肝星状细胞详解
肝星状细胞
肝脏星状细胞占肝脏固有细胞总数的15%，占非实质细胞的30%左右。HSC存在于Disse腔中，呈梭形或多边形，胞浆内有多个富含维生素A的脂滴，其细长的突起向外延伸环绕在血窦内皮细胞外面，是体内储存视黄醛衍生物的首要部位。在正常肝脏中，星状细胞处于静止状态，不表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA），增殖活性低，合成胶原能力低，其主要功能是贮存视黄醛类。
中文名肝星状细胞外文名hepatic stellate cell，HSC 科室肝胆外科
简介
肝星状细胞是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC 作为最终靶细胞。肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，正常情况下肝星状细胞处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。
背景
早在1876年，德国CarlvonKupffer在使用氯化金染色法研究肝脏的神经系统时无意中发现肝血窦周围有呈星状形态的细胞，将其命名为星状细胞（sternzellen）。1898年，Kupffer用印度墨水对兔肝进行染色时，观察到能吞噬墨水颗粒的肝巨噬细胞，也就是后来人们为纪念Kupffer而命名的Kupffer细胞。因为同样为星状形态，Kupffer 误把肝巨噬细胞和星状细胞混为一谈，认为星状细胞就是肝巨噬细胞。这种观点在当时得到了广泛的认同。直到1951年，日本学者ToshioIto通过光学显微镜发现人的肝窦周围有一种富含脂质小滴、并且有网状纤维包绕的细胞，并将之命名为伊东细胞（ItoCel1s）或贮脂细胞（fat-storingcells）。1958年，Suzuki用银染色法在Disse腔内观察到这种星芒状的细胞，发现其突起与肝脏内的自主神经末梢相连系，他认为这种细胞能将来自肝内自主神经的冲动传递给肝实质细胞，并将其称为“间质细胞”；1966年，Bronfenmajor证实了伊东细胞的发现，又给该细胞起新名叫脂细胞（1ipocytes）；1971年，KenjiroWake采用电镜，结合氯化金染色法和苏丹红染色法发现Ito所描述的伊东细胞和Kupffer所发现的星状细胞原来是同一类型的细胞，并指出上述细胞既不同于肝窦内皮细胞，也不
是肝内的巨噬细胞。这种细胞富含VitaminA和脂质小滴,其中脂质小滴发出的自体荧光，以及这种细胞能被氯化金染色的特性都与VitaminA的存在有关。至此，人们才揭开了这种星芒状细胞的真实面目，并开始了对其功能的研究，逐渐发现了它与肝纤维化的关系。1995年，国际上正式将其命名为HSC。
性质及功能
HSC位于Disse间隙内，紧贴着肝窦内皮细胞（sinusoidalendothelialcells,SEC）和肝细胞。其形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。此外，HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。HSC胞质内有1～14个直径约1.0～2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴，胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。胞核形态不规则，由于脂滴的挤压，常致细胞核有一个或多个凹陷，核内可见1～2个核仁。正常肝脏中HSC的数目很少，只占肝细胞总体数目的5%～8%及总体体积的1.4%，但HSC的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。
正常情况下HSC表现为富含VitA脂滴的静止型，其功能主要有：
（1）代谢和贮存VitA：肝脏储存有体内80%左右的维生素A，对体内维生素A的代谢起着重要作用。视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合，然后转运到邻近的HSC储存。
（2）储存脂肪：正常HSC胞质内的脂滴含有大量的甘油三酯，为肝细胞提供能源。
（3）合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分：研究认为，HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的主要合成细胞。正常肝脏中HSC合成的胶原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型为主，其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。HSC还能合成纤维连接蛋白、层连蛋白和粗纤维调理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖。
（4）合成基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）及其组织抑制剂（tissueinhibitorofmetalloproteinases，TIMP）:正常情况下，HSC能分泌多种胶原酶和基质降解蛋白酶如基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）-1、MMP-2等以降解各种细胞外基质,同时分泌组织金属蛋白酶抑制剂（tissueinhibitorofmetalloproteinase，TIMP-1）防止胶原过度降解,使肝脏ECM的合成和分解处在一个动态平衡中。
（5）表达细胞因子及受体：正常情况下，HSC可以分泌肝细胞生长因子（HGF），参与肝细胞再生的调控。此外，HSC还能表达少量的转化生长因子（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）、血小板衍生的生长因子（Plateletderivedgrowthfactor，PDGF）和胰岛素样生长因子（IGF）等，同时HSC能表达TGF-β1的II、III型受体和PDGF受体的α亚单位等。
（6）参与肝窦血流调节：HSC伸出胞突包绕着肝窦，通过其纤长突起的收缩功能调节肝窦内微循环，从而影响着肝脏的血流分布和门静脉压力。
生物学特征
正常情况下肝星状细胞处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。肝星状细胞位于肝窦周Disse 腔内，约占肝脏所有细胞的13%。在规HE染色的肝组织切片中，不能显示星状细胞，但可用免疫组织化学将其定位，并可将其分离进行体外细胞培养。正常情况下肝星状细胞呈静止状态，它在肝脏中的生理功能主要有参与维生素A 的代谢，储存脂肪的功能，肝星状细胞的胞浆中含有类视黄醇物质的脂滴，是维生素A 的主要储存处，肝星状细胞还有调节血管和肝窦血流的作用。在病理条件下如肝脏受到物理、化学及病毒感染生物因素的刺激时，肝星状细胞增殖并激活，转变为“肌成纤维细胞”，表达α-平滑肌动蛋白、合成ECM等。当肝脏有炎症时，肝星状细胞发生激活，Gressner 等研究提出了肝星状细胞激活的“三步级联反应”。模式激活型的肝星状细胞具有以下特征：
1、胞体增大，胞突伸展。胞质中脂滴消失，VitA含量减少。胞质内粗面内织网、高尔基体发达，具有旺盛的蛋白质合成能力；
2、细胞增生频率增加，并且向肝损伤部位迁徙；
3、表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、波形蛋白（vimentin）及结蛋白（desmin），成为肌纤维样母细胞；
4、收缩性增强；
5、ECM分泌增加；
6、细胞因子、趋化因子及受体分泌增加；
