鼠肝星状细胞分离方法汇总
1、大鼠原代肝星状细胞的分离培养方法汇总：
方法一雄性SD大鼠，体重400—500g。
[操作步骤]
1.大鼠以戊巴比妥钠麻醉，同时皮下注射5000U肝素钠抗凝；
2.皮肤常规消毒后打开腹腔，钝性分离门静脉及下腔静脉；
3.以16号套管针作门静脉插管，37℃灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈，
剪开下腔静脉放血后结扎。立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环；
4.以0.1％链霉蛋白酶E 5mL/min灌注3-4分钟，0.03％Ⅱ型胶原酶5ml/min
灌注3-4分钟；
5．取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006％、DNA酶至终浓度为10pug/ml。37℃5％C02孵箱内消化30分钟；
6.过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中，
对照管中加入等量培养液;
7.4℃800g平抛离心30分钟。吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次；
8.加入五血清RPMll640培养液，于37℃5％C02孵箱孵育15分钟：吸取细胞
悬液，在6孔板中以含20％胎牛血清的RPMl1640培养。24小时后换液，此后每3天换液1次。
方法二：
[动物]
雄性纯种Wistar大鼠，体重400-500g，普通饲料喂养。
[操作步骤]
1.大鼠用戊巴比妥钠麻醉，无菌操作下打开腹腔；
2.经门静脉肝素化，取出肝脏，灌流液灌注10-20分钟(37℃)，至肝细胞略显
黄色；
3.链霉蛋白酶E溶液(0.02％)反复灌注10-20分钟(40—41℃)，胶原酶溶液反复
灌注10-15分钟(40—4l℃)，至肝组织完全软化；
4.两液合于器皿中，钝性撕碎肝组织，置三角烧瓶内37~C下振荡消化20分
钟，三层纱布过滤；
5.无钙培养液洗2次，将细胞悬液加至三层非连续密度梯度最上层(从下至上
为1.080、1.058、1.053)，再在上面加一层无钙培养液，16000r／min离心30分钟(20℃)；
6.轻轻吸取上层培养基与1.053层之间的细胞，细胞经无钙培养液洗2次后，
调成(1-5)XlO5/ml浓度，接种于50ml培养瓶(内含20％小牛血清的RPMl1640培养液)；
7.培养28h后换含新鲜10％小牛血清的RPMl1640培养液，以后每隔3—4天
换液1次。
试剂：胶原4、DNase1、DMED、胎牛血清、Percoll、链酶蛋白酶
2、分离当日氯胺酮0.2ml/100ml体重、甘肃150U肌肉注射麻醉
3、严格消毒，置于无菌超净台，仰卧位固定
4、取大十字切口，上至剑突，下至耻骨联合，左右至两侧腋中线，皮瓣外翻，
显露腹腔所有脏器。
5、将小肠翻至鼠体左侧，可见肝门出门静脉由脾静脉和肠系膜静脉汇合而成，
在双侧肾静脉上方游离肝下腔静脉。
6、肝上游离肝膈面，下压肝脏剪短镰状韧带至肝上下腔静脉。
7、将9号输液针插入肝门静脉，动脉夹固定，转动灌流泵。同时迅速钳夹肝上
下腔静脉，剪开事先游离好的肾静脉肝下腔静脉，开始原位灌注。
8、首先使用加葡萄糖1g/L、甘肃500U/L的D-Hank’s也200ml，经水浴加热到
39℃，流苏20ml/min，尽量将肝脏内淤积的红细胞冲出，
9、使用酶灌注液0.05mol/L Ca2+、0.05%胶原4、D-Hank‘s液100ml，流速5ml/min，
消化肝脏。
10、20min后使用无菌剪刀将肝组织剪下放入洁净的培养皿，进入细胞室。
11、在培养皿中去除肝包膜，将肝脏粉碎成糊状，放入0.05%胶原4、
0.001%DNase1和5.3%FCS-HI的PBS中，37水浴摇动30min，使肝组织充分得
到消化
12、将消化好的肝组织用200目筛网过滤，未通过的肝组织用玻璃注射器针
芯研磨，与培养液冲洗。
13、滤过好的肝组织放入50mlFalcon离心管中，加入培养液只50ml，20℃100g
离心5min，去除大部分肝实质细胞
14、上清液转入另一离心管中350g离心10min
15、去沉淀重悬于50ml培养液中，再次350g离心10min
16、沉淀重悬于16ml的PBS中，分两份分别加入已铺好梯度的Percoll顶层
17、Percoll的密度梯度分3层：由上至下依次为：
20% 1.012g/ml 20ml
35% 1.014g/ml 15ml
50% 1.018g/ml 10ml
18、铺好后4℃900g离心30min，轻轻取出，不要摇动液面，可见20%层中
间有一混浊带
19、用16号针头插入液面下此处抽吸约10ml放入离心管
20、及培养液至50ml，900g离心10min，沉淀重悬于10ml混合培养液中，
加胎牛血清
21、细胞计数，台酚蓝判断活力
液体配制：
1、预灌注液：葡萄糖1g/L、HEPES2.38g/L的D-Hanks，pH7.2-7.4，过滤除菌
2、链酶蛋白酶（现用现配）：链酶蛋白酶50mg，D-Hank50ml
3、胶原酶（现用现配）：胶原酶12.5mg，D-Hank50ml
4、震荡液（现用现配）：链酶蛋白酶40mg，D-Hank50ml
5、Nycodenze液：10.387%和18.8%两种浓度
分离方法
1、灌注：
乙醚麻醉，碘伏消毒大鼠腹部，U形打开腹腔暴露肝脏，门静脉插管，预灌注液39℃灌注20ml/min至肝脏完全变白，输液管前段一1ml肝素稀释液代替，40℃链酶蛋白酶液和37℃胶原酶液5-10ml/min离体循环灌注各30min
2、再次消化：
将肝脏移入超净工作台已硅化的培养皿中，去除被膜，小剪刀剪碎，倒入有震荡液的硅化三角瓶中，水浴摇床震荡30min（200-250次），向三角瓶内加入4℃的DMEM20ml、DNase5ml，加D-Hank至45ml，充分轻轻吹打，离心弃上清，再重复1遍，弃上清，加DMEM约7.5ml，混匀悬液
3、密度梯度
50ml离心管，先加10.387%Nycodenze10ml，再将吸管深入到试管底部慢慢匀速加入18.8%的Nycodenze10ml，再在液面上缓慢加入细胞悬液20000r/min 离心25min 10℃加速离心后，可见上面的一层白色细胞层为未活化的星状细胞，小心吸出至2个15ml的离心管内
4、洗涤提纯HSC
