(完整word版)微生物挑战性实验方法

微生物挑战性实验方法

1.0目的

新产品防腐效果的测试

2.0 范围

公司新产品

3.0参考：

4 材料与方法

4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6]

营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、

0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等

4. 2微生物挑战性实验

4. 2. 1受试用微生物

测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。

实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。

4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验

此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性

试验检测防腐剂效果的方法。称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。然后

分析与检测

4. 2. 3重复3 次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CT FA（国际化妆品、香精和洗涤剂协会）推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g , 每隔2 周加菌一次( 即实验的第1、3 和5 周) , 每次加细菌量为1 ×106 ～1 ×107个/ g 样品和霉菌1×105个/ g～1×106 个/ g 样品。在加菌后的0 天、7 天和14 天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前。此方法可将受检样品分为三类:

( 1)防腐效果优良( W) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 01% ( 即≤100 个/ g或ml）样品, 通过测试) 。

( 2)防腐效果尚可( M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, ( 即≤1000 个/ g 或mL 样品, 通过测试) 。

( 3)防腐效果差( P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7天或14 天时, 存活菌量>mL样品(不通过测试) 。

5、结果判断

受试样品一次加菌和3 次加菌后, 在检测时间内细菌和霉菌的抗腐能力见表1～4。根据两种方法评判标准, 将8 种防腐体系的防腐效果评判列于表5 。从结果看, 两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本一致, 三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区别: 防腐优良( W: We pr eser vative) 和防腐尚可( M :M ar gina preserv ative) 。此外, 在一次加菌后1～2 周内能将样品中含菌量降低至加入菌量的0. 1%, 可通过3 次加菌实验, 如防腐体系5 和8 对细菌

的防腐力; 但若大于0. 1%, 即使在以后的测试时间内有逐渐下降至0 的趋势, 可能亦很难通过3 次加菌实验,如防腐体系7 对细菌的防腐力。

参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表2所示）(注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC值不同）

2.3 试验用菌液的配置

（1）标准悬液的配制

1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml，此悬液再做3倍稀释。

（2）细菌菌悬液的配制

实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×108cfu/ml）相同为止；

此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。

（3）霉菌菌悬液的配制

将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数

无菌方法适用性试验记录

无菌方法适用性试验记录记录编号： 2、培养基制备：按规定程序新鲜配制硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基，121℃灭菌15min，灭菌后备用。 4、实验用仪器设备 □立式压力蒸汽灭菌器型号：编号： □净化工作台型号：编号： □生物安全柜型号：编号： □电热恒温培养箱型号：编号： □霉菌培养箱型号：编号： □电热鼓风干燥箱型号：编号：

5、菌液制备 5.1取经30-35℃培养18-24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养基新鲜培养物，分别用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释为不大于100cfu/ml的菌悬液备用。 5.2取经30-35℃培养18-24h的生孢梭菌的硫乙醇酸盐流体培养基新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释为小于100cfu/ml的菌悬液备用。 5.3取经20-25℃培养24-48h的白色念珠菌的沙式葡萄糖培养基新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释为小于100cfu/ml的菌悬液备用。 5.4取经20-25℃培养5-7d的黑曲霉的沙式葡萄糖琼脂斜面培养基新鲜培养物，取3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，采用适宜的办法吸出孢子悬液至无菌试管里，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释为小于100cfu/ml的菌悬液备用。 6、实验操作 6.1薄膜过滤法：取6管滤器按规定加入供试品接种量过滤，其中3管加入硫乙醇酸盐流体培养基，分别接种上述金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的菌液适量，另3管加入胰酪大豆胨液体培养基，分别接种上述枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉适量；再取6管滤器，3管加入硫乙醇酸盐流体培养基和分别接种上述金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的菌液适量，作为对照，置于规定温度培养不超过3d；另3管加入胰酪大豆胨液体培养基和分别接种上述枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉适量，作为对照，置于规定温度培养不超过5d，观察结果。 6.2直接接种法：取6支各装有9ml流乙醇酸盐流体培养基的试管，分别接种上述金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的菌液各2支，取6支各装有

土壤酶活性测定方法

土壤酶活性测定方法土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）一、原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。三、操作步骤称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h 内保持稳定）。标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯

微生物限度检查方法适用性验证方案

微生物限度检查方法适用性试验方案

验证方案组织与实施微生物限度检查方法适用性试验工作应由质量管理部门负责组织，质量管理部门有关人员组成验证小组，参与实施。方案起草方案审核方案批准

目录一、概述二、验证目的和风险评估三、验证内容四、方法判定五、再验证周期六、参考文献七、结果评价及结论

1、概述：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌检查。当建立产品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。依照中国药典2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法进行方法适用性试验。 2、试验目的和风险评估：验证目的：确认所采用的需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法适合我公司所生产产品的微生物限度检查。风险评估： 3、验证内容：、培养基来源：确认人：确认日期：、检查用培养基配制方法：

确认人：确认日期：、使用仪器确认人: 确认日期：、验证试验用菌种：确认人：确认日期：试验方法：取供试品10 ml加氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用

常规法。菌液的制备：取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金饵，加入胰酪大豆胨液体培养基中置30～35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物1ml加入％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。取白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加入沙氏葡萄糖液体培养基中置20～25℃培养箱中培养24～48h，取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养物1ml加入％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。取黑曲霉的新鲜培养物接种子沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20-25℃培养5-7天，加入3-5ml含%聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。取1ml加入含%聚山梨酯80的9ml %无菌氯化钠溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10～7，取，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验：供试液制备：取供试品10 ml，加氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。实验条件：需氧菌培养温度：30～35℃3～5天培养箱：霉菌和酵母菌培养温度：20～25℃5～7天培养箱：试验方法：试验组：分别取供试液，分别加入浓度为1000CFU的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，混匀后取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，置30～35℃或培养箱中培养不超过3天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。分别取供试液，分别加入浓度为1000CFU白色念珠菌、黑曲霉菌液，混匀后分别取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，置30～35℃或培养箱中培养不超过5天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。另分别取其中1ml注皿, 倾注温度不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml，置20～25℃或培养箱中培养不超过5天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。

完整版防腐挑战实验

第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300go 2微生物挑战性实验 2.1实验菌株不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，表1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株美国美国英国德国菌株（药典）（ISP公司）（药典）（Henkel公司）白假丝酵母V V V V 黑曲霉V V V V 红色青霉V 绿色木霉V 绳状青霉大肠埃希氏菌V V V 镉绿假单胞菌V V V 金黄色葡萄球菌V V V V 粪肠球菌V 产气肠杆菌V 表皮葡萄球菌1）,国内参照美2所示），所以MIC值不同）德国（S&M公

日勾维肠杆菌洋葱假单胞菌

肺炎克雷伯氏菌恶臭假单胞菌荧光假单胞菌表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择种类菌株数量革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌至少选一种发酵革兰氏阴性杆菌表皮葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌阴沟肠杆菌大肠埃希氏菌至少选两种非发酵革兰氏阴性杆菌变形菌属日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋葱假单胞菌荧光假单胞菌至少选一种酵母恶臭假单胞菌黄杆菌属不动杆菌属白假丝酵母至少选一种霉菌近平滑假丝酵母黑曲霉至少选一种产芽砲菌黄绿青霉枯草芽砲杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株—*种以上2.2培养基牛肉膏蛋白月东培养基、琼脂培养基

2.3试验用菌液的配置（1）标准悬液的配制 1%硫酸9.9ml与1%氯化锁0.1ml,混合后配制成的悬液浓度为3X108clu/ml , 此悬液再做3倍稀释。（2）细菌菌悬液的配制实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。将己培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（ 3X 108cfu/ml）相同为止；此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1 X108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。（3）霉菌菌悬液的配制将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190?210,落在此范围内的菌悬液为我们所需的1 X 108cfo/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 2.4接种 2.4.1接种方式（1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。（2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了

挑战性任务设计类型与功能

挑战性任务设计类型与功能【摘要】在任务驱动式教学中，挑战性的任务设计是关键，它能有效驱动学生学习，并能驱使学生坚持学习，提高学生的学习能力。不同的教学内容应该有不同的任务设计，为学生量身定做的任务设计才能保证任务作用最大化。【关键词】任务驱动式教学挑战性任务类型学习的有效驱动曾经在杂志上看到一篇题为《幸福蜥蜴》的文章：杰恩斯教授养了一只稀有的亚马逊蜥蜴。头几个星期，蜥蜴不肯吃东西，给它吃生菜、坚果、肉馅，甚至捕苍蝇、捉昆虫，还把水果打成汁……都没用。蜥蜴一天天消瘦下去，眼看就要饿死。有一天，杰恩斯把看完的报纸放在火腿三明治上。蜥蜴看到后，立刻在地板上匍匐前进，跳上报纸，把火腿三明治扯碎，把它吞下。原来，蜥蜴已经进化成需要匍匐潜行、攻击、撕裂，然后才进食，猎食是它的优势和美德。动物一日不作一日不得食，它们没有幸福的捷径。学生的学习也是如此，如果教师总是把知识喂给学生，学生不作而得知，这种获取知识的捷径也会使学生难以享受到学习的幸福。“一捅就破”的成功与“千捅才破”的成功不可相提并论，前者带给学生的愉悦可能是转身即逝的，而后者带给学生的体验却是刻骨铭