7、TIMP合成及分泌增加，使ECM成分降解减少。其中α-SMA的表达为HSC激活的标志。
活化
肝星状细胞的持续激活是肝纤维化发生发展过程中的关键环节。激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高，这两类变化最终奠定了肝纤维化、门静脉高压症发病的病理学基础。肝星状细胞的激活过程十分复杂，包括两个主要阶段：启动阶段及持续阶段。持续阶段则是这些刺激因素维持肝星状细胞的活化表型，结果引起肝纤维化的形成。启动阶段主要是依赖于旁分泌刺激因素。而持续阶段则与旁分泌、自分泌刺激因素均有关。
启动阶段
启动阶段是指早期基因表达的改变及在细胞因子等刺激因素作用下产生的细胞表型改变。当肝实质细胞受到损伤时，邻近的肝细胞、库普弗细胞、窦内皮细胞和血小板等通过旁分泌作用可分泌多种细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、转化生长因子β（TGF-β）、胰岛素生长因子（IGF-1）、肝细胞生长因子（HGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、内皮素（ET）-1等，作用于HSC并使之出现肌成纤维母细胞（myofibroblast，MFB）样表型转化，激活并导致细胞增殖、ECM合成增加等。激活后的肝星状细胞可自分泌TGF、PDGF、ET等细胞因子使活化得以持续，此时即使除去原发因素纤维化仍会持续。
持续阶段
持续阶段指由于上述各种因子的作用而维持星状细胞的激活状态并有纤维形成。肝星状细胞活化的持续阶段有以下特征性的变化，这些改变的直接或间接效应是增加ECM的沉积。此阶段肝星状细胞的活化受自分泌和旁分泌的双重调节。
（1）细胞增殖：PDGF是肝星状细胞的最强丝裂原，肝星状细胞活化早期PDGF受体增强了肝星状细胞对这种丝裂原的反应；
（2）细胞趋化聚集：肝星状细胞能向化学趋化剂的部位移动，在一定程度上解释了为什么肝星状细胞在肝内多分布在炎性间隔内；
（3）纤维形成：增加基质形成是肝星状细胞活化导致肝纤维化的最直接途径。一方面，ECM合成的量增加；另一
方面，合成的ECM种类异常，在正常情况下，肝星状细胞以合成型胶原为主。而活化后则以产生型胶原为主；（4）细胞的收缩作用：肝星状细胞的收缩作用可能是引起肝纤维化后门静脉阻力增加的重要因素。晚期肝硬化典型的纤维带中充满着大量肝星状细胞，活化的肝星状细胞通过收缩窦周和收缩硬化的肝脏阻碍门静脉血流。引起肝星状细胞收缩的主要刺激因子是内皮素-1（endothelin-1，ET-1），其受体在静止或活化的HSC均有表达；（5）基质降解：在肝纤维化过程中，伴随着ECM重构，基质蛋白酶质和量的改变起重要作用。肝星状细胞几乎能表达基质降解所需要的所有关键成分，因此，活化的肝星状细胞不仅在ECM生成过程中起作用，而且在ECM降解过程中也起重要作用。基质蛋白酶家族是一类钙依赖蛋白酶，能够特异性地降解胶原蛋白和一些非胶原蛋白成分。根据基质蛋白酶对底物的特异性将其5类：①间质性胶原酶；②明胶酶；③溶基质素；④膜型基质金属蛋白酶；⑤金属弹力蛋白酶；
（6）视黄醇类消失：随着肝星状细胞活化，细胞失去了其特征性的核周视黄醇（维生素A）脂滴；
（7）白细胞趋化及释放细胞因子：除了肝脏内多种细胞因子通过旁分泌发挥作用外，肝星状细胞自分泌的细胞因子对其活化的持久延续也很重要。活化的肝星状细胞自分泌TGF-B以及ET-1。分别导致肝星状细胞产生大量ECM和具有收缩性。肝星状细胞还能通过诱导单核巨噬细胞浸润来扩大炎症效应。
凋亡
激活的肝星状细胞有两个去向：
（1）由激活态转变回静止态。研究认为IL-10是一种能够调控这一反应的刺激因子，可以下调炎症反应并增加组织间隙胶原酶的活性；
（2）发生细胞凋亡而死亡。体外培养试验表明，静止的肝星状细胞不发生凋亡，肝星状细胞在活化的同时出现自发性凋亡。近年来，有关肝星状细胞凋亡分子机制的研究进展较快，现已证明有多种基因产物参与肝星状细胞凋亡过程。其中包括死亡受体家族如Fas与FasL系统、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶即Caspase家族、bcl-2调节蛋白家族等。人们通过对这些蛋白家族成员生化特性、生物功能以及上游下游分子作用机理的深入研究，提出了肝星状细胞凋亡主要的两条信号转导通路：细胞凋亡的线粒体依赖性途径和死亡受体途径。两条通路的结果都是引发了Caspase家族的级联反应，最终表现为凋亡的产生。
调控
1、Fas/FasL系统Fas也称Apo-1或CD95，属于肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor，TNF）受体和神经生长因子（nervegrowthfactor，NGF）受体超家族。Fas是一个48kDa的I型跨膜蛋白分子，由319个氨基酸组成，定位于人10号染色体长臂。Fas主要分布于组织细胞中，少量以可溶性形式（sFas）存在于细胞质和血清中。Fas配体（FasLigand，FasL）是一个分子量约为40kDa，属于TNF家族的Ⅱ型跨膜蛋白分子，其C端位于胞外，N端深入胞内，定位于人1号染色体。主要表达于活化的T淋巴细胞表面。FasL或Fas抗体与细胞表面的Fas结合可诱导细胞凋亡。
2、Caspases家族近年来，在机体内发现多种半胱天冬蛋白酶（cysteineaspartate-specificproteinase，caspase）家庭成员，它们是结构特征相似的同源蛋白酶，这些蛋白酶都是特异性的在底物的天冬氨酸序列后切断肽键。在哺乳动物细胞内至少发现了十三种，编号Caspase-1～13，其中包括两个在人类还未找到相应对等物的小鼠Caspase-11、12。根据其序列同源性可将它们分为三个亚家族：ICE样、ICH-1样和CPP32样蛋白酶。Caspase 家族的过度表达均可引起一系列不可逆转的蛋白质裂解，最终导致细胞死亡，可以说，Caspases蛋白的表达是各种细胞凋亡机制共同的最后通路。
肝星状细胞与肝纤维化(一)
肝星状细胞与肝纤维化(一) 〔关键词〕肝星状细胞；肝纤维化；活化 各种病因所引起的慢性肝病绝大多数都有肝纤维化(HF)，其中25％～40％最终发展为肝硬化甚至肝癌，是一类世界性的严重危害人们健康的主要疾病。在过去的几十年里，HF能否发生逆转一直是医学界有争议的问题，现已知HF是一个可逆性的病变，而肝硬化是不可逆的〔1〕。HF是对各种病因所致的慢性肝损伤的一种修复反应，其实质是肝内细胞外基质(ECM)合成大于降解导致大量ECM过度沉积。研究证实，肝星状细胞是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFLC)，是HF发生、发展的核心环节。各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，通过使其转化为肌成纤维细胞这一共同复杂的网络系统，参与HF的发生及进展〔2〕。在HF的恢复期，有与肝脏瘢痕降解一致的广泛的HSC凋亡〔3〕，因此，诱导活化HSC的凋亡可使HF发生逆转。目前，活化HSC已被看作抗HF治疗的主要靶点。现就HSC与HF的关系作一综述。1HF的发病机制 近年来的研究发现，尽管不同病因导致肝病的发病机制不同，但HF发生的最终共同途径均是HSC，当各种致病因素持续作用于肝脏时，通过复杂机制激活HSC。活化的HSC通过旁分泌与自分泌作用合成分泌多种ECM，同时合成、释放大量基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)，抑制胶原酶、明胶酶等金属蛋白酶(MMPs)活性，减少ECM降解，导致细胞外基质合成大于降解，最终过量积聚在肝内形成HF。 2HSC活化的机制 2.1HSC的形态学和生物学特征HSC又称储脂细胞、Ito细胞、维生素A储存细胞等，是肝脏间质细胞之一，位于肝细胞与肝窦内皮细胞之间的窦周隙(Disse间隙)内，是目前公认的HF 形成中主要产生ECM的细胞。