向离心管中加入新的DMEM至12ml，充分吹打混悬，洗涤3次，用喊20%胎牛血清的DMEM悬浮，40g离心，弃沉淀。
5、培养方法
取1滴悬液至计数板上，盖上盖玻片，在倒置显微镜下观察技术细胞
1×106接种于6孔板，12h后换液，以后每3天换一次
6、细胞活率鉴定
台酚蓝拒染实验：取2滴细胞悬液加2滴0.4%台酚蓝，混匀，3min内计数活细胞数
7、HSC纯度鉴定
Desmin和GFAP免疫细胞组化鉴定
在接种细胞前向培养孔内滴入1滴无菌PBS，将用多聚赖氨酸（细胞专用）包被的无菌盖玻片放入孔内，使其紧贴培养板，然后以1×105接种，24h后将盖玻片取出，4℃丙酮固定15min，自然风干，行desmin和GFAP免疫组化双抗单染色
8、HSC自然活化形态学观察
刚分离出的HSC边界清楚，细胞圆形，透亮，折光性强
培养数小时后，见细胞部分贴壁，
24h后细胞体积稍增大，折光性较前减弱
48h后见细胞开始伸出伪足，有的呈梭行，有的蝌蚪形
7d后细胞变长，胞体较大，呈现典型的纤维细胞样，
14d后，细胞全部活化
一种改良方法分离大鼠肝星状细胞
1、大鼠用氯胺酮100mg/kg腹腔注射麻醉，腹部备皮75%酒精消毒3次，倒U剪开腹
壁充分暴露肝脏及门静脉，18套管针内静脉穿刺并保留置管，先后用20ml注射器抽吸无消化酶喊125U/ml甘肃的37℃D-Hank和无甘肃的37℃Hank，经门静脉在体灌洗肝脏，同时剪断下腔静脉放血，肝脏灌洗至流出液无血迹，肝脏变灰白，保留置管迅速游离肝脏，离体后的肝脏在超净工作台先用喊0.05%胶原酶、0.1%连蛋白酶的37℃Hank25ml从门静脉和肝静脉处用注射器反复灌注消化至肝脏软化。去除肝脏包膜和纤维组织，加入含0.05%DNase1的37℃Hank25ml磁力搅拌30,min，消化后的肝组织液200目筛网过滤得到粗细胞液，加入DMEM终止消化，500r/min 5,min低速离心去除沉淀肝细胞及细胞碎片，上清液用4℃12%Nycodenze连续梯度4℃3200r/min 17min分离不同比重细胞，小心吸取界面最上层的HSC，4℃DMEM1500r/min5min洗涤细胞，细胞用含20%胎牛血清的DMEM悬浮。分离后的HSC接种于细胞培养皿，3d7d分别进行desmin SMA免疫荧光。
小鼠的肝细胞培养没有尝试过，我自己一直是做大鼠，方法还是比较成熟，成功率一般在80％以上，附上步骤，希望能对你有所帮助：
1.Wistar大鼠，体质量180—220 g，普通块料喂养，随意饮水，室温1 8－
22℃，每目光照1 2—1 4 h，术前禁食12 h．
2.IV型胶原酶、地塞米松、胰岛素及HGF为Sigma公司产品；RPMI1640培养
基为Gibco公司产品．
3.大鼠用20 g/L戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉(30 mg／kg)，同时腹腔内注射
肝素钠溶液200 U．消毒皮肤后，取正中切口进入腹腔．显露门静脉后在
距肝门2 cm处插入18号导管，导管与一次性输血器相接，后者连接输液瓶（如果不好放置，可以改用50ml注射器，但要注意控制好速度），先以
30mL／min的速度输注无钙镁的Hanks液(含EDTA 1 mmol／L)200 mL，夹闭
肝上下腔静脉，在肝下下腔静脉插入16号导管放出积血积液，再输注含
0.5 g／L IV型胶原酶的Hanks液100 mL，输注速度为15 mL／min，取下肝脏
,置于含4℃ Hanks液的平皿中，去除肝包膜及血管，钝性撕裂肝组织
(注意：千万不要用剪刀剪碎，会损伤细胞)，多层纱布过滤，制成细胞
悬液，将此悬液以100目及200目不锈钢网过滤，以500 -1000rpm离心2 min,
弃上清，以4℃ Hank液清洗并离心3次，用4 g/L台盼蓝进行染色判断细胞
活率，用血细胞计数板计数细胞浓度并计算细胞产量．
5.将分离、纯化的肝细胞用合成培养基(含RPMI 1 640 80 mL，新生小牛血清
20 mL，HGF 5 ug／L，地塞米松l0 -7mol／L、牛胰岛素10 -8mol／L，青霉素
100 kU／L，链霉素100 kU／L)稀释成0.5×109／L，在37℃，50 mL／L C02
条件下培养，每24 h更换培养基1次，每天在倒置相差显微镜下观察细胞
生长情况．
大鼠肝星状细胞的浮力密度范围在 1.047-1.061g/ml左右, 分细胞的时候可以上限订的高一些, kupffer的在1.083-1.095,你可以根据这个去计算下你需要的剃度.但这只是大致的范围,具体到每个细胞来说,肝细胞也有密度小的，很多时候剃度离心下来,发现有些肝细胞也浮上来了
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法 原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。 乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点： 1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。 新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。 2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。 常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。 3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。 新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。 4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。 分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。 5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。 操作过程： 手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中； 将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状； 加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5） 放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。 48h换液后可得心肌细胞。观察心肌细胞形态及搏动状况。