心的，也只有“千捅才破”才能锤炼学生学习的毅力和学习的能力。追寻与挑战，同样是人的本性。人总喜欢追寻理想，或挑战自己未曾达到的目标。就像我们不停地在寻觅，永远受着遥远彼岸的引诱。所以，要让学生能够“好好”学习，正确的教学策略是不让学生“好好”学习，我们应该为学生提供挑战性任务，激励学生主动猎知。如果说报纸是引发蜥蜴挑战心的工具和方法，那么在任务驱动式教学中，挑战性任务就是激发学生内心需求的工具和方法。那么，我们该如何设计挑战性任务，引导学生进行挑战性学习？下面笔者结合相关教学案例，来谈挑战性任务设计的类型和功能。一、设计能“玩”的挑战性任务，让学生玩好知识好玩是学生的天性，如果知识能玩，学生一定想玩。如果知识的玩还具有挑战，学生一定更想玩，因为学生都有好胜的心理。例如，我们可以把“3的倍数”知识设计成一个能玩的任务——“抢三十”，其对学生的挑战性是如何做到不输，也就成为吸引和维持学生一探究竟的强动力。学生最终会大彻大悟，要玩好这个游戏，就必须玩好知识——也就是要学好“3的倍数”知识。玩好了知识，还能进一步玩好游戏——我们可以让学生运用知识自己推敲“抢四十”“抢五十”等游戏制胜策略。此时，知识的学习和练习在学生的玩中完成，最终实现“玩中学”。玩游戏常常离不开玩具。生活中学生喜欢的玩具有很多，扑

(完整word版)微生物挑战性实验方法

微生物挑战性实验方法 1.0目的新产品防腐效果的测试 2.0 范围公司新产品 3.0参考： 4 材料与方法 4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6] 营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、 0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等 4. 2微生物挑战性实验 4. 2. 1受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。 4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。然后

充分混匀, 置于28℃下。在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。此实验用以评判防腐剂的有效与否。评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。分析与检测 4. 2. 3重复3 次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CT FA（国际化妆品、香精和洗涤剂协会）推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g , 每隔2 周加菌一次( 即实验的第1、3 和5 周) , 每次加细菌量为1 ×106 ～1 ×107个/ g 样品和霉菌1×105个/ g～1×106 个/ g 样品。在加菌后的0 天、7 天和14 天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前。此方法可将受检样品分为三类: ( 1)防腐效果优良( W) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 01% ( 即≤100 个/ g或ml）样品, 通过测试) 。 ( 2)防腐效果尚可( M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, ( 即≤1000 个/ g 或mL 样品, 通过测试) 。 ( 3)防腐效果差( P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7天或14 天时, 存活菌量>mL样品(不通过测试) 。 5、结果判断受试样品一次加菌和3 次加菌后, 在检测时间内细菌和霉菌的抗腐能力见表1～4。根据两种方法评判标准, 将8 种防腐体系的防腐效果评判列于表5 。从结果看, 两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本一致, 三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区别: 防腐优良( W: We pr eser vative) 和防腐尚可( M :M ar gina preserv ative) 。此外, 在一次加菌后1～2 周内能将样品中含菌量降低至加入菌量的0. 1%, 可通过3 次加菌实验, 如防腐体系5 和8 对细菌