HSC正常时呈静止状态，形状不规则，胞体呈卵圆形或不规则形，常伸出数个星状突起，胞浆中富含维生素A和甘油三酯的脂滴。除储存维生素A脂滴外，HSC还具有收缩功能，可调节血管功能和肝窦血流；此外，HSC也参加正常肝脏的ECM 改建。当各种致病因素持续作用于肝脏时，通过复杂机制激活HSC。HSC的激活可人为地分为两个阶段,即启动阶段及持续活化阶段〔5〕。 2.2启动阶段HSC活化的启动是邻近细胞(如肝细胞、Kupffer细胞、肝窦内皮细胞、血小板等)旁分泌作用的结果。肝损伤早期，肝窦内皮细胞(SEC)通过产生变异的纤维连接蛋白(LN)及使无活性的转化生长因子转化为具有促胶原合成活性的活化型，变性坏死的肝细胞通过产生脂质过氧化物，Kupffer细胞通过诱导HSC上血小板源生长因子(PDGF)受体的表达及使无活性的转化为活性型，血小板通过产生PDGF、、表皮生长因子(EGF)等细胞因子均参与启动HCS的活化。另外，ECM的早期改变、脂质过氧化物等也参与活化的启动。其结果是使HSC发生基因表达及表型的改变，表现为转录活化、信号分子活化及诱导早期结构基因表达，使胞膜上表达细胞因子、生长因子受体，如PDGF受体、TGF受体、血管内皮生长因子(VEGF)受体等，产生对这些介质分子的应答能力，增殖活化为肌成纤维细胞。 2.3持续激活阶段是HSC自分泌及旁分泌共同作用的结果。HSC活化启动后发生一系列表型改变，包括：细胞增生：特别在炎症坏死区域新形成的纤维间隔内，致细胞数量增多；表型转化：由维生素A储存型转化为广谱ECM合成表型，致ECM合成增多；产生收缩性：表达平滑肌肌动蛋白可诱导微循环改变及血小板凝聚；趋化性：向损伤区移行，致损伤区纤维形成细胞增多；细胞因子及其受体表达增强：对化学因子刺激的敏感性增加；表达黏附蛋白受体——整合素家族：整合素是一组二聚体细胞受体，包括胶原、FN受体、纤维连接蛋白(LN)受体，其表达参与介导细胞与基质的相互作用；释放胶原酶及其抑制物：Ⅳ型胶原酶的释放破坏内皮下基质，通过反馈促进HSC转化；而金属蛋白酶抑制物的分泌可减少新生成胶原的降解，最终导致ECM的过度沉积。HSC通过自分泌作用不断刺激自身的
肝星状细胞详解
肝星状细胞 肝脏星状细胞占肝脏固有细胞总数的15%，占非实质细胞的30%左右。HSC存在于Disse腔中，呈梭形或多边形，胞浆内有多个富含维生素A的脂滴，其细长的突起向外延伸环绕在血窦内皮细胞外面，是体内储存视黄醛衍生物的首要部位。在正常肝脏中，星状细胞处于静止状态，不表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA），增殖活性低，合成胶原能力低，其主要功能是贮存视黄醛类。 中文名肝星状细胞外文名hepatic stellate cell，HSC 科室肝胆外科 简介 肝星状细胞是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC 作为最终靶细胞。肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，正常情况下肝星状细胞处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。 背景 早在1876年，德国CarlvonKupffer在使用氯化金染色法研究肝脏的神经系统时无意中发现肝血窦周围有呈星状形态的细胞，将其命名为星状细胞（sternzellen）。1898年，Kupffer用印度墨水对兔肝进行染色时，观察到能吞噬墨水颗粒的肝巨噬细胞，也就是后来人们为纪念Kupffer而命名的Kupffer细胞。因为同样为星状形态，Kupffer 误把肝巨噬细胞和星状细胞混为一谈，认为星状细胞就是肝巨噬细胞。这种观点在当时得到了广泛的认同。直到1951年，日本学者ToshioIto通过光学显微镜发现人的肝窦周围有一种富含脂质小滴、并且有网状纤维包绕的细胞，并将之命名为伊东细胞（ItoCel1s）或贮脂细胞（fat-storingcells）。1958年，Suzuki用银染色法在Disse腔内观察到这种星芒状的细胞，发现其突起与肝脏内的自主神经末梢相连系，他认为这种细胞能将来自肝内自主神经的冲动传递给肝实质细胞，并将其称为“间质细胞”；1966年，Bronfenmajor证实了伊东细胞的发现，又给该细胞起新名叫脂细胞（1ipocytes）；1971年，KenjiroWake采用电镜，结合氯化金染色法和苏丹红染色法发现Ito所描述的伊东细胞和Kupffer所发现的星状细胞原来是同一类型的细胞，并指出上述细胞既不同于肝窦内皮细胞，也不
鼠肝星状细胞分离方法汇总
1、大鼠原代肝星状细胞的分离培养方法汇总： 方法一雄性SD大鼠，体重400—500g。 [操作步骤] 1.大鼠以戊巴比妥钠麻醉，同时皮下注射5000U肝素钠抗凝； 2.皮肤常规消毒后打开腹腔，钝性分离门静脉及下腔静脉； 3.以16号套管针作门静脉插管，37℃灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈， 剪开下腔静脉放血后结扎。立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环； 4.以0.1％链霉蛋白酶E 5mL/min灌注3-4分钟，0.03％Ⅱ型胶原酶5ml/min 灌注3-4分钟； 5．取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006％、DNA酶至终浓度为10pug/ml。37℃5％C02孵箱内消化30分钟； 6.过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中， 对照管中加入等量培养液; 7.4℃800g平抛离心30分钟。吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次； 8.加入五血清RPMll640培养液，于37℃5％C02孵箱孵育15分钟：吸取细胞 悬液，在6孔板中以含20％胎牛血清的RPMl1640培养。24小时后换液，此后每3天换液1次。 方法二： [动物] 雄性纯种Wistar大鼠，体重400-500g，普通饲料喂养。 [操作步骤] 1.大鼠用戊巴比妥钠麻醉，无菌操作下打开腹腔； 2.经门静脉肝素化，取出肝脏，灌流液灌注10-20分钟(37℃)，至肝细胞略显 黄色； 3.链霉蛋白酶E溶液(0.02％)反复灌注10-20分钟(40—41℃)，胶原酶溶液反复 灌注10-15分钟(40—4l℃)，至肝组织完全软化； 4.两液合于器皿中，钝性撕碎肝组织，置三角烧瓶内37~C下振荡消化20分 钟，三层纱布过滤； 5.无钙培养液洗2次，将细胞悬液加至三层非连续密度梯度最上层(从下至上 为1.080、1.058、1.053)，再在上面加一层无钙培养液，16000r／min离心30分钟(20℃)； 6.轻轻吸取上层培养基与1.053层之间的细胞，细胞经无钙培养液洗2次后， 调成(1-5)XlO5/ml浓度，接种于50ml培养瓶(内含20％小牛血清的RPMl1640培养液)； 7.培养28h后换含新鲜10％小牛血清的RPMl1640培养液，以后每隔3—4天 换液1次。
小鼠肝脏取材步骤