肝星状细胞详解
肝星状细胞 肝脏星状细胞占肝脏固有细胞总数的15%，占非实质细胞的30%左右。HSC存在于Disse腔中，呈梭形或多边形，胞浆内有多个富含维生素A的脂滴，其细长的突起向外延伸环绕在血窦内皮细胞外面，是体内储存视黄醛衍生物的首要部位。在正常肝脏中，星状细胞处于静止状态，不表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA），增殖活性低，合成胶原能力低，其主要功能是贮存视黄醛类。 中文名肝星状细胞外文名hepatic stellate cell，HSC 科室肝胆外科 简介 肝星状细胞是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC 作为最终靶细胞。肝星状细胞激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFC)，各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，正常情况下肝星状细胞处于静止状态。当肝脏受到炎症或机械刺激等损伤时，肝星状细胞被激活，其表型由静止型转变为激活型。激活的肝星状细胞一方面通过增生和分泌细胞外基质参与肝纤维化的形成和肝内结构的重建，另一方面通过细胞收缩使肝窦内压升高。 背景 早在1876年，德国CarlvonKupffer在使用氯化金染色法研究肝脏的神经系统时无意中发现肝血窦周围有呈星状形态的细胞，将其命名为星状细胞（sternzellen）。1898年，Kupffer用印度墨水对兔肝进行染色时，观察到能吞噬墨水颗粒的肝巨噬细胞，也就是后来人们为纪念Kupffer而命名的Kupffer细胞。因为同样为星状形态，Kupffer 误把肝巨噬细胞和星状细胞混为一谈，认为星状细胞就是肝巨噬细胞。这种观点在当时得到了广泛的认同。直到1951年，日本学者ToshioIto通过光学显微镜发现人的肝窦周围有一种富含脂质小滴、并且有网状纤维包绕的细胞，并将之命名为伊东细胞（ItoCel1s）或贮脂细胞（fat-storingcells）。1958年，Suzuki用银染色法在Disse腔内观察到这种星芒状的细胞，发现其突起与肝脏内的自主神经末梢相连系，他认为这种细胞能将来自肝内自主神经的冲动传递给肝实质细胞，并将其称为“间质细胞”；1966年，Bronfenmajor证实了伊东细胞的发现，又给该细胞起新名叫脂细胞（1ipocytes）；1971年，KenjiroWake采用电镜，结合氯化金染色法和苏丹红染色法发现Ito所描述的伊东细胞和Kupffer所发现的星状细胞原来是同一类型的细胞，并指出上述细胞既不同于肝窦内皮细胞，也不
肝星状细胞与肝纤维化(一)
肝星状细胞与肝纤维化(一) 〔关键词〕肝星状细胞；肝纤维化；活化 各种病因所引起的慢性肝病绝大多数都有肝纤维化(HF)，其中25％～40％最终发展为肝硬化甚至肝癌，是一类世界性的严重危害人们健康的主要疾病。在过去的几十年里，HF能否发生逆转一直是医学界有争议的问题，现已知HF是一个可逆性的病变，而肝硬化是不可逆的〔1〕。HF是对各种病因所致的慢性肝损伤的一种修复反应，其实质是肝内细胞外基质(ECM)合成大于降解导致大量ECM过度沉积。研究证实，肝星状细胞是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维细胞样细胞(MFLC)，是HF发生、发展的核心环节。各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，通过使其转化为肌成纤维细胞这一共同复杂的网络系统，参与HF的发生及进展〔2〕。在HF的恢复期，有与肝脏瘢痕降解一致的广泛的HSC凋亡〔3〕，因此，诱导活化HSC的凋亡可使HF发生逆转。目前，活化HSC已被看作抗HF治疗的主要靶点。现就HSC与HF的关系作一综述。1HF的发病机制 近年来的研究发现，尽管不同病因导致肝病的发病机制不同，但HF发生的最终共同途径均是HSC，当各种致病因素持续作用于肝脏时，通过复杂机制激活HSC。活化的HSC通过旁分泌与自分泌作用合成分泌多种ECM，同时合成、释放大量基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)，抑制胶原酶、明胶酶等金属蛋白酶(MMPs)活性，减少ECM降解，导致细胞外基质合成大于降解，最终过量积聚在肝内形成HF。 2HSC活化的机制 2.1HSC的形态学和生物学特征HSC又称储脂细胞、Ito细胞、维生素A储存细胞等，是肝脏间质细胞之一，位于肝细胞与肝窦内皮细胞之间的窦周隙(Disse间隙)内，是目前公认的HF 形成中主要产生ECM的细胞。HSC正常时呈静止状态，形状不规则，胞体呈卵圆形或不规则形，常伸出数个星状突起，胞浆中富含维生素A和甘油三酯的脂滴。除储存维生素A脂滴外，HSC还具有收缩功能，可调节血管功能和肝窦血流；此外，HSC也参加正常肝脏的ECM 改建。当各种致病因素持续作用于肝脏时，通过复杂机制激活HSC。HSC的激活可人为地分为两个阶段,即启动阶段及持续活化阶段〔5〕。 2.2启动阶段HSC活化的启动是邻近细胞(如肝细胞、Kupffer细胞、肝窦内皮细胞、血小板等)旁分泌作用的结果。肝损伤早期，肝窦内皮细胞(SEC)通过产生变异的纤维连接蛋白(LN)及使无活性的转化生长因子转化为具有促胶原合成活性的活化型，变性坏死的肝细胞通过产生脂质过氧化物，Kupffer细胞通过诱导HSC上血小板源生长因子(PDGF)受体的表达及使无活性的转化为活性型，血小板通过产生PDGF、、表皮生长因子(EGF)等细胞因子均参与启动HCS的活化。另外，ECM的早期改变、脂质过氧化物等也参与活化的启动。其结果是使HSC发生基因表达及表型的改变，表现为转录活化、信号分子活化及诱导早期结构基因表达，使胞膜上表达细胞因子、生长因子受体，如PDGF受体、TGF受体、血管内皮生长因子(VEGF)受体等，产生对这些介质分子的应答能力，增殖活化为肌成纤维细胞。 2.3持续激活阶段是HSC自分泌及旁分泌共同作用的结果。HSC活化启动后发生一系列表型改变，包括：细胞增生：特别在炎症坏死区域新形成的纤维间隔内，致细胞数量增多；表型转化：由维生素A储存型转化为广谱ECM合成表型，致ECM合成增多；产生收缩性：表达平滑肌肌动蛋白可诱导微循环改变及血小板凝聚；趋化性：向损伤区移行，致损伤区纤维形成细胞增多；细胞因子及其受体表达增强：对化学因子刺激的敏感性增加；表达黏附蛋白受体——整合素家族：整合素是一组二聚体细胞受体，包括胶原、FN受体、纤维连接蛋白(LN)受体，其表达参与介导细胞与基质的相互作用；释放胶原酶及其抑制物：Ⅳ型胶原酶的释放破坏内皮下基质，通过反馈促进HSC转化；而金属蛋白酶抑制物的分泌可减少新生成胶原的降解，最终导致ECM的过度沉积。HSC通过自分泌作用不断刺激自身的
