are produced by different physical and chemical methods ZHAO Ying，MA Zhihong，ZHAO Hangyuan，MA Yaqin，LI Chengxian，ZHAO Baocun，QI Zhiguang (College of Life Science,Hebei Normal University,Hebei Shijiazhuang 050024,China) Abstract: Taking the wild black abdomen fruit flies and the mutants with white eyes as materials, we carried on c- oercion processing separately in fruit flies’ developmental stages as larva, cocoon and prosopons using the ultravi- olet ray, high temperature and the EMS methods. The result indicated that the fruit flies with white eyes after ultra- violet ray shone their cocoons by 2h would turn into the fruit flies without wings, their second filial generation wo- uld be dead if they had the homozygosis of crippled wings or would be the mutants with double burnt wings that m- ay inherit. In despite of it have the mutants to appear after ultraviolet radiation shone prosopons, but the mutan- ts either died or their generation’s character restore d normal. The larva of fruit flies with white eyes by processed 2h in high temperature were possible to cause the mutants that may inherit, but it can’t cause the mutants that may inherit by processed 4h or 8h;The cocoons and prosopons of fruit flies by processed in high temperature were also possible to cause the mutants that may inherit. The female fruit flies' egg cells were more affected than the male's sperms after they ate the culture medium included the 0.5%EMS,and the female’s generation had more mutants. But relatively it is small to the male's sperm influence, the descendant did not have the mutant to appear nearly. Key words: fruit flies the ultraviolet ray processed in high temperature EMS mutant

果蝇作为模式动物具有繁殖周期短，易于培养，染色体数目少，其细胞与动物细胞具有一致性等特点，深受科研工作者钟爱。近几年涉及果蝇的研究进展很多，主要涉及到果蝇的中枢神经元离子通道的基因的电生理学、果蝇的基因组研究、果蝇的脑机制研究、免疫果蝇心脏基因功能鉴定等许多方面。【1-6】这些工作对人类的神经退行性疾病、X染色体易碎症、线粒体疾病、血液、失眠和心脏发育和心脏病研究有重要意义。例如研究人员发现果蝇的一种基因PVR有助于发育中的血细胞的生存，此基因与哺乳动物细胞中相应的基因家族比较显示出惊人的保守性。科学家们诱导分离出一种PVR缺失的突变果蝇，并经进一步研究证实剔除PVR的功能会增加果蝇血细胞系中细胞的死亡率。果蝇和脊椎动物中的血细胞生成机制具相似性，这为白血病的研究提供了有利的条件，使得果蝇可作为一个用于研究血细胞生成的简单遗传模式系统。又如威斯康星州大学医学院

研究人员确定出一个单个的能够强烈影响果蝇睡眠时间的基因突变即果蝇基Shaker，此基因制造出一种控制钾进入细胞的离子通道。最近的一些研究表明钾离子通道还与人类睡眠的产生有关。这些发现指出了治疗睡眠失调的的一个新颖的途径。还有果蝇研究中发现控制线粒体移动的基因，研究人员通过诱导果蝇的一种突变确定出一种特殊的基因控制着线粒体的运动，影响对神经细胞的供能，这些发现可能对分析线粒体运输缺陷的神经生物学研究人员有重要的利用价值

等等。由此可见，诱变并获得果蝇突变体，对研究人类的疾病等方面是十分必要的。

在遗传学发展的进程中，突变体对于研究基因的功能有非常重要的作用。而获得突变体的主要方法就是理化诱变，包括热激，射线照射，化学物质诱变等等。

为了获得更多的突变体进行功能研究，本实验用紫外线、热激和EMS诱变的方法对野生型和白眼果蝇的不同发育阶段进行诱变处理，统计突变率，筛选与果蝇发育相关的稳定遗传的突变体，为今后研究果蝇发育的分子机制奠定基础。