小鼠肝脏组织取材步骤 小鼠肝脏组织取材步骤，并列出完成此次实验所需要的试剂、仪器、材料等相关物品及实验人员安排情况。 材料：小鼠 试剂：DMEM 戊巴比妥钠 75%酒精 PBS 器械消毒液戊二醛 仪器：解剖台备皮刀弯盘组织剪眼科剪手术刀柄刀片血管钳眼科镊 培养皿无菌手套 实验人员安排：小鼠养殖管理组准备工作组实验操作组 实验步骤: 1. 取材前夜禁食，自由饮水。 2. 小鼠称重，按照50mg/kg的比例用5ml的注射器配合针头抽取戊巴比妥钠备用。 3. 正左手的小指和无名指抓住大鼠的尾巴，另外三个手指抓住大鼠的颈部，使大鼠头部向向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。右手持注射器，从腹部近腿根处刺入后再腹部皮下穿行深入，动作轻柔，缓慢注射。注射完药物后，缓缓拔出针头，手指按住针口对小鼠腹部轻柔按摩，促进麻醉药物的吸收，掐小鼠尾部检测小鼠麻醉程度。 4.将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠整个胸部和腹部，修剪去腹部毛发，75%酒精消毒。 5.沿腹侧正中线自阴茎上源由下而上剪开腹部皮肤直至剑突，向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织，暴露腹壁浅肌层。沿白线钝性分离腹壁肌肉，剪开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起，显露肝门，眼科剪剪除肝脏周围结缔组织和血管。 6.结扎剪断肝门管道系统，钝锐结合完整取出大鼠肝脏，放置于无菌培养皿，生理盐水冲洗，称重并记录。①切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH 7.4)或4-戊二醛固定；②左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 7.切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。
肝星状细胞激活的分子机制与抗肝纤维化治疗 (2)
第28卷第2期2007年3月武汉大学学报(医学版) Medical Journal of Wuhan Univer sity Vol.28No.2Mar,2007 课题来源:国家自然科学基金资助项目(编号:30371666)作者简介:李婧婷,女,19832,医学硕士生,主要从事肝纤维化机制研究通讯作者:汪晖,女,19632,教授,博士生导师,主要从事生物化学与分子药理学研究 肝星状细胞激活的分子机制与抗肝纤维化治疗 李婧婷 汪 晖 廖长秀 平 洁武汉大学医学院药理学系 湖北 武汉 430071 摘要 肝星状细胞(H SC)激活是肝纤维化发生的中心环节,其激活过程可分为始动阶段(旁分泌刺激和转录调控因素启动级联瀑布式的细胞反应)和持续阶段(旁分泌或自分泌刺激和细胞外基质重建共同维持HSC 活化的表型反应)。肝脏中多种细胞和细胞因子参与调节了HSC 的激活过程。活化型HSC 的表型变化主要包括细胞增殖、收缩和纤维形成等。抗肝纤维化治疗策略主要包括调控HSC 活化增殖或促其凋亡、抑制胶原合成或促其降解、细胞因子治疗和间充质干细胞治疗等。 关键词 肝纤维化;肝星状细胞;激活;分子机制 中图分类号 R657.3+1 文献标识码 A 文章编号 167128852(2007)022******* Molecular Mechanism of Hepatic Stellate Cell Activation and Strategies of Anti 2fibrosis Therapy LI Jingting,WANG Hui,LIAO Zhangxiu,PING Jie D ept.of P ha rma cology ,School of Med icine ,Wuhan Univer sity ,Wuhan 430071,China Abstract The activation of hepatic stellate cell has been considered as the key step of liver fibr osis,mainly classified as initiation phase (paracr ine stimulation and transcriptional events initiating a cascade of cellular r esponses)and per petuation (paracrine and autocrine cytokine activity and ECM r emodeling sustaining the activated phenotype).Multiple cells and cytokines in liver play vital roles in regulating stellate cell activation.Major phenotypic featur es of activated hepatic stellate cell activation include proliferation,contractility,fibrogenesis,matrix degradation,chemotaxis,white blood cell chemoattraction,retinoid loss and cytokine release.Currently anti 2fibrotic therapy str ategies mainly include regulating the activating pr ocess,proliferation and ap 2optosis of hepatic stellate cells,inhibiting collagen synthesis or promoting collagen degradation,gene therapy and infusion of mesenchymal stem cells. Key Words Liver Fibrosis;H epatic Stellate Cells;Activation;Molecular Mechanism 各种刺激因素皆可引起肝细胞的变性和坏死,继而形成肝纤维化甚至肝硬化。细胞外基质(extra 2cellular matrix,ECM)积聚是大多数慢性肝病伴有的病理改变。肝星状细胞(hepatic stellate cell, H SC)是肝内胶原合成最主要的细胞来源。H SC 激活与肝纤维化的发生密切相关。近年来相继提出的一些抗肝纤维化治疗策略都要归功于H SC 激活分 子机制的逐渐阐明。
原代小鼠肝细胞制备
细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程 实验试剂 培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。 D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4?7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存） 0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃ 保存）) PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存） 鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配） 0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL 0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配） Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2?6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4?7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存） 实验仪器 CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）； Sigma高速离心机； IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）； DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）； 液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）； Sigma5310离心机； ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。 实验方法 实验准备