乳鼠心肌细胞原代培养综述
乳鼠心肌细胞原代培养综述 【摘要】：目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但是心肌细胞成活率、搏动率，纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。 【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养 1．新生大鼠鼠龄的选择 乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。 2．消化酶的选择使用 分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。 3．污染防治 虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套，操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段。除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。 (2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则
鼠肝星状细胞分离方法汇总
1、大鼠原代肝星状细胞的分离培养方法汇总： 方法一雄性SD大鼠，体重400—500g。 [操作步骤] 1.大鼠以戊巴比妥钠麻醉，同时皮下注射5000U肝素钠抗凝； 2.皮肤常规消毒后打开腹腔，钝性分离门静脉及下腔静脉； 3.以16号套管针作门静脉插管，37℃灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈， 剪开下腔静脉放血后结扎。立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环； 4.以0.1％链霉蛋白酶E 5mL/min灌注3-4分钟，0.03％Ⅱ型胶原酶5ml/min 灌注3-4分钟； 5．取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006％、DNA酶至终浓度为10pug/ml。37℃5％C02孵箱内消化30分钟； 6.过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中， 对照管中加入等量培养液; 7.4℃800g平抛离心30分钟。吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次； 8.加入五血清RPMll640培养液，于37℃5％C02孵箱孵育15分钟：吸取细胞 悬液，在6孔板中以含20％胎牛血清的RPMl1640培养。24小时后换液，此后每3天换液1次。 方法二： [动物] 雄性纯种Wistar大鼠，体重400-500g，普通饲料喂养。 [操作步骤] 1.大鼠用戊巴比妥钠麻醉，无菌操作下打开腹腔； 2.经门静脉肝素化，取出肝脏，灌流液灌注10-20分钟(37℃)，至肝细胞略显 黄色； 3.链霉蛋白酶E溶液(0.02％)反复灌注10-20分钟(40—41℃)，胶原酶溶液反复 灌注10-15分钟(40—4l℃)，至肝组织完全软化； 4.两液合于器皿中，钝性撕碎肝组织，置三角烧瓶内37~C下振荡消化20分 钟，三层纱布过滤； 5.无钙培养液洗2次，将细胞悬液加至三层非连续密度梯度最上层(从下至上 为1.080、1.058、1.053)，再在上面加一层无钙培养液，16000r／min离心30分钟(20℃)； 6.轻轻吸取上层培养基与1.053层之间的细胞，细胞经无钙培养液洗2次后， 调成(1-5)XlO5/ml浓度，接种于50ml培养瓶(内含20％小牛血清的RPMl1640培养液)； 7.培养28h后换含新鲜10％小牛血清的RPMl1640培养液，以后每隔3—4天 换液1次。
小鼠肝脏取材步骤
小鼠肝脏组织取材步骤 小鼠肝脏组织取材步骤，并列出完成此次实验所需要的试剂、仪器、材料等相关物品及实验人员安排情况。 材料：小鼠 试剂：DMEM 戊巴比妥钠 75%酒精 PBS 器械消毒液戊二醛 仪器：解剖台备皮刀弯盘组织剪眼科剪手术刀柄刀片血管钳眼科镊 培养皿无菌手套 实验人员安排：小鼠养殖管理组准备工作组实验操作组 实验步骤: 1. 取材前夜禁食，自由饮水。 2. 小鼠称重，按照50mg/kg的比例用5ml的注射器配合针头抽取戊巴比妥钠备用。 3. 正左手的小指和无名指抓住大鼠的尾巴，另外三个手指抓住大鼠的颈部，使大鼠头部向向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。右手持注射器，从腹部近腿根处刺入后再腹部皮下穿行深入，动作轻柔，缓慢注射。注射完药物后，缓缓拔出针头，手指按住针口对小鼠腹部轻柔按摩，促进麻醉药物的吸收，掐小鼠尾部检测小鼠麻醉程度。 4.将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠整个胸部和腹部，修剪去腹部毛发，75%酒精消毒。 5.沿腹侧正中线自阴茎上源由下而上剪开腹部皮肤直至剑突，向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织，暴露腹壁浅肌层。沿白线钝性分离腹壁肌肉，剪开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起，显露肝门，眼科剪剪除肝脏周围结缔组织和血管。 6.结扎剪断肝门管道系统，钝锐结合完整取出大鼠肝脏，放置于无菌培养皿，生理盐水冲洗，称重并记录。①切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH 7.4)或4-戊二醛固定；②左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 7.切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。