1 实验材料和方法1.1 材料

动物材料：黑腹果蝇野生型（+）和白眼突变体（w）,由河北师范大学生物学实验示范中心提供。

试剂：琼脂粉、玉米面、红糖、丙酸、酵母、乙醚、EMS(购自上海生物工程有限公司)、Na2S2O3、蒸馏水、蔗糖、NaCl等等。

实验仪器：超净工作台、光照培养箱、广口瓶、棉塞、签字笔、量筒、移液器、枪头、酒精灯、电磁炉、温度计、玻璃棒、10ml注射器、烧杯、体视镜、数码相机、通风橱、EP管、EP管盒、报纸、镊子、毛笔、解剖针、三角瓶、培养皿、高压灭菌锅、分析天平等等。

1.2 方法

1.2.1 果蝇培养基的制备

普通培养基的配方：每升水溶液中加入琼脂8.5g，玉米面85g，红糖65g，丙酸5ml，活酵母7.5g【6】。

含0.5%EMS培养基：配制普通培养基200ml（只含7g红糖），用无菌水溶解6g蔗糖和1ml的97%的EMS，在50℃左右加入到培养基中，搅匀，分装到广口瓶中备用。

1.2.2 紫外线处理蛹和成蝇[7]

分别收集处于同一发育时期的蛹（蛹的颜色为黄色）或未配对的成蝇，将蛹分别置于已灭菌且放有潮湿滤纸片的小烧杯中，分别进行2h，4h和8h紫外线照射，照射完成后继续培养，待果蝇羽化后将其转移到新的培养基中观察当代以及其后代的突变情况；收集羽化12h 内的成蝇并将雌雄分开，分别放到小烧杯中（纱布封口），紫外灯下分别照射2h、4h和8h，然后将雌蝇与雄蝇混合转接到新的培养基中培养，观察当代以及其后代的突变情况。每组实验设计三个重复。

1.2.3 热激处理幼虫、蛹和成蝇

以含大量三龄幼虫和即将羽化的蛹（蛹的颜色为黑褐色）的整瓶果蝇作为材料，放到30℃培养箱中处理，时间为2h、4h和8h，处理的第二天收集并转接由蛹羽化出的成蝇，热激处理的第九天收集并转接由幼虫羽化出的成蝇，在25℃下继续培养；同时分别收集同一天羽化的雌蝇和雄蝇，进行30℃热激处理，时间为2h、4h和8h，处理完毕，将其置于在25℃下培养，观察当代以及其后代的突变情况。每组实验设计三个重复。

1.2.4 EMS 处理成蝇[8]

分别收集同一批羽化的处女蝇和雄蝇，并分成三组，转接到含0.5%的EMS 的培养基中。在黑暗条件下处理时间分别为2h 、4h 和8h 。处理后将果蝇分别转接到新的普通培养基中，并将处理过的果蝇与正常果蝇杂交培养，观察后代的表型。 2 结果与分析

2.1 紫外线处理果蝇蛹、成蝇

用紫外线照射野生型和白眼型果蝇的蛹和成蝇之后，不同的照射时间得到了不同的突变情况和生活力情况，具体结果如下：

紫外线处理果蝇的蛹

果蝇经紫外线直接照射之后得到的突变体主要为：

a 白眼果蝇经2h 紫外线处理得到的雌性无翅果蝇M 0，将其与正常果蝇杂交后得到的M 1代，再兄妹交得到的M 2中出现大量雄性残翅突变体（图1），推测可能发生了X 染色体突变，但由于其生活力太低，没能得到后代就全部死亡。

b 白眼果蝇经2h 紫外线处理得到的雄性无翅果蝇按照上述杂交方法处理后，得到的M 2代中出现了大量双焦翅果蝇（图2），将其兄妹交之后得到大量的残翅和小翅突变体（不能飞）（图3），并且这种突变体能稳定的遗传下去，具体遗传方式还不清楚，需进一步进行探究；