微生物植酸酶在体外条件下活性的测定_石宝明

微生物植酸酶在体外条件下活性的测定东北农业大学动物营养研究所石宝明　单安山由于添加无机磷导致粪便中磷的排出量增多,污染水源和土壤,同时磷酸氢钙还易导致氟中毒和其他重金属中毒,因此在饲料中添加植酸酶代替直接添加无机磷日益受到重视。植酸酶的应用效果,关键在于其在消化道中的活性。自然界有许多不同的植酸酶来源,通过遗传工程技术,利用微生物(黑曲霉—A spe rgillus nige r)发酵工程技术生产饲用植酸酶,已成功地应用于猪和家禽中。本试验是应用这种微生物植酸酶,以玉米、豆饼、麦麸为植酸磷载体,模拟畜禽胃肠消化道环境,在体外条件下测定微生物植酸酶的活性。 1　材料与方法 1.1　试验材料　微生物植酸酶,由德国BASF公司提供。 1.2　试验设计 1.2.1　时间与微生物植酸酶的活性　准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,固定温度为40℃,加入pH为5.5的乙酸溶液10mL和0.1g植酸酶,振荡混匀,在催化时间分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11h后,加入4mol/L盐酸3mL中止反应,然后置烘干箱中烘干,烘干后用TC A法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。 1.2.2　温度与微生物植酸酶的活性　准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,加入pH5.5的乙酸溶液10mL和0.1g植酸酶,振荡混匀,在催化温度分别为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃下,反应4h后加入4mol/L盐酸3mL中止反应,然后置烘干箱中烘干,烘干后用TC A法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。 1.2.3　pH与微生物植酸酶的活性　准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,固定温度40℃,加入0.1g 植酸酶,振荡混匀,然后分别加入pH为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的乙酸溶液10mL,反应4h后加入4mol/L盐酸3mL中止反应,然后置干燥箱中烘干,烘干后用TCA法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。 1.3　计算方法　植酸磷降解率(%)=(催化前载体中植酸磷含量-不同催化条件下植酸磷含量)/催化前载体中植酸磷含量×100。 2　试验结果 2.1　时间与微生物植酸酶的活性　微生物植酸酶在不同催化时间下,对饲料中植酸磷的降解率见图1。图1　不同催化时间对微生物植酸酶活性的影响从图1可以看出,微生物植酸酶对植酸磷的降解率随着催化时间的增加而增加,在4h后为80%,在5～6h后基本完全降解。 2.2　温度与微生物植酸酶的活性　微生物植酸酶在不同温度下,对饲料中植酸磷的降解率见图2。图2　不同温度对微生物植酸酶活性的影响从图2中可以看出,微生物植酸酶的活性,随着温度(25～70℃范围内)的增加而增强。在pH — 23 — 2000年第15期中国饲料DOI:10.15906/https://www.360docs.net/doc/17400149.html, https://www.360docs.net/doc/17400149.html,11-2975/s.2000.15.012

化妆品微生物挑战试验

化妆品微生物挑战试验刘树葆臧跃扬桂菊（天津化妆品科学技术研究皖有强公司）摘要：本文参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法，研究了不同产品在相同防腐条件下，微生物挑战试验结果的差异性。关键词：防腐体系，微生物挑战试验，膏霜，乳液，水剂。目前，化妆品琳琅满目，产品配方复杂多样，通常包含多种成分，尤其许多化妆品中的营养成分非常适合微生物的生长，而微生物存在于我们生活着的世界的每一个角落，从而为化妆品的生产和保存带来困难。微生物污染将导致产品在气味、颜色、粘度、性能上都会发生改变。因此化妆品微生物污染对产品质量、正常使用以及使用者健康来说是一个极大的冒险“’。为防止微生物污染，就对产品的防腐提出了挑战，所以必须建立很好的防腐体系，以保证产品的安全、稳定性“’，为消费者提供安全和高品质的产品。评价化妆品质量的～个重要指标就是微生物是否达到化妆品卫生规范的要求，本实验参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法。’，对相同防腐体系不同功能的膏霜、乳液及水剂产品进行微生物挑战试验，以指导配方师合理添加防腐剂。１．实验方法ｉ．Ｉ．ＣＴＦＡ推荐的防腐单次挑战试验ＣＴＦＡ推荐的经典的为期２８天的防腐单次挑战实验，是将防腐剂混入配方基质中，然后～次性接入若干种类、～定数量的微生物进行挑战，将样品存放于适当的温度下，定期抽样检测其中残存的微生物，并根据微生物的数量变化情况评价样品的抗菌效果。１．２试验仪器恒温培养箱：霉菌培养箱：显微镜：灭菌平皿：直径为９ｃｍ；ｐＨ计；高压灭菌锅；酒精灯：锥形烧瓶；量筒：灭菌刻度吸管：ｌＯｍｌ、２ｍｌ、ｉｍｌ；试管。Ｉ．３．培养基和试剂生理盐水：ＳＣＤＬＰ液体培养基：卵磷脂、吐温８０一营养培养基：乳糖胆盐培养基：蛋白胨水：靛基质试剂：十六烷三甲基溴化铵培养基；绿脓菌素测定用培养基：硝酸盐蛋白胨水培养基：普通琼脂斜面培养基：血琼脂培养基；甘露醇发酵培养基：血浆：孟加拉红培养基。ｌ＿４挑战用微生物测试用菌种由天津市卫生防病中心提供，霉菌和杂菌由实验室从污染产品中分离到的菌珠。菌种包括：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌。实验前，将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。Ｃ（细菌）和２８℃（霉菌）培养箱中培养。细菌培养４８小时，霉菌培养７２小时后，挑选典型的菌落于灭菌的液体培养基中制成～定浓度的细菌和霉菌混合悬液，置于冰箱冷藏备用。１．５待测样品选择了８种化妆品基质，其中膏霜２种、乳液２种、水剂２种。按相同的防腐体系常规方法加入基质中，在进行微生物挑战性实验前预先进行细菌总数及霉菌和酵母菌的测定，试验样品的菌落数均应小于１０，作为待测样品。１．６接种的方式和数量接种的方式：采用混合接种。因为自然界的微生物有混生杂居的特点，所以混合接种符合实际污染的情况。接种的数量：将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。Ｃ（细菌）和２８。Ｃ（霉菌培养箱中培养。