成年大鼠心肌细胞分离方法
成年大鼠心肌细胞分离方法 【摘要】目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。 【关键词】大鼠; 心肌细胞; 细胞分离 【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedure cryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rod shaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult rat ventricular cardiomyocytes can be
肝星状细胞激活的分子机制与抗肝纤维化治疗 (2)
第28卷第2期2007年3月武汉大学学报(医学版) Medical Journal of Wuhan Univer sity Vol.28No.2Mar,2007 课题来源:国家自然科学基金资助项目(编号:30371666)作者简介:李婧婷,女,19832,医学硕士生,主要从事肝纤维化机制研究通讯作者:汪晖,女,19632,教授,博士生导师,主要从事生物化学与分子药理学研究 肝星状细胞激活的分子机制与抗肝纤维化治疗 李婧婷 汪 晖 廖长秀 平 洁武汉大学医学院药理学系 湖北 武汉 430071 摘要 肝星状细胞(H SC)激活是肝纤维化发生的中心环节,其激活过程可分为始动阶段(旁分泌刺激和转录调控因素启动级联瀑布式的细胞反应)和持续阶段(旁分泌或自分泌刺激和细胞外基质重建共同维持HSC 活化的表型反应)。肝脏中多种细胞和细胞因子参与调节了HSC 的激活过程。活化型HSC 的表型变化主要包括细胞增殖、收缩和纤维形成等。抗肝纤维化治疗策略主要包括调控HSC 活化增殖或促其凋亡、抑制胶原合成或促其降解、细胞因子治疗和间充质干细胞治疗等。 关键词 肝纤维化;肝星状细胞;激活;分子机制 中图分类号 R657.3+1 文献标识码 A 文章编号 167128852(2007)022******* Molecular Mechanism of Hepatic Stellate Cell Activation and Strategies of Anti 2fibrosis Therapy LI Jingting,WANG Hui,LIAO Zhangxiu,PING Jie D ept.of P ha rma cology ,School of Med icine ,Wuhan Univer sity ,Wuhan 430071,China Abstract The activation of hepatic stellate cell has been considered as the key step of liver fibr osis,mainly classified as initiation phase (paracr ine stimulation and transcriptional events initiating a cascade of cellular r esponses)and per petuation (paracrine and autocrine cytokine activity and ECM r emodeling sustaining the activated phenotype).Multiple cells and cytokines in liver play vital roles in regulating stellate cell activation.Major phenotypic featur es of activated hepatic stellate cell activation include proliferation,contractility,fibrogenesis,matrix degradation,chemotaxis,white blood cell chemoattraction,retinoid loss and cytokine release.Currently anti 2fibrotic therapy str ategies mainly include regulating the activating pr ocess,proliferation and ap 2optosis of hepatic stellate cells,inhibiting collagen synthesis or promoting collagen degradation,gene therapy and infusion of mesenchymal stem cells. Key Words Liver Fibrosis;H epatic Stellate Cells;Activation;Molecular Mechanism 各种刺激因素皆可引起肝细胞的变性和坏死,继而形成肝纤维化甚至肝硬化。细胞外基质(extra 2cellular matrix,ECM)积聚是大多数慢性肝病伴有的病理改变。肝星状细胞(hepatic stellate cell, H SC)是肝内胶原合成最主要的细胞来源。H SC 激活与肝纤维化的发生密切相关。近年来相继提出的一些抗肝纤维化治疗策略都要归功于H SC 激活分 子机制的逐渐阐明。
免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术 用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。 二、外周血单个核细胞的分离 外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为 1.075～1.090，血小板为 1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的