IL-1β促肝星状细胞增殖与JNK_AP-1信号转导通路的关系
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宣墅瘟堂塑墅煎堂盘查兰鱼塑堡！Ｑ旦笙！！鲞箜！旦塑堡垒ｉ璺』璺！！！翌！坚！！竺！丛！巳苎！！！：Ｑ！！兰鲤！！！！！：！墨：塑！：！Ｑ?９０５? ＪＮＫ通路后，ＩＬ－ｌＢ的促Ｈｓｃ增殖作用受到抑制。对 照组吸光度为１．５６０±０．１ｌＯ。而经ＳＰ６００１２５预处理 的各组细胞，吸光度均减低，ＳＰ６００１２５浓度分别为１０、 ２０、４０肛ｍｏｌ／Ｌ时，吸光度分别为１．４２７±Ｏ．１１３、Ｏ．７７２ ±０．０９３、０．６７５±０．０７４，与对照组相比其增殖反应均 明显降低（Ｐ＜０．０５、０．０ｌ、０．０１），且随ｓＰ６００１２５浓度增加，抑制作用愈加明显，ｓＰ６００１２５浓度分别为１０、２０、４０肛ｍｏｌ／Ｌ时，增殖抑制率分别为８．５２％、５０．５ｌ％、５６．７３％。 ２．３ＩＬ－ｌＢ激活大鼠ＨＳＣＪＮＫ通路的动力学观察 Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ印迹显示，ＩＬ—ｌＢ同时激活ＪＮＫ蛋白的两种同型体，在大约４６ｋＤ及５５ｋＤ位置出现两条杂交带即ｐ—ＪＮＫｌ和ｐ．ＪＮＫ２，在大约４３ｋＤ位置出现内参照Ｂ．ａｃ—ｔｉｎ杂交带。将各杂交带进行灰度分析，结果显示：ＩＬ．１Ｂ可呈时间依赖性激活Ｈｓｃｓ中ＪＮＫ蛋白。未经ＩＬ．１Ｂ刺激的对照组ＪＮＫ活性为０．９８２±Ｏ．２９９；ＩＬ．１Ｂ（１０斗ｇ／Ｌ）刺激ＨＳＣ５ｍｉｎ后，即见ＪＮＫ活化增强（１．５０１±Ｏ．７２０），但无统计学意义；１５ｍｉｎ时明显增强（２．１３３±０．８８２，Ｐ＜Ｏ．０１）；３０ｍｉｎ时达到高峰（３．３６０±Ｏ．４５２，Ｐ＜０．０１），随后有所降低，６０ｍｉｎ时仍保持较高的活化状态（２．１８ｌ±０．７８９，Ｐ＜０．０１），１２０ｍｉｎ后则基本恢复初始水平（１．３８５±０．３６８）（见图１）。 图ｌＩＬ－ｌＢ作用大鼠ＨＳＣ时ＪＮＫ活性的时效变化 ＦｉｇｌＩＬ－ｌｐａｃｔｉＶａｔｅＪＮＫｉｎａｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎⅡｅｒｉｎｒａｔＨＳＣ ２。４ＩＬ－ｌＢ作用大鼠ＨＳＣ后ＡＰ－ｌ活性的时效观察ＥＭＳＡ结果显示，对照组ＨＳＣ内有低水平的ＡＰ—ｌ活化（２４１．８ｌ±５３．０８），ＩＬ—ｌｐ（１０斗ｇ／Ｌ）作用Ｈｓｃｌｈ后，ＡＰ一１与寡核甘酸探针结合的滞后带较前明显增粗、变黑（５８４．６８±６５．０６，Ｐ＜０．０１），２ｈ达到高峰（６４１．３８±５０．９ｌ，Ｊ｝）＜０．０１），４ｈ有所同落但仍明显高于对照组（５５５．６４±４１．３９，尸＜０．０１），而经ＳＰ６００１２５（１０斗ｍｏｌ／Ｌ）预处理ＨＳＣ３０ｍｉｎ，再加入ＩＬ—ｌＢ（１０¨ｇ／Ｌ）培养２ｈ后，ＡＰ．１活性较ＩＬ一１ｐ２ｈ组明显受到抑制（３２５．４４±３３．７７，Ｐ＜０．０１）（见图２）。 ３讨论 多种损害肝脏因素导致肝损伤后，在肝细胞炎症、环死刺激下，相关细胞分泌多种细胞因子，如转化生长因子（ＴＧＦ）、血小板衍生生长因子（ＰＤＧＦ）、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ一１、ＩＬ一６等，这些细胞因子所蕴涵的信 图２ＩＬ－ｌｐ促进ＨＳＣＡＰ－ｌ活化及ＳＰ６００１２５抑制ＩＬ?ｌＢ诱导的ＡＰ?ｌ活性ｌ：阴性对照；２：对照组；３：ＩＬ—ｌＢｌｈ；４：ＩＬ－ｌＢ２ｈ；５：ＩＬ?ｌＢ４ｈ；６：ｓＰ６００１２５＋ＩＬ—ｌＢ２ｈ；７：竞争实验 Ｆｉｇ２ＩＬ－ｌｐａｃｔｉＶａｔｅｄＡＰ－１ｉｎａｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒａｎｄＳＰ６００１２５ｊｎｈｉｂｉｔｅｄＩＬ－ｌＢ－ｉｎｄｕｃｅｄＡＰ－ｌｂｉｎｄｉｎｇｉｎＩ’ａｔＨｓＣｓ１：ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｍｌ；２：ｃｏｎｔｍｌ；３：ＩＬ－ｌＢ１ｈ；４：ＩＬ—ｌｐ２ｈ；５：ＩＬ－ｌ母４ｈ；６：ＳＰ６００１２５＋ＩＬ—ｌＢ２ｈ；７：ｂｉｏｔｉｎ?ＩａｂｅＩｅｄＡＰ—ｌＤＮＡｐｌｕ８ｕｎｌａｂｅｌｅｄＡＰ一１ＤＮＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ） 息，需通过ＨＳＣ胞内信号转导系统传递，在某些转录因子的作用下，转导信号入核，从而启动ＤＮＡ复制、转录及翻译表达过程，实现ＨＳＣ活化、增殖、转型并分泌ＥＣＭ，最终导致肝纤维化的发生＂１。 ＩＬ．１为一种具有多种生物学功能的强有力的炎性细胞因子，几乎作用于所有体内细胞，调节炎症及多种反应。曾有研究证实，ＩＬ—ｌａ作用于ＨＳＣ，可使细胞分裂增加１６０％。ＩＬ．１ｄ与ＩＬ—ｌＢ的抗原性不同，但生物学活性相似。ＩＬ—ｌｐ是否也具有促Ｈｓｃ增殖作用尚乏报道。本研究结果显示，ＩＬ—ｌＢ作用于ＨＳＣ后，ＨＳＣ增殖反应明显增强。表明ＩＬ一１Ｂ也具有促ＨＳＣ增殖作用，为肝纤维化发生的重要致病因子。 ＭＡＰＫ是生物体内重要的信号转导系统之一，参与介导细胞生长、分裂、增殖等多种过程。在哺乳动物细胞中已成功克隆了ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＥＲＫ５四个ＭＡＰＫ亚族。这些ＭＡＰＫ亚族能被多种炎性刺激所激活，并对炎症的发生、发展起重要作用”芦’。Ｋｉｄａ等¨１发现，ＩＬ．１可通过ＪＮＫ通路上调齿龈成纤维细胞表达基质金属蛋白酶一ｌ（ＭＭＰｌ）及前列腺素Ｅ２。而ＩＬ一１Ｂ促Ｈｓｃ增殖及肝纤维化发牛的信号转导通路是否有ＪＮＫ的参与鲜有报道。本研究显示，ＩＬ—ｌＢ可在短时间内激活ＪＮＫ通路，刺激５ｍｉｎ后，ＪＮＫ开始活化，３０ｍｉｎ时达到高峰，随后逐渐降低，２ｈ后基本恢复初始水平。表明ＩＬ—ｌＢ可通过激活ＪＮＫ发挥生物学作用。 ＡＰ—ｌ作为转录调节蛋白，将细胞外刺激信号传导至细胞核，激活ＡＰ—ｌ位点的靶基因转录。ＡＰ一１为Ｊｕｎ家族成员（ｃ．ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ）组成的同源二聚体，或Ｊｕｎ家族与Ｆｏｓ家族（ｃ．ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、△ＦｏｓＢ、Ｆｒａｌ、Ｆｒａ２）组成的异源二聚体。许多基冈（如ＴＧＦ．Ｂ、纤维连接蛋白、层连蛋白、ＴＩＭＰ）的启动子中均存在与ＡＰ—ｌ结合的ＤＮＡ序列。ＡＰ．１与之结合即可调节该基因的转 录。因此ＡＰ．１活化在细胞增殖、转化及ＥＣＭ合成中万方数据
小鼠肝星状细胞分离