大班幼儿挑战性运动环境创设的实践研究

大班幼儿挑战性运动环境创设的实践研究一、问题的提出 1、挑战性和挑战性运动环境的概念界定挑战性：是指需要付出，有一定难度才能获得的。就像树上的苹果，你伸伸手就能拿到，那不算有挑战性；如果需要你用力跳一下才能够到，才叫有挑战性。如果你怎么跳都够不到，则属于是困难。幼儿的身高不同，跳的能力不同，面对树上同样高度的苹果，所需要付出的也会不同。本课题中的挑战性，主要是指在幼儿运动过程中，根据幼儿已有的运动能力、现有的多种生活经验及心理品质等，适度地设置活动的“困难”，适当地增加活动难度，激发幼儿运动与智慧潜能，培养如大胆勇敢、不畏困难、坚持到底、团结互助等心理品质，在体验运动快乐和获得成功喜悦中，促进其身心和谐发展。挑战性运动环境创设：是指能提供幼儿产生运动兴趣，激发幼儿运动与智慧潜能，促进幼儿健康和谐发展的心理环境和物质环境。本课题中的挑战性运动环境创设主要是大班幼儿挑战性运动中的运动器械与材料的运用和情境创设。 2、研究的背景上海学前教育课程的目标是促进幼儿健康水平以及情感、态度、认知能力等各方面的发展，使幼儿成为健康活泼、好奇探究、文明乐群、亲近自然、爱护环境、勇敢自信、有初步责任感的儿童。在二期课改理念的指引下，多年来我们潜心于开展幼儿运动教育的实践研究，并以郑艺老师的快乐体育教育思想作为运动教学的主导思想，力求改变幼儿体育教学比较强调身体动作的发展，而忽视幼儿情感、社会性以及创造性发展的状况。我们试图从幼儿的年龄以及生理、心理特点出发，在运动教学中激发幼儿运动兴趣，不断获得“愉快”的体验，这种愉快是深层次的心理快乐和成功感，以促进幼儿运动能力提高和身心健康发展。我们发现：大班幼儿具有较强的运动能力，认知经验日益丰富，合作意识与解决问题能力逐渐增强，适度地设置活动的“困难”，适当地增加活动难度，使运动具有适宜的挑战性，更能使大班幼儿保持活动兴趣，使其不断从克服困难中体验到参与运动的快乐和获得成功的喜悦，促进身心和谐发展。