原代小鼠肝细胞制备
细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程 实验试剂 培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。 D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4?7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存） 0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃ 保存）) PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存） 鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配） 0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL 0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配） Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2?6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4?7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存） 实验仪器 CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）； Sigma高速离心机； IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）； DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）； 液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）； Sigma5310离心机； ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。 实验方法 实验准备
心肌细胞分离方法
成体SD大鼠心肌细胞分离实验程序溶液配方：
4. 酶液：(NaOH 调节pH 7.35) 4.1 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007] 100mL酶液A：胶原酶Ⅰ+胰蛋白酶，100ml无钙台式液+40mg collagenaseⅠ+6mg 胰蛋白酶 45mL酶液B：45ml无钙台式液+18mg collagenaseⅠ 4.2 [王振国.四医大硕士论文。2005] 30mL酶液：30ml无钙台式液+18mg 胶原酶Ⅰ+21mg BSA 5. 复钙液(NaOH 调节pH 7.35) 5.1 20mL复钙液A: 20mL无钙台式液+10mgCaCl2+20mg BSA。 20mL复钙液B: 20mL无钙台式液+20mgCaCl2+20mg BSA。 20mL复钙液C: 20 mL台式液+20mg BSA。 5.2 100mL复钙液A: 100mL无钙台式液+1.1mgCaCl2, 100mg BSA。 100mL复钙液B: 100mL无钙台式液+5.5mgCaCl2，100mg BSA。 50mL复钙液C: 50 mL台式液+50mg BSA。 5.3 [李超彦.成年SD大鼠心肌细胞分离；2007] 复钙液A: 取无钙台式液加入CaCl2至0.1mmol/L,BSA至1 mg/ mL 复钙液B : 取无钙台式液加入CaCl2 至0.5mmol/L，BSA至1 mg/mL 复钙液C: 取台式液加入BSA 至1 mg/ mL 。 6.心肌细胞分离 其步骤简述如下： 1.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠（30mg/kg体重） 2.迅速开胸取出心脏并置于冰浴下的含氧台式液中，使心脏剧烈收缩排出心腔内 残留的血液，然后迅速将心脏固定于Langendorff灌流系统上。 3.经主动脉灌流（37℃）含氧无钙台式液 4.心脏停跳后，换以含胶原酶Ⅰ（0.6g/L）和牛血清蛋白（BSA,0.7g/L）的无钙 台式液灌流约10min 5.心脏变松软，灌流液流出速度明显加快后，再换以无钙台式液灌流冲洗残留酶 液约2min。 6.去除新房及主动脉，并将心室组织置于含2%BSA的含氧KB（37℃）液中。 7.将心室组织剪碎，以粗头吸管轻轻反复吹打并经200目筛网过滤细胞悬液。 8.室温静置10min沉降分离心室肌细胞（一说100×离心5min），保留沉淀并换入 新鲜含2%BSA的KB液。 9.静置40min后逐步复钙至终浓度1.8×10-3mol/L（一说1.25×10-3mol/L）,得到钙 耐受心室肌细胞，保存于含1.8×10-3mol/L CaCl2的台式液中备用。 另一说： 8. 250目尼龙网过滤，静置10min，弃上清液，加入复钙液A 5-7mL，静置复钙15min( 使心肌细胞自然沉降) ，弃上清液后加入复钙液B 5mL 静置复钙15min，弃上清加入复钙液C，静置15min备用。 9. 暗室中负载Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针染色，500μL台式液加1μL DMSO（二甲基亚砜）溶解的Fura-2 AM Ca2+ 荧光探针。15min后缓慢颠倒混匀，15min之后上
细胞培养的基本方法-细胞分离技术