分离前准备： 分离前晚小鼠禁食不禁水 前灌流液NaCl 8g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06 g, NaHCO3 g，NaHCO3 0.35 g,加超纯水至终体积l L 酶配制液Nacl 8 g, Kcl 0.4 g, CaCl2 0.56 g, Na2HPO4·12H2O 0.151 g, NaH2PO4·2H2O 0.078g, HePes 2.38g, NaHCO3 0.35g, 溶解到1L 超纯水中 含钙GBSS液：KCl 0.37 g，CaCl2 0.225l g，MgCl2·6H20 0.21 g，MgS04 0.0342g，KH2P04 0.03g，NaHC03 2.27g，NaH2P04 0.1196g，葡萄糖1.0 g，加超纯水至终体积1L 链酶蛋白酶E灌注液：130 mg, 酶配制液100 ml 胶原酶灌注液：Ⅳ胶原酶30 mg，酶配制液100ml 震荡消化液：Ⅳ胶原酶12mg, 链酶蛋白酶E 5mg，Dnase 5mg，酶配制液50ml 28.7% Nycodenz分离液：Nycodenz粉末28.7g，含钙GBSS 100ml 以上液体0.22um 过滤除菌，置于37度水浴预热 分离： 10% 水合氯醛0.5ml麻醉小鼠，固定，75%酒精消毒，开腹，暴露肝门静脉，游离门静脉，埋线，24G 留置针进针，固定，打开蠕动泵，15ml/min灌注，剪开下腔静脉。流出液体澄清后，换链酶蛋白酶E灌注液，10ml/min,20min后换胶原酶灌注液，灌注30min，剪下肝脏，撕碎置于震荡消化液，加入1ml双抗，37度恒温摇床150rpm 30min。200目过滤。4度预冷DMEM中和。4度750g 7min离心，弃上清，重复一次。4度50g 3min,弃沉淀，4度750g 7min离心，弃上清，重悬，加Nycodenz调整密度1.04-1.055g/ml 之间，上铺1ml无钙GBSS，20度1350g 15min，吸取白色细胞层，10%DMEM 重悬，4度750g 5min，弃上清，20%FBS DMEM培养，24小时换液。
小鼠原代肝细胞培养
一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法 1材料与方法 1.1动物 2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。 1.2试剂 D-hank's液； 消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)； 消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP； 基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）； 小牛血清（BS，GIBCO公司提供）； 培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。 1.3鼠肝组织块培养 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。 1.4鼠肝细胞单层培养 动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。 或者： 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离； 5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用； 6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块； 7）再次离心5min，弃上清； 8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清； 9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数； 10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。
肝脏的胚胎学
肝脏的胚胎学 ?前肠末端腹侧壁的上皮增生形成一个向外突出的囊状突起, 称肝憩室 ?肝憩室头部生长迅速,上皮细胞增殖,形成细胞索,并分支吻合为肝索-肝板 ?肝憩室尾部发育为胆囊和胆总管 肝脏的大体解剖 ?成人的肝脏占体重的1/50左右， ?重约1500g ， ?体积约30X20X10cm, ?肝脏外观呈楔形， ?肝前方被镰状韧带分为两叶 –右厚（占5/6） –左薄（占1/6） 正常肝脏的血供 ?肝脏75%的血来自收集胃肠道、胰、脾等含较多营养物质的门静脉， ?富含氧气的肝动脉供应肝脏25%的血液。 ?左右肝静脉分支汇总形成肝静脉后于肝门注入下腔静脉。 ?在肝内与血管伴行的有胆管，胆管分支总与肝动脉、门静脉分支伴行，构成汇管区。肝脏的组织胚胎学 ?肝脏的实质细胞即肝细胞占肝总体积的80-90%， ?约占肝内细胞总数的80%， ?约有20个肝细胞排列呈一行肝索， ?然后组成肝板，形成对径0.7mm的六边形肝小叶。 ?估计全肝共有100万个肝小叶。 ?肝小叶以中央静脉为中心，肝索放射状排列。 肝腺泡学说 ?肝腺泡：以汇管区的门脉终末支为中心，2个相邻中央静脉之间的菱形肝脏组织结构 靠近汇管区的1/3 肝实质为I区，靠近中央静脉的1/3 肝实质为III, 二者之间的1/3 肝实质为II区. 肝脏细胞的种类 ?肝细胞 ?血窦内皮细胞 ?Kupffer细胞 ?肝脏星状细胞（HSC) ?Pit 细胞(NK细胞) ?胆管上皮细胞 性病毒性慢肝炎 ?过去按临床表现、实验室肝功能的检测和流行病学的调查结果评定患者是否为慢性肝炎，其标准是急性发病后病程超过6个月者。 ?现国内外均不依病程作为主要条件。如无任何症状或体征的HBsAg携带者，经过大量的普查，这些人群的肝组织多数显示较轻的慢性肝炎病变，且有10%以上为慢性活动性肝炎病变。 ?故慢性肝炎的诊断标准应依靠肝脏的组织学检查。 慢性肝炎的基本病变
小鼠肝细胞原代培养、灌注
小鼠肝细胞原代培养+灌注 我把我整理和收集战友的一些资料供你分享： 材料：小鼠 器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器 试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS 准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。 操作步骤： 1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。 2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。 3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。 4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。 6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。 7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。 8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。 10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。 肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。 目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。具体操作步骤如下： 1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。追踪肝总动脉的行程，直至脾动脉、胃左动脉显露， 结扎离断脾动脉、胃左动脉注射肝素100U。缝扎胃左静脉以及来自胰腺的第一分支，以获取足够长度的门静脉。在胰腺颈部分别用力行两道结扎，并于结扎线间将其离断，这样就可显露脾静脉与肠 远心端离断肝上下腔静脉，准备肝脏灌注。迅速切除肝脏，术中连同肝上下腔静脉周围膈肌组织缘一并切除以移动肝脏，最终将肝脏在腹膜后切除，获取肝脏。之后行门静脉插管，准备行肝脏灌注，分离肝细胞。 2:灌注液的配置： Perfusion Solution 1（g/L）： NaC L 8.000 NaH2PO4?2H2O 0.078 KC L 0.400 Na2HPO4?12H2O 0.151 NaHCO3 0.350 EDT A 0.190 HEPES 2.380 Gluc ose 0.900 磁力搅拌器使固体成分充分溶解，用1M HCL或1M NaOH调定pH 7.2～7.4（使用pH计），0.45及0.22双层滤膜负压过滤除菌，4℃保存，使用时液体温度维持在37℃（应用水浴箱）。 Perfusion Solution 2（g/L）： NaC L 8.000