奥扎格雷钠注射液无菌检查方法适用性试验

奥扎格雷钠注射液无菌检查方法适用性试验发表时间：2018-03-05T11:28:42.313Z 来源：《中国医学人文》2017年第12期作者：张春景王晓旦王强周欣盈黄庆春 [导读] 本文对奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法进行试验研究，以确定奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法的有效性。浙江北生药业汉生制药有限公司浙江省 322100 摘要：目的建立奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法的适用性试验。方法按《中国药典》2015年版四部无菌检查方法要求，采用薄膜过滤法，对奥扎格雷钠注射液（规格5 ml:80 mg）进行无菌检查方法适用性试验。结果奥扎格雷钠注射液采用薄膜过滤法，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，进行无菌检查方法学验证，验证结果符合《中国药典》2015年版四部无菌检查方法适用性试验要求。结论该方法可作为奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法。关键词：奥扎格雷钠注射液；无菌检查；薄膜过滤法；方法学适用性试验中图分类号：R284.1；R917.101 文献标志码：A 文章编号：1007-7693 奥扎格雷钠注射液主要用于治疗急性血栓性脑梗塞和脑梗塞所伴随的运动障碍，及改善蛛网膜下腔出血手术后的脑血管痉挛收缩和并发脑缺血症状。临床上也可联合用药，如与纳洛酮注射液联合用药治疗脑梗死。与低分子肝素钙治疗不稳定型心绞痛效果显著，有助于改善患者血液流变学指标。有研究表明奥扎格雷钠注射液对慢性阻塞性肺病有保护作用。奥扎格雷钠注射液无抑菌性，可直接采用薄膜过滤法进行该产品的无菌检查。本文对奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法进行试验研究，以确定奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法的有效性。 1 仪器与试剂 1.1 供试品奥扎格雷钠注射液（规格：5 ml:80 mg；批号：1704271、1704272、1704273；），供试品均由浙江北生药业汉生制药有限公司提供。 1.2 培养基和试剂硫乙醇酸盐流体培养基（批号：150605）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：150629）、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：1612262）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：1611283）、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：1310292），培养基生产厂家均为北京三药科技开发公司。聚山梨酯80（批号：20150608），生产厂家为国药集团化学试剂有限公司。 1.3 试验菌株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F) 98003]、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B) 64941]，菌种均来自浙江省食品药品检验研究院，所用菌种均为3代菌种。 1.4 仪器集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）、隔水式电热培养箱（上海浦东荣丰科技仪器有限公司）、生化培养箱（上海申贤恒温设备厂）、电热手提压力蒸汽消毒器（上海医用核子仪器厂）、立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、集菌仪（杭州高得(泰林)医疗器械有限公司）、生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）。 2 方法与结果 2.1 菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35 ℃培养18～24小时。取经培养的菌液培养物1 ml，加入9 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍稀释成含菌数不大于100 cfu的菌悬液，稀释级别为10-7、10-7、10-4、10-7，。接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35 ℃培养18～24小时。取经培养的菌液培养物1 ml，加入9 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍稀释成含菌数不大于100 cfu的菌悬液，稀释级别为10-5。接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20~25 ℃培养24~48小时。取经培养的菌液培养物1 ml，加入9ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍稀释成含菌数不大于100cfu的菌悬液，稀释级别为10-5。接种黑曲霉的新鲜培养物，至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20~25℃培养5~7天。取培养物，加入3ml含0.05%（ml·ml-1）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将孢子洗脱，吸出孢子悬液转移至无菌空试管作为原液，加含0.05%（ml·ml-1）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍稀释成含菌数不大于100cfu的菌悬液，稀释级别为10-3。 2.2 试剂的制备培养基及所选的的溶剂按照《中国药典》2015年版四部无菌检查的规定进行配制、分装和灭菌后备用。 2.3 培养基适用性检查 2.3.1 无菌性检查每批培养基随机取5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置30~35℃，培养14天，胰酪大豆胨液体培养基置20~25℃，培养14天，观察，无菌生长。 2.3.2 灵敏度检查取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100cfu金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种，作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体流体培养基7支，分别接种小于100cfu枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种，作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。培养基的灵敏度检查符合规定。结果见表1：表1 培养基灵敏度检查结果 Tab 1 The medium sensitivity tests results

细菌截留验证指导程序

细菌截留验证程序和方案形成应使用标准方法确证膜过滤器的微生物截留能力。然而，对于某种产品来说，仅证明缺陷假单胞菌在水溶液中被截留，而不是在特定产品中，不足以验证此产品的除菌过滤工艺。为了确定正确的挑战测试方法，应将测试微生物直接接种在承载流体（产品或替代品）中以证明其生存性。微生物应以与挑战实验中使用的同等方式培养，以保留其生物形态特征和生理特征。用于生存性研究的测试暴露时间应该等于或超过实际工艺过滤时间。当测试微生物在产品中的生存性已经完成测试，就应该形成挑战方法和方案了。细菌挑战实验的条件应模拟实际生产工艺。既然细菌挑战实验通常都在实验室里进行，那么方法的规模也应相应调整。通量应调整到每单位面积的流速，表示为基于滤芯表面积的形式(ml/min)/cm2。如果过滤过程按压差控制，则挑战实验压差至少等同于最大工艺压差。如果制订方案过程中遇到关于测试方法可接受性的问题，则建议联系相关管理机构以获取指导。图1列出了在为特定过滤器和产品/工艺组合选择合适的验证策略时需要考虑的关键步骤。（1）非杀菌性的工艺和流体直接在产品中接种测试微生物是测试除菌级过滤器微生物截留能力的首选方法。当产品和工艺流体被证明在产品和工艺条件下没有杀菌效力的时候，这样是可行的。在这些工艺中，应使用足够浓度的挑战微生物在产品中接种，而且要在实际工艺条件下，包括时间、压差、流速和其它关键变量（例如温度），应尽量减少稀释，以避免不必要的产品改变。（2）抑菌的/杀菌的/非分散的挑战流体在杀菌性的产品中进行细菌截留测试，使得与验证相关的一些问题更难回答，例如：产品对过滤器有什么影响，产品对其中的生物菌落有什么影响。在杀菌性产品中或是在不利于微生物活性的条件（例如，温度上升）下进行的细菌截留测试不一定能得到正确的结果。为了评估产品/工艺对过滤器的潜在影响，可以使用产品和实际的工艺条件，包括流速、压差、温度和时间，对过滤器进行预处理。这种预处理可在一个闭路系统中将产品循环通过测试过滤器或者单路通过测试过滤器，接着对滤