细胞培养的基本方法-细胞分离技术 细胞分离技术 一、从原代组织中分离细胞将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用的是机 械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离细胞法。 从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短, 以保持最大的活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞。 1. 胰蛋白酶（Trypsin） ?在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4mn小片，通过悬 浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。 ?将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25 %溶解在无钙镁的平衡盐 溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml胰蛋白酶）。 ?在4C孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。 ?移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37C孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。 ?在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要 加入大豆胰蛋白酶抑制剂。 ?通过无菌不锈钢丝网（100?200mm过滤，分散所有剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。 2. 胶原酶（Collagenase） ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mm」、片，用Hanks'平衡液（HBSS清洗组织碎片 几次。 ?加入胶原酶（50?200单位/ml，溶解在HBSS中）。 ?在37C孵育4到18小时。加入3mM CaCI2增加解离效率。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。 如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。 ?通过离心在HBSS中清洗悬液几次。 ?再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养。 3. Dis pase ?用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4mn小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片 几次。 ?加入Dispase （0.6?2.4单位/ml溶解在无钙镁的平衡盐溶液） ?在37C孵育20分钟到几个小时。 ?通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的
小鼠肝星状细胞分离
分离前准备： 分离前晚小鼠禁食不禁水 前灌流液NaCl 8g，KCl 0.4g，KH2PO4 0.06 g, NaHCO3 g，NaHCO3 0.35 g,加超纯水至终体积l L 酶配制液Nacl 8 g, Kcl 0.4 g, CaCl2 0.56 g, Na2HPO4·12H2O 0.151 g, NaH2PO4·2H2O 0.078g, HePes 2.38g, NaHCO3 0.35g, 溶解到1L 超纯水中 含钙GBSS液：KCl 0.37 g，CaCl2 0.225l g，MgCl2·6H20 0.21 g，MgS04 0.0342g，KH2P04 0.03g，NaHC03 2.27g，NaH2P04 0.1196g，葡萄糖1.0 g，加超纯水至终体积1L 链酶蛋白酶E灌注液：130 mg, 酶配制液100 ml 胶原酶灌注液：Ⅳ胶原酶30 mg，酶配制液100ml 震荡消化液：Ⅳ胶原酶12mg, 链酶蛋白酶E 5mg，Dnase 5mg，酶配制液50ml 28.7% Nycodenz分离液：Nycodenz粉末28.7g，含钙GBSS 100ml 以上液体0.22um 过滤除菌，置于37度水浴预热 分离： 10% 水合氯醛0.5ml麻醉小鼠，固定，75%酒精消毒，开腹，暴露肝门静脉，游离门静脉，埋线，24G 留置针进针，固定，打开蠕动泵，15ml/min灌注，剪开下腔静脉。流出液体澄清后，换链酶蛋白酶E灌注液，10ml/min,20min后换胶原酶灌注液，灌注30min，剪下肝脏，撕碎置于震荡消化液，加入1ml双抗，37度恒温摇床150rpm 30min。200目过滤。4度预冷DMEM中和。4度750g 7min离心，弃上清，重复一次。4度50g 3min,弃沉淀，4度750g 7min离心，弃上清，重悬，加Nycodenz调整密度1.04-1.055g/ml 之间，上铺1ml无钙GBSS，20度1350g 15min，吸取白色细胞层，10%DMEM 重悬，4度750g 5min，弃上清，20%FBS DMEM培养，24小时换液。
原代细胞培养之--细胞分离技术
原代细胞培养之－－细胞分离技术 原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下： 一、悬浮细胞的分离方法 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。 二、实体组织材料的分离方法 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。 （一）机械分散法 所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。 （二）消化分离法 组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。 1、酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下： （1）胰蛋白酶分散技术
乳鼠心肌细胞分离步骤