紫外线处理果蝇的成蝇

紫外线照射果蝇成蝇2h 、4h 得到的果蝇中出现了极少量的突变体（M 0），但突变性状不是很明显，且将其与正常果蝇杂交保种得到的M 2和M 3代均没有再出现突变体；照射8h 后的成蝇生活力明显下降，其行动极其缓慢，不能飞行，甚至只能趴在培养基表面，不久即死亡，且不能产生后代，说明长时间的紫外线照射对果蝇的影响很大。

2.2 热激处理果蝇的幼虫、蛹和成蝇

用30℃热激处理不同发育阶段的果蝇后能使其发生类似的突变类型，但突变体基本全是由白眼突变体突变而来的，推测野生型果蝇的幼虫的耐高温能力比白眼突变型强。

热激处理果蝇幼虫

热激处理白眼突变体果蝇幼虫得到的突变体主要情况如下：

a 热激幼虫2h 后得到的成蝇（M 0）全部表现正常，其兄妹交所得M 1中的突变类型有较大量的双翅焦状（如图6

b 上不两图）、左翅不展(如图6

c 左)、双翅尖不展（如图6

d ），相同性状的M 1兄妹交后得到M 2代不出现性状分离，可以稳定遗传。

b 热激幼虫4h 和8h 后得到的成蝇（M 0）全部表现正常，其兄妹交所得M 1中的突变类型有较大量的双翅焦状（如图6a ）、双翅窄小（如图6b 下两图）

、右翅不图1键入图2键入图3键入

展（如图6e ）、左翅不展（如图6c 右）等性状，且将其进行逐代兄妹交后到的M 3代个体有全部恢复为正常的白眼类型，不能稳定遗传。

由以上结果可知，白眼突变体较野生型果蝇热激处理后更易发生突变，究其原因，可能是野生型果蝇生命力比白眼突变体果蝇要强，自身具有很强抵抗力。在不良环境下，可以保持自身基因正常，即不发生突变或发生较小的突变【9】。2h 的热激可能容易导致白眼果蝇的少数基因或者一对基因发生改变，因而使突变体能够稳定遗传。而4h 和8h 热激可能就会使白眼果蝇基因突变位点增多，不易得到稳定遗传的突变类型。因此综合以上结果可知当热激温度一定时热激时间越长果蝇幼虫的基因越易发生突变。

热激处理果蝇的蛹

对果蝇蛹进行2h 、4h 、8h 热激处理后得到的突变情况如下：

a 白眼突变型蛹被热激4h 后羽化出的成蝇（表型全部正常）兄妹交得到的突变体（M 0）有右翅不展、左翅不展、双翅窄小和双翅焦状（如图5），将M 0代中性状相同的突变体逐代兄妹交三代，发现其中的右翅不展和左翅不展性状的突变体可以稳定遗传，而双翅窄小、双翅焦状性状的突变体不能稳定遗传。

b 野生型果蝇蛹被热激8h 后羽化出的成蝇（全部正常）兄妹交经上述相同处理后可得到能稳定遗传的突变体果蝇，其性状为双翅尖不展、正常个体、右翅不展、左翅不展。

热激处理果蝇成蝇：

分别对野生型、白眼的处女蝇和雄蝇进行2h 、4h 、8h 的30℃热激处理，得到的突变情况具体如下：

a 成蝇经2h 热激处理后，进行兄妹交所得到的后代中有白眼雌性翅基部有痕翅果蝇（M 0）（图6a ），将其与正常果蝇杂交后，得到M 1代果蝇大多是正常的，将M 1代兄妹交后，产生的M 2代中有极少的残翅突变体。随环境恢复正常，其后代表型也回复正常。实验中还分离到白眼翅如飞机翅样展且不能飞果蝇（图6

b ）、翅尾近水平果蝇（图6

c ）和左翅略焦不展右翅完好果蝇（图6

d ）以及右翅无仅左翅完好果蝇（图6

e ）等，用上述方法处理后，也均恢复为正常表型。

(a) (b)

(c) (d) (e)