极具挑战性的拓展游戏.doc

极具挑战性的拓展游戏长生之鸟概述：如果你曾试图搞明白一个电话盒子究竟能装下多少人，就会发现这个游戏多么有趣。这是一个富有挑战性的游戏。目的： 1.让每个队员参与到解决问题的游戏中来。 2.让队员们能够自然地进行身体接触和配合，消除害羞和忸怩感。时间：30～40分钟人数：16～30人道具： ·一颗枝权粗壮的大树(用来悬挂绳子)。 ·一条结实的长绳(绳子能拉起最重的队员)。 ·一根长木杆或绳子(代表起点)。 ·一个准备好的平台。 ·在一块厚20毫米，约60 厘米见方的胶合木板下钉四个木桩作为平台的腿，两腿之间用横木条加固，一个平台就做好了。这个平台能承受～16 个人的重量。如果参加人数较多，可以适当加大平台(但不能太大)。准备： 1.需要悬挂一条摆绳，使队员从树下摆动到平台上。选一个结实的

树权，把绳子牢牢捆在上面，绳子要足够长，能从起始线摆到平台上。 2.计算好绳子的摆动区(即队员摆动时划过的最安全的弧线区域)，在绳子摆动区一侧的地上放置一根长木杆或绳子，代表起始线。如果用绳子代表起始线，最好在地上立两个标桩，把绳子两端分别系在标桩上，并拉紧。 3.把平台放在距起始线4米的地方，固定位置，因为队员们要从起始线一端摆到平台上。步骤： 1.告诉周围的队员有10 分钟准备时间。之后，他们将创立一个前所未有的世界纪录，看这个平台究竟能站多少人。要求任何人不能踩地，平台上的其他人也不能伸胳膊迎接或以任何形式协助队员站到平台上。为安全起见，队员们不能在平台上叠罗汉，只能通过绳子摆到平台上。任何人如果在摆动时不慎踩地，必须回到起点重新开始。 2.经过10分钟的准备，让队员说出自己计划创下的纪录，然后鼓励他们尽量完。 2017-09-06 长生之鸟概述：如果你曾试图搞明白一个电话盒子究竟能装下多少人，就会发现这个游戏多么有趣。这是一个富有挑战性的游戏。目的：

几种检测方法的适用性

几种检测方法的适用性：静载试验法这是目前公认的检测基桩竖向抗压承载力最直接、最可靠的试验方法。但在工程实践中发现，基准桩的问题有时会被检测人员所忽视，容易出现基准桩打入深度不足，试验过程产生位移的问题。钻芯法这种方法具有科学、直观、实用等特点，在检测混凝土灌注桩方面应用较广。一次完整、成功的钻芯检测，可以得到桩长、桩身混凝土强度、桩底沉渣厚度和桩身完整性的情况，并判定或鉴别桩端持力层的岩土性状。抽芯技术对检测判断的影响很大。某工程先用XY－1型工程钻机，采用硬质合金单管钻具，用低压慢速小泵量及干钻相结合的钻进方法，结果采芯率不到70%，芯样完整性极差，大多呈碎块；后来改用SCZ－1型液压钻机，采用金刚石单动双管钻具，采芯率达99%，芯样呈较完整的圆柱状。所以，《技术规范》对钻机和钻头作了相应的规定，就是为了避免抽芯验桩的误判。反射波法目前在国内，绝大多数的检测机构采用反射波法（瞬态时域分析法）检测桩身完整性，主要原因是其仪器轻便、现场检测快捷，同时将激励方式、频域分析方法等作为测试、辅助分析手段融合进去。当然，低应变法检测时，不论缺陷的类型如何，其综合表现均为桩的阻抗变小，而对缺陷的性质难以区分，这是其最大的局限性。高应变法它的主要功能是判定桩竖向抗压承载力是否满足设计要求。高应变法在判定桩身水平整合型缝隙、预制桩接头等缺陷时，能够在查明这些“缺陷“是否影响竖向抗压承载力的基础上，合理判定缺陷程度，可作为低应变法的补充验证手段。目前在某些地区，利用高应变法增加承载力和完整性的抽查频率，已成为一种普遍做法。