一、细胞室灭菌 1.将酒精灯、止血钳、枪、滴管架子、离心管架子、器械饭盒等清点无误后置 于超净台内，紫外照射20-30min。 2.（注：物品不可重叠放置，否则会遮挡射线。培养细胞和培养用液不可照射 紫外。） 3.将实验服等摊开置于培养室，打开紫外照射20-30min。 4.紫外照射结束后，打开超净台风机，吹10min，吹走O3。 5.（注：若超净台内物品不全，向台内拿取物品前，应先用75%酒精喷洒消毒。） 二、胶原酶1的配置 分离心肌细胞的胶原酶1浓度为：10mg胶原酶/12ml PBS。 具体方法为：（以下过程均在超净台内操作） 1.称取10mg胶原酶于小烧杯中。 2.加入12ml PBS溶液。 3.灼烧止血钳，夹出青霉素小瓶，灼烧备用。 4.用10ml一次性无菌注射器吸取小烧杯中溶液，用一次性无菌滤器过滤于青霉 素小瓶中，即得到无菌的胶原酶1溶液，呈淡土黄色。 三、取材并分离心肌细胞 1.用止血钳取5-6个平皿，分别加入适量PBS溶液。 2.用止血钳夹住小烧杯壁，从器械饭盒中取出剪刀、镊子等器械。 3.准备2个小烧杯，加入75%酒精适量，一个置于超净台外，一个置于超 净台内。 先将乳鼠头朝下置于外面的小烧杯中消毒2min左右，取出，拿进超净台内，置于内部的小烧杯中消毒2min. 4.左手捏住乳鼠背部皮肤，暴露出胸腔，右手拿一直的小剪刀，在中间靠 左处剪开皮肤，左手轻轻一捏，其心脏即弹出来。 5.剪下心室部分置于含PBS的平皿中。 6.待8只乳鼠心脏全部取定后，换手套，喷酒精。 7.左手拿镊子，右手拿剪刀，在心脏中间部位剪一刀，成“肉夹馍”形， 在PBS中冲洗干净，洗去血细胞。 8.将心室转移到另一新的培养皿中，继续清洗，此时可继续打开心室，取 出余血。 9.继续冲洗2-3遍， 10.将洗好的心脏置于含转子的带盖玻璃瓶中（提前将转子取出置于干净 处），加入2ml PBS溶液。 11.灼烧剪刀，左手拿玻璃瓶，右手拿剪刀剪碎心脏成不能再剪的碎片。 12.用枪吸掉上清，只留碎片，将转子放入玻璃瓶中，盖好盖子备用。 13.取出4个10ml 玻璃离心管，各加入4ml含血清及BRDU的DMEM于其中。 14.在含心脏碎片的玻璃瓶中加入2ml胶原酶1溶液。 15.从超净台中取出玻璃瓶，置于磁力搅拌器上的小圆饭盒中（内含37°C 热水），37°C消化5min。 16.取出，喷酒精，拿回超净台内，吸取上清中已消化好的细胞加入到含血
(生物科技行业类)灏洋生物向您介绍几种细胞的分离方法
灏洋生物向您介绍几种细胞的分离方法： 白细的胞分离：（加速红细胞沉降法） 加速红细胞沉降法利用高分子量的聚合物促使红细胞凝聚成串钱状，从而加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。常用的高分子聚合物有明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及甲基纤维素等。 （1）试剂及配制 3%明胶（灏洋生物产）（粘度为25泊以上）：选取优质明胶，用生理盐水配成3%溶液，置沸水浴加热溶解，分装，高压蒸汽灭 菌8磅15-20min. 6%右旋糖酐（灏洋生物产）（分子量200-400KD）：用生理盐水配制。 操作方法分为2种。 第一种：①取抗凝静脉血加入等量3%明胶盐水溶液中，混匀或用3份血液与1份3%明胶溶液混匀；②将试管直立静置室温或37℃温箱中30-60min,利用明胶与红细胞的粘合作用，促使红细胞快速下沉，而白细胞留在明胶溶液中；③用毛细吸管吸取富含白细胞的上层液，移入另一试管中；④按自然沉降法④-⑤操作。 第二种：①取1份右旋糖酐溶液加等量抗凝血，混匀；②按操作方法1的②-④操作。 外周血单个核细胞分离试剂：（聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法） 外周血中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核细胞比重较大，为1.092左右，而淋巴细胞和单核细胞比重为1.075左右。利用比重1.077左右的分层液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 1．试剂及配制 ⑴聚蔗糖泛影葡胺分层液（LTS1077）：（灏洋生物有成品供应），比重为1.077±0.001 ⑵台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100ml ,1500r/min离心15min,吸出上层液，即为4%水溶液。用前，1.8%氯化钠溶液1倍，即为2%台盼蓝染液。 2.操作方法 ⑴取静脉血放入抗凝管，摇允，用Ph7.2-7.6 Hank 液稀释血液1-2倍。 ⑵取LTS1077聚蔗糖-泛影葡胺分层液（灏洋生物产）3-4ml,放入15X150mm试管中。 ⑶用毛吸管吸取稀释血液，在离分层液上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，稀释血液与分层液体积比例约为2：1。 ⑷用水平离心机以2000r/min离心30min,离心后管内容物分为三层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色浑浊的单个核细胞层。 ⑸用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一试管中。 ⑹加5倍以上体积不含Ca2+、Mg2+Hank液，混匀，1500r/min离心10min,吸弃上清，重复洗涤2次。 ⑺末次离心后，吸尽上清。按每毫升血液标本加0.2ml含20%小牛血清Hank液重新混悬细胞。取1滴细胞悬液置血球计数板内计数。然后细胞浓度调节至2X106/ml ⑻细胞活力检测：取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液混匀，加盖片，显微镜高倍镜检。活细胞不着色，折光强；死细胞被染成蓝色，体积略膨大。活细胞数应在95%以上。 3．注意事项 ⑴用稀释后的全血可是单个核细胞得率高，将稀释的血液叠加于分层液上时，一定要细心，动作要轻，避免冲散分层液面或与分层液混合而影响分离结果。 ⑵配制单个核细胞悬液所用的培养液要求等渗，具缓冲作用，并对细胞无毒性。 ⑶吸取单个核细胞时，应避免吸出过多上清液或分层液而导致血小板污染。 ⑷配制好的单个核细胞可放室温或0-4℃，后一条件较好，可减低细胞代谢活动。注意不要迅速改变其所出的温度，以免造成“温度”休克。 通用型细胞分离液（LTS1130）的比重的配方（灏洋生物产） 取比重LTS1077的人淋巴细胞分离液（灏洋生物产）3ml ,放入15X150mm试管中。 用PBS将肝素抗凝血稀释1-2倍后，将稀释全血加到LTS1077分离液上，稀释的血液：分离液约为2：1。 用水平离心机以1500r/min离心10min,离心后，单个核细胞位于血浆和分离液的界面层，红细胞和粒细胞沉淀在