肝星状细胞及其与肝脏疾病的关系
#讲座与综述# 肝星状细胞及其与肝脏疾病的关系 徐丹,卢大雷 作者单位:475000 河南省开封市医学科学研究所;475000 河南省开封市医用细胞生物学实验室 =关键词> 肝星状细胞;肝脏疾病;关系 =中图分类号> R 32912+8 =文献标识码> A =文章编号> 1674-3296(2010)06-0124-02 肝星状细胞(H SC)是细胞外基质(EC M )的主要来源细 胞,分为静止和活化2种类型[1] 。随着细胞学、分子生物学等基础医学科学的发展和应用,人们对H SC 的研究和认识不断深入,发现其在肝脏疾病中发挥着重要作用。本文就H S C 的生物学特性、活化及其调控以及H SC 与肝脏疾病的关系做一综述。 1 肝星状细胞的生物学特性 1.1 HSC 性质及功能 H SC 位于肝窦内皮细胞(SEC )和肝细胞之间的窦间隙狄氏腔内,其数量占肝脏细胞总数的15%,占肝脏间质细胞的1/3[2]。正常情况下HSC 表现为富含维生素A 脂滴的静止状态,其主要功能:储存脂肪,以供给肝细胞能量;代谢和贮存维生素A;通过其纤长突起的收缩功能调节肝窦内微循环,从而影响着肝脏的血流分布和门静脉压力;合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分;合成基质金属蛋白酶(MMP )及其组织抑制剂(T I M P);表达细胞因子及受体。1.2 H SC 生物学特性 肝脏损伤后,HSC 则激活成为肌成纤维样细胞-活化型,其生物学特征主要表现为:胞体增大,胞突伸展,胞质中脂滴消失,维生素A 含量减少;细胞大量增生,并且向肝损伤部位迁徙;表达A 2平滑肌蛋白,为活化型H SC 的标志;具有收缩功能,活化的H SC 合成内皮素增加,引起H SC 收缩,导致肝内微循环收缩和肝窦血管阻力升高;EC M 分泌增多,活化的H SC 是ECM 生产的主要来源;分泌多种细胞因子,表达多种受体,对化学因子刺激的敏感性增加;表达结蛋白、波形蛋白及神经胶原酸性纤维蛋白;释放MM P 及TI MP 。2 肝星状细胞的活化及调控 2.1 H SC 活化 在1995年由德国的G ress ner 提出了H SC 激活的/三步模式0。炎症前期:由各种病因导致肝实质细胞损伤,产生多种细胞因子,通过旁分泌作用于H SC ,从而促使HSC 大量增殖;炎症期:活化的库普弗细胞、巨噬细胞及血小板释放多种细胞因子(TGF 2A 、TGF 2B )和血小板衍生生长因子(PD GF)等,进一步刺激HSC 增殖并向肌成纤维细胞(M FB)转化[3],其中PDGF 是最强的促进H SC 增殖的刺激因子;炎症后期:激活后的HSC 产生大量的细胞因子和生长因子并通过旁分泌和自分泌作用,进一步刺激未激活转化的HSC 转变为M FB 并合成EC M 。这时即使去除致病因子,肝纤维化仍可继续发展。 2.2 H SC 活化的调控 2.2.1 PDGF:目前认为PD GF 具有明显的促有丝分裂和刺激胶原及纤维连接蛋白合成的作用。H SC 既是PDGF 的产生细胞,又是PDGF 作用的靶细胞。而PDGF 是H SC 最强的有丝分裂原,能够强烈刺激HSC 的活化、分裂和增殖。 2.2.2 转化生长因子(TGF 2B 1):TGF 2B 1具有强烈的促HSC 合成EC M 作用,TGF 2B 1还可刺激HSC 的PD GF 受体的表达,增强PDGF 的作用;TGF 2B 1亦可通过抑制MMP 合成而抑制EC M 的降解。 2.2.3 肿瘤坏死因子2A (TNF 2A ):T NF 2A 能促进HSC 的激活,刺激EC M 合成并分泌多种细胞因子作用。另外,TNF 2A 通过增加H SC 中蛋白水解酶抑制物的合成,还可抑制EC M 的降解。Andus 等研究表明:T NF 2A 对活化的H S C 的增殖和凋亡均起到抑制作用,可能是慢性肝损伤时活化的H SC 寿命延长的内在机制。 2.2.4 胰岛素样生长因子21(I GF 21):I GF 21是一种细胞上类似胰岛素原的多肽促分裂原,能刺激H SC 的活化和增殖,通过对细胞外信号调节激酶和磷脂酰肌醇232激酶的激活,增加胶 原的合成[4] 。 除此之外细胞因子白介素26、白介素21、瘦素等也对HSC 的活化有调节作用。总之,H SC 活化过程是自分泌或旁分泌多种细胞因子协同作用的结果,但这些不同因素可能通过相似的细胞内途径发挥作用。3 肝星状细胞与肝脏疾病 3.1 脂肪性肝炎 脂肪性肝病主要表现为肝实质细胞的脂质过度沉积。现有证据表明,肝星状细胞内脂质的量、脂滴类型和其表面脂蛋白受体的改变与H SC 的活化和增殖有关[5]。F raser 等研究表明,酒精性肝损伤在脂肪肝早期阶段,肝组织炎症、坏死不明显或缺乏时HSC 即已激活。 非酒精脂肪肝一般需在脂肪性肝炎的基础上才能发展为肝硬化,即按传统的细胞变性坏死-炎症-纤维增生模式发展,提示非酒精性脂肪性肝炎是非酒精性脂肪肝发生肝硬化的必经阶段。但是研究发现,少数非酒精性脂肪肝患者在无明显肝组织炎症和肝细胞坏死的情况下发生肝纤维化,这可能是脂肪肝对肝细胞损伤本身即是H SC 和EC M 增多的启动因素[6]。3.2 病毒性肝炎 病毒性肝炎是由多种不同肝炎病毒引起的一组以肝脏损害为主的传染病,其病理表现为免疫功能紊乱、特异性免疫反应增强、自身免疫反应明显、肝纤维化以及病毒浸润。有报道显示,在慢性乙型肝炎肝纤维化时,由于乙型肝炎病毒的直接作用和其介导的免疫病理导致库普弗细胞的大量浸润,肝细胞碎片激活库普弗细胞使其分泌TGF 2B 1、TGF 2B 1进一步激活H SC 和其他间质细胞导致的大量分泌[7]。 3.3 肝硬化 在我国,肝硬化主要由HBV 感染或酒精性肝病所致,最近发现由于肝病引起肠道菌群失调,内毒素吸收增多,可改变星状细胞Toll 样受体4,增强转化生长因子激活星状细胞的活性,有利于肝纤维组织增生。乙型肝炎病毒X 蛋白也可以直接或通过激活细胞因子而激活星状细胞,刺激纤维组织增生[8]。 3.4 肝癌 肝细胞肝癌(HCC)发生的过程中常伴有明显的
小鼠肝脏石蜡切片—实验报告
实验九 显微摄影――小鼠肝脏结构 年级专业 *班 *组 学号 姓名 图版说明： 图1：小鼠肝脏横切部分结构，示肝小叶（A ），静脉血管（B ）。 图2：图1（α部位）的放大，示肝小叶（C ）。 图3：示肝小叶（D ）。 图4：示静脉血管（E ）。 图5：示肝细胞（F ），肝细胞细胞核（G ）。 图6：图2（β部位)的放大，示上皮细胞（H ），上皮细胞细胞核（I ），肝血窦（J ），中央静脉（K ）， 肝动脉（L ），血细胞（M ）。 结构说明： 肝脏是脊椎动物身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面扮演着氧化，储存肝糖，解读等功能。肝脏由肝小叶组成，肝小叶是肝脏的基本组成成分，它来执行肝脏的基本职能。而肝小叶又是由肝细胞组成，当肝细胞大量损坏时，肝小叶不能正常工作，影响肝脏正常生理功能，而出现各种各样的症状。肝小叶成棱柱状，中央有一条中央静脉穿过，肝细胞围绕中央静脉成放射状排列。 肝细胞是一种高度分化并具有多种功能的细胞，胞质内各种细胞器丰富而发达，并含有糖原，脂滴等内涵物。细胞器和内涵物的含量与分布常因细胞的功能状况或饮食变化而变动。一般肝细胞里线粒体含量都比较多，遍布于胞质内，为肝细胞的功能活动不断提供能量。 肝细胞核大而圆，居中央，染色质丰富色浅，核膜清楚，核仁1至数个。部分肝细胞（约25%）有双核，有的肝细胞的核体积较大，为多倍体核。 肝血窦位于肝板之间，互相吻合成网状管道。血窦腔大而不规则，血液从肝小叶的周边经肝血窦流向中央，汇聚到中央静脉。 1 A B C 2 D 3 E 4 G F 5 50μm I 6 50μm α β 500μm 200μm 100μm 100μm