图4 热激野生型和白眼果蝇幼虫所得突变体

a 双翅窄小；

b 双翅焦状；

c 左翅不展；

d 双翅尖不展；

e 右翅不展（左翅机械受损）

图6：热激2h 成蝇得到的突变体 a 残翅;b 展翅，不能飞;c 翅不完全;d 左翅不展 e 右翅残缺 （a ）

（b ）

（c ）

（d ）

（e ）

（a ）

(b)

(c)

(d) (e) 图5 热激野生型和白眼果蝇的蛹所得突变体 a 双翅尖不展(野生型)；b 左翅不展（野生型）；c 右翅不展（野生型）； d 左翅不展（白眼）；e 双翅窄小

b 成蝇经4h 热激处理后，进行兄妹交所得到的后代中有野生型雌性波状双翅果蝇（M 0）（图7a ），按a 中所述方法处理M 0代果蝇，得到M 1代果蝇中除正常果蝇外，出现了右残翅果蝇（图7b ），但无波状双翅个体出现。M 1代正常个体与右残翅分别兄妹交，在接下来的M 2代、M 3代中突变体数量很少，且未出现和亲代突变体相似的突变体类型。推测也许是存在纯和致死现象或突变体竞争力弱，在幼虫期或蛹期死亡，最终没有得到稳定的突变个体。实验中还分离到白眼两翅窄小果蝇（图7

c ），同样最终也未得到稳定的突变个体。

c 成蝇经8h 热激处理后，进行兄妹交所得到的后代中有一种白眼雌性右翅勺状、左翅完好（M 0）的突变体（图8a ），按a 中所述方法处理M 0代果蝇，M 1代得到深色小窄翅果蝇（不能飞）（图8b ），分离深色小窄翅果蝇进行兄妹交，M 2代果蝇中有大量的深色小窄翅果蝇（图8c ）出现，还有少数的果蝇是翅皱褶贴身（图8

d 1、d 2）和体型小的果蝇（图8

e 1、e 2），e 1图左侧为体型小的突变个体，e 1右侧为正常白眼果蝇，体型小的果蝇雄性尾尖只有一个浅色的黑点，这与正常白眼雄果蝇（e 2图斜上方为正常白眼果蝇，斜下方为体型小的突变个体）明 显不同；极少数的翅与身体等长色深（图8

f ）。在体式显微镜下仔细观察翅皱褶贴身的果蝇发现有两条后腿是残缺的，运动时只是四条前腿和中腿起作用（d 1图左侧）。现确定深色小窄翅果蝇能稳遗传，具体遗传方式还不清楚，需进一步进行实验；而M 2代中其它三种突变性状是否能够遗传有待确定。

（2）热激成蝇突变情况

图7：热激4h 成蝇得到的突变体

a 波状双翅;

b 右残翅;

c 两翅窄小

（a ）

（c ）

（b ） （a ）

（b ）

（c ）

（d 1） 图8：热激4h 成蝇的突变体 a 右翅勺状、左翅完好;b 、c 深色小窄翅果蝇（不能飞）

d 1、d 2皱褶贴身;

e 1、e 2体型小;

f 翅与身体等长色深

（d 2）

（e 1）

（f ）

（e 2）

热激诱变野生型和白眼成蝇2h 、4h 和8h 后，记录当代热激果蝇的后代突变数目，并计算突变率。所得结果整理如表2：(M 0是指热激当代成蝇所产生的突变体) 由表可知，热激诱变野生型、白眼成蝇产生的后代均发生了突变。