声波透射法与其他完整性检测方法相比，声波透射法能够进行全面、细致的检测，且基本上无其他限制条件。但由于存在漫射、透射、反射，对检测结果会造成影响。低应变动测法低应变动测法是使用小锤敲击桩顶，通过粘接在桩顶的传感器接收来自桩中的应力波信号，采用应力波理论来研究桩土体系的动态响应，反演分析实测速度信号、频率信号，从而获得桩的完整性。该方法检测简便，且检测速度较快，但如何获取好的波形，如何较好地分析桩身完整性是检测工作的关键。测试过程是获取好信号的关键，测试中应注意：①测试点的选择。测试点数依桩径不同、测试信号情况不同而有所不同，一般要求桩径在120cm 以上，测试3～4 点。②锤击点的选择。锤击点宜选择距传感器 20～30 cm 处不必考虑桩径大小。③传感器安装。传感器根据所选测试点位置安装，注意选择好粘贴方式，一般有石蜡、黄油、橡皮泥在保证桩头干燥，没积水的情况下。④尽量多采集信号。一根桩不少于10 锤，在不同点，不同激振情况下，观测波形的一致性，以保证波形真实且不漏测。综述在桩基检测中，各个检测手段需要配合使用，利用各自的特点和优势，按照实际情况，

微生物方法学验证范本

编码：VP-C01-MM-01 XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案起草人：年月日审核人：年月日年月日年月日批准人：年月日目录 1.验证立项表 2.验证内容 2.1验证目的 2.2验证范围 2.3 验证要求 2.4 验证方法 2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容 2.4.3 金黄色葡萄球菌验证内容 2.4.4铜绿假单胞菌验证内容 3. 验证报告验证立项表（REC）立项题目立项部门申请人

申请日期要求完成日期验证类别负责部门参与部门及人员验证原因质量部审核意见审核人：日期：验证领导小组审批人：日期：审批意见备注 XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案编码：VP-C01-MM-01品名验证依据2005版药典规格验证日期年月日数量报告日期年月日验证项目细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌 1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。 2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。

3.判定标准 3.1验证小组成员姓名职务职责组长负责验证方案、报告的批准项目负责人负责验证方案、报告的起草与具体实施验证小组成员负责验证试验及填写记录 3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7≤Q≤1.3。 3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。 3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。 4.验证方法 4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为、、。4.1.2稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。配法：照（05版药典附录XIII C）配制； 0.9%无菌氯化钠溶液的配制：取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。 4.1.3实验仪器：无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18×180）,具塞三角瓶。 4.1.4验证用培养基营养琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。 4.1.5验证用微生物名称及编号菌珠名称传代次数大肠埃希菌MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501

土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法

土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法 The manuscript was revised on the evening of 2021

土壤酶活性及微生物测定土壤酶活性测定取样工具及取样方法在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。土样在自然条件下烘干装入袋中备用。所需试剂：酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、配置方法：铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100μg N。往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。醋酸缓冲液：，50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。硼酸缓冲液：，80毫升l硼砂（）和l的硼酸混合。纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。静置，取上层清液，贮于棕色瓶中

酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳定，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于、、、、、、毫克酚），待颜色稳定后，570nm比色绘制标准曲线。测定方法磷酸酶活性测定一、试验原理土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。磷酸酶能促进有机磷化合物的水解。实验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物质的矿化起着主要作用；土壤的磷酸酶活性，在很大程度上取决于土壤的腐殖质含量，活性磷量，能矿化有机磷化合物的微生物数量，植物类型等因素，土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况。二、实验仪器恒温箱、分光光度计、三、实验药品甲苯、苯磷酸二钠、酚、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、四、实验步骤取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中，用(16滴)毫升甲苯处理，15分钟后，加入5毫升苯磷酸二钠溶液（6.75克苯磷酸二钠溶于水，并稀释至1升）和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液，中性磷