肝星状细胞功能的研究进展
肝星状细胞功能的研究进展 刘伟贺福初姜颖 【关键词】肝星状细胞；肝纤维化；肝再生?免疫 Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｈｅｐａｔｉｃｓｔｄｈｔｅｃｅｌｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｒｅｓｅａｒｃｈ删阡兢ＨＥＦｕ－ｃｈｕ，ＪＩＡＮＧＹｉｎｇ． ［ＫｅｙｗｏｒｄｓｌＨｅｐａｔｉｃｓｔｅｌｌａｔｅｃｅｌｌ；Ｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓ；Ｌｉｖｅｒｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ［Ｖｉｍａｕｔｈｏｒ’ｓａｄｄｒｅｓｓ］ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｒｏｔｅｏｍｉｃ＆ＢｅｉｊｉｎｇＰｒｏｔｅｏｍｅＲｅｓｅａｍｈＣｅｎｔｅｒ，，ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲａｄｉａｔｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２０６，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＪＩＡＮＧＹｉｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｙ＠ｈｕｐｏ．ｏｒｇ．ｃｎ肝星状细胞（ＨＳＣ）位于肝窦状隙的Ｄｉｓｓｅ腔，介于有窗孔（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｅｄ）结构的肝窦内皮细胞和肝实质细胞之间ｆ１１。人们对ＨＳＣ的来源还不清楚，最近有研究表明其分化自骨髓内的干细胞１２Ｊ。同时，ＨＳＣ也表达神经分子如神经胶质酸性蛋白和突触素，人们现在对ＨＳＣ的非免疫功能了解比较多，包括维生素Ａ代谢、肝纤维化，肝血流量调节和肝再生。近几年的研究发现拓展了传统上认为的ＨＳＣ功能范围。肝脏免疫是肝内多种细胞，包括库普弗细胞、内皮细胞、实质细胞和多种淋巴细胞如自然杀伤细胞、自然杀伤Ｔ淋巴细胞及Ｔ淋巴细胞等通过复杂相互作用引起的ｆ３Ｊ。因此，分析肝脏特定细胞类型的功能是一个巨大的挑战。最近的研究表明，ＨＳＣ在维甲酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ）介导Ｔ淋巴细胞分化过程中起重要作用，同时也是肝内一种潜在的祖细胞。 一、ＨＳＣ的非免疫功能 １．维生素Ａ的稳态平衡：维生素Ａ在维持视力，保持皮肤完整性和抵御感染中起重要作用。ＨＳＣ储存了人体的大部分视黄醇（ｒｅｔｉｎ０１），是维生素Ａ吸收、存储和代谢的主要场所。视黄醇和视黄酯（ｒｅｔｔｎｙｌｅｓｔｅｒ）在小肠以糜乳颗粒的形式从毛细淋巴管吸收。肝实质细胞清除糜乳颗粒后吸收视黄酯，视黄醇结合蛋白与之结合并将其水解为视黄醇。ＨＳＣ通过细胞表面受体吸收视黄醇结合蛋白结合的视黄醇，将其酯化后ｌ猢旨滴存储，或酯化后与视黄醇结合蛋白结合，然后分泌出细胞。此外，ＨＳＣ通过乙醇脱氢酶（ｅｔｈａｎｏｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）氧化视黄醇为视黄醛（ｒｅＵｎａｌ）。视黄醛是视网膜上光感受器中视紫红质的重要组分。视黄醛也可被视黄醛脱氢酶（ｒｅｔｉｌａ．ａｌｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）氧化成具有转录调节活性的维甲酸。 ２．细胞外基质（ＥＣＭ）生成和肝纤维化发生：正常肝脏中，ＥＣＭ的合成和降解是动态平衡的，ＨＳＣ合成ＥＣＭ的同时也分泌降解ＥＣＭ的基质金属蛋白酶来维持肝脏正常的三维结构。在分泌基质金属蛋白酶的同时，ＨＳＣ也分泌金属作者单位：１０２２０６北京，军事医学科学院放射与辐射医学研究所．北京蛋白质组研究中心、蛋白质组学国家重点实验室刘伟男，２４岁，硕士研究生。 通讯作者：姜颖，Ｅｍａｆｌ：ｊｉａｎｇｙ＠ｈｕｐｏ．ｏｒｇ．ｃｎ ?继续教育园地? 蛋白酶组织抑制弃畸，基质金属蛋白酶与金属蛋白酶组织抑制剂结合后失活。肝损伤发生后，金属蛋白酶组织抑制剂的持续表达抑制了基质金属蛋白酶的活性，导致ＥＣＭ降解减少，引起ＥＣＭ的大量堆积。ＥＣＭ的积聚紊乱造成肝纤维化可能发展成为不可逆的肝硬化或肝衰竭。各种因素引起的肝脏损伤，如病毒感染、乙醇及代谢病，均会导致ＨＳＣ的活化，从而破坏这一动态平衡，导致肝纤维化发生。静止的ＨＳＣ活化后转分化为肌成纤维样细胞，这一过程依赖于神经营养因子受体ｐ７５ＮＴＲｔ４ｊ。活化的ＨＳＣ产生大量的胶原，结构糖蛋白样纤连蛋白、蛋白聚糖和葡萄糖胺聚糖。此外，除了活化的ＨＳＣ外，其他一些细胞如库普弗细胞、肝门成纤维细胞和肌成纤维细胞也促进肝纤维化的发生。ＨＳＣ的多种刺激物中，转化生长因子（ＴＧＦ）Ｄ处于肝纤维化的中心位刮纠。ＴＧＦＤ有多种细胞来源，可活化ＨＳＣ，诱导胶原合成。活化的ＨＳＣ自身也分泌大量的ＴＧＦＤ，在纤维化过程中形成正反馈环路。过氧化物酶体增生物激活受体Ｙ是类固醇／甲状腺激素核受体超家族成员之一，在代谢疾病如糖尿病中起作用，其与视黄醇类Ｘ受体形成异源二聚体调节基因转录和细胞分化，抑制ＨＳＣ活化，抑制纤维化的发生。 ３．收缩功能：活化的ＨＳＣ具有肌成纤维细胞的功能，能像平滑肌细胞那样收缩。这是由于活化的ＨＳＣ对多种血管活性物质如内皮素和血管紧张素Ⅱ刺激发生收缩反应。钙依赖的肌球蛋白轻链激酶或钙依赖的Ｒｈｏ激酶通路介导的肌球蛋白磷酸化是ＨＳＣ收缩的必要条件。受到血管活性物质刺激后，ＨＳＣ会调节肝门静脉管的直径，影响肝门静脉血压。ＨＳＣ在肝门静脉高压中的作用仍然不清楚，控制ＨＳＣ收缩和舒张的细胞装置和信号通路也仍需要进一步研究。 ４．ＨＣＳ与肝再生相关：静止ＨＳＣ表达ＣＤ９５Ｌ和其他死亡受体配体．它们通过配体依赖的表皮生长因子受体磷酸化发挥有丝分裂原作用，同时，ＣＤ９５Ｌ诱导的ＣＤ９５酪氨酸硝化触发抗凋亡信号的发生。在静止的ＨＳＣ中，ＣＤ９５Ｌ不诱导细胞凋亡，但可促进ＨＳＣ增殖，使得ＣＤ９５酪氨酸硝化迅速灭活，这表明静止的ＨＳＣ协助参与肝损伤后的再生ｆ６ｌ。肝再生的起始阶段，实质细胞在缺少生长因子时是通过半自主方式增殖，直到受到活化的ＨＳＣ分泌的转化生长因子Ｄ和白细胞介素（ＩＬ）６介导而终止增殖信号。活化的ＨＳＣ可能在特定时间点释放终止信号（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ），抑制实质细胞的增殖，使肝小叶结构恢复到正常。同时，ＨＳＣ可以分裂多种肝细胞有丝分裂原，如肝细胞生长因子、表皮生长因子，上皮形成素和多功能生长因子，这些物质可能和肝再生相关Ｉ’１。最近有研究发现ＨＳＣ的一个亚群表达ＣＤＩ３３，而ＣＤＩ３３是一种干细胞标记分手钔，在多个组织中被鉴定为干细胞样细胞的一个标志分子，如结肠癌。这暗示ＨＳＣ可能在发育的或成人肝中具有潜在多能性。 万方数据