去掉 表2：热激成蝇后代M

和M 突变率统计表

1 2.1%、2.8%、

2.1%，M 2代突变率依次是4.3%、

3.0%、5.3%；热激白眼成蝇2h 、4h 、8h ，突变体M 1代的突变率依次是3.21%、6.7%、3.5%，M 2代突变率依次是5.7%、5.45%、

8.6%。从数据可知热激相同时间，白眼M 1代和M 2代的突变率分别比野生型M 1代和M 2代突变率高，整体来看，热激处理成蝇实验中白眼比野生型突变率高。 。

2.5 EMS

处理果蝇成蝇

用0.5%EMS 分别处理果蝇的雌蝇和熊蝇，根据处理的时间不同，果蝇突变率不同，具体结果如下

EMS 处理成蝇时

，喂

食

其0.5%的EMS 培养基后果蝇并没有

发生明显的变化（即中毒而死），

将处理后的果蝇与正常果蝇杂交

的后代中出现了大量的突变体

（M 1），但将其保种后并没有得到

能过稳定遗传的类型。M 1具体突

变情况如下：

a 白眼型突变体雌蝇经喂食1h0.5%的EMS 培养基后其M 1代中出现了一只雌性残翅果蝇（如图）；喂食4h 的雌蝇的M 1代出现了1只雌性针状翅（如图9）、1只雄性残翅果蝇（如图10）、1只雌性焦刚毛焦翅果蝇、1只雌性焦刚毛小翅果蝇（如图11）；

b 野生型果蝇雌蝇经喂食1h0.5%的EMS 培养基后其M1代中出现了6只雄性白眼果蝇和1只雌性焦翅果蝇（如图12）

图9 针状翅突变图10 残翅突变 a 焦翅果蝇 b 焦刚毛焦翅果蝇 c 焦刚毛小翅果蝇 图11

图12 野生型焦翅果蝇

不论是白眼突变体还是野生型果蝇的雄蝇经过喂食0.5%的EMS培养基后均没有出现突变体，推测EMS更易对卵细胞产生影响，而对精子的影响较小。

3 讨论

3.1翅膀突变为主要的突变表型

总结实验结果得出,大部分突变体的表型为翅膀突变，极少的由白眼突变型变为野生型或者有野生型变为白眼突变型（即回复突变），还有更少量出现了由直刚毛变为焦刚毛的突变。由此可见，翅膀为果蝇的薄弱部位，即这个部位很容易受到外界环境影响，原因可能有二，其一可能是翅膀处的某些蛋白质容易变性，在受到外界不良环境的影响时会发生不同程度的改变，所以会出现针状翅、小翅、焦翅甚至无翅等不同程度的变异并且这些变异不能够遗传；其二可能是因为不良的环境直接导致了基因突变，从而导致了表型变异，而且这种变异是可遗传的，于是得到了一系列的稳定遗传突变体。

3.2 不同果蝇得到的突变不同

从实验结果的总体来看,白眼突变体经受不良环境条件处理后要明显比野生型果蝇易发生突变，分析其原因可能是白眼突变体的蛋白质或者基因较不稳定,更易受到不良环境的影响。而野生型果蝇生命力比白眼突变体果蝇要强，自身具有很强抵抗力，在不良环境下，可以保持自身基因正常，即不发生突变或发生较小的突变。

由EMS单独处理果蝇雌蝇和雄蝇得到的结果可知，雌性果蝇的卵细胞更易受到不良环境的影响而发生突变，而精子则相对较稳定。

3.3 不同诱变条件得到的突变体不同

分析实验结果可知以上三种不同的处理方法得到的果蝇突变体的表型基本一样，随着处理强度的加大突变程度随之加大，如热激幼虫时，热激时间越长果蝇基因越易发生突变，2h热激幼虫和蛹时能得到稳定遗传的突变体（推测可能是因为单基因突变），而4h和8h热激得不到稳定遗传的突变体（推测可能因为是多基因突变）。并且不良条件持续的时间过长可能会使果蝇生活力明显下降，甚至死亡，如8h紫外线照射成蝇果蝇存活天数2天左右，无法得到后代。

3.4 实验设想

本实验最终共得到了11种新的能稳定遗传的不同突变性状的突变体，分别为野生型双翅尖不展个体、野生型右翅不展和左翅不展个体，白眼残翅、白眼小翅、白眼双翅焦状、白眼双翅尖不展、白眼小深色窄翅、白眼右翅不展和左翅不展个体以及小体型白眼个体。

在接下来的实验中想对得到的这些突变体进行分子研究确定突变性状的基因位点，并研究其功能，将其与人类的基因联系起来，从而研究人类临床疾病。

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