关于蛋白质的小知识

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关于蛋白质的小知识

蛋白质基础知识(关键词)

1、什么是蛋白质?

蛋白质是一类结构复杂的有机化合物,是人体必需的营养元素,是生命的物质基础,没有蛋白质就没有生命。

2、蛋白质是什么组成的?

蛋白质是多种氨基酸连在一起形成的大分子,多肽是含氨基酸较少的蛋白质。构成人体蛋白质的氨基酸有20种,其中有8种是成人必需的,分别是异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸;而婴儿还必需组氨酸,顺口溜记法:(写一两本单色书来煮)。这九种是人体必需从食物中获取的,其它的11种可以通过转化而来。(但并不代表其它的就不重要,如果其它的有可以节省必需氨基酸的)

3、蛋白质是如何变成氨基酸的呢?

食物中的蛋白质不会直接变成身体里的蛋白质,而是首先要水解成为游离氨基酸和小肽,然后再用来制造人体蛋白质。蛋白质消化在胃中开始,胃酸对蛋白质消化很重要,因为胃酸酸度高,能帮助杀菌、使蛋白质变性成为松散的结构,有利于消化酶作用。而且胃蛋白酶原也要在胃酸激活下,才能把蛋白质变成多肽和氨基酸。所以胃酸不足会影响蛋白质消化;

不过蛋白质在胃里只是消化很少一部分,大部分还是在小肠中完成消化的。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等酶把蛋白质水解成多肽,小肠液中的肽酶把它们分解成氨基酸和小肽。然后吸收进入血液运送到肝脏合成人体所需的蛋白质。

4、蛋白质有什么作用?

1)构建人体的材料,对于生长发育和组织修复必不可少

人体肌肉、筋腱、血液、皮肤、毛发指甲都需要蛋白质作为主要原料。而且牙齿中的钙镁磷也需要附着在骨胶原蛋白网络上。而且胶原蛋白也是血管的建筑材

料,让血管富有弹性和韧性。

发育中组织器官的长大和血量的增加都需要蛋白质,成年后细胞衰老和更新也需要蛋白质,各种受损的组织也需要蛋白质来修复。

2)蛋白质是人体各种酶的合成原料

3)蛋白质是很多激素的合成原料

人体的激素大部分属于多肽、蛋白质或氨基酸类物质,如生长激素、胰岛素等。但食物中的蛋白质在经过消化后变成氨基酸,失去活性,因此食物中的蛋白质类激素对人体难以发挥作用。补充蛋白质类激素只能通过注射。

4)调节体液渗透压平衡,蛋白质不足,容易发生水肿。

5)蛋白质是抗体和各种免疫因子的原料,对人体的免疫有重要作用。

6)蛋白质可以用作能源,或合成葡萄糖

人体能量不足时,蛋白质也可以为机体供能,蛋白质可以用来合成葡萄糖为大脑供能,脂肪则不能,因此碳水化合物摄入过少或严重不足会导致蛋白质作为能源物质“浪费掉”。但蛋白质摄入过多,超过人体需要时,多余部分也会作为能量被分解或者转变成脂肪储存。

5、人体有多少蛋白质,每天要吃多少蛋白质?

正常人体含蛋白质为体重的16%~19%,正常成年人每天需要蛋白质的量为0.8~1.1g/kg体重,一般男性每天是65g/天,女性55g/天。(肌肉特别多,或者健身人群不在此范围内)

6、哪些食物中蛋白质多呢?

几乎所有的食物中都含有蛋白质,但蔬菜、水果、藻类、薯类等食品水分多,蛋白质含量相对少,多在0.5%~2.0%。粮食谷物类蛋白质含量在7%~15%,杂豆类在20%左右,大豆高达35%~40%,因此豆类和豆制品是蛋白质的良好来源,适当多吃。

动物食品都是蛋白质良好来源,按照鲜重来说,肉类和鱼类蛋白质含量最好可达15%~20%,蛋类12%,牛奶3%左右。

动物蛋白和大豆蛋白氨基酸组成比较合理,利用率高,是优质蛋白,每天从这些食物中蛋白质含量应占蛋白总类的30%~50%,也就是说要18g~30g。

蛋白质的常见问答

问答1:食物中的酶对人体重要吗?

很多人听说食物中含有蛋白酶如SOD,能帮助我们抗氧化,还有人说加热食物会破坏食物中的酶,造成消化不良,其实这些说法都是不了解蛋白质的消化过程。

首先是食物烹调加工会造成蛋白质变性使酶不可逆的失去活性。另外生吃食物中的酶在胃里也会失活,因为强大的胃酸和胃蛋白酶的作用,而且食物中的蛋白质和酶失活并不会影响消化吸收,相反这个过程可以杀菌并使蛋白质松散,有利于消化。

只有在胃酸很弱的情况下,食物中的酶才可以帮助蛋白质消化,但是蛋白质的主要消化过程还是在小肠中。

不过食物中的酶在未进入消化道前还是有点作用的,如木瓜汁中的木瓜蛋白酶可以嫩化牛肉,变软变嫩。

问答2:初乳能中的免疫蛋白能被人体吸收吗?

很多人听说喝牛初乳可以提高人体免疫力。不过从以上的介绍可以看出,牛的蛋白质不会完整的进入人体,而是需要在胃肠道中分解成氨基酸才能吸收,所以喝牛初乳并不能直接提高人体免疫力。

但对于消化力弱的人,初乳中的免疫蛋白在胃中还是有一定的作用的,在没有被消化分解前,如果遇到食物中的致病菌,就会把它们消灭掉,对预防胃肠道感染有一定的帮助。

初生婴幼儿肠道没有足够的消化能力,在喝母初乳的时候可以直接吸收一部分其中的大分子蛋白质,包括一些免疫因子和生长因子。

问答3:蛋白质多了会长胖吗?

其实只要了解蛋白质在人体的去路就知道了。

首先蛋白质在肠道里分解成氨基酸后被吸收入血在肝脏中合成人体所需的蛋白质;

二是合成一些其它含氮物质像神经递质、色素、激素等;

第三就是合成葡萄糖和脂肪:食物蛋白质过剩时,人体会把多余的氨基酸分子中的氨基脱掉,把余下的部分用来合成脂肪储备起来,因此吃蛋白质多了也是有可能会长胖的。

问答4:多吃蛋白质就可以长肌肉吗?

对于健康的成年人来说,人体的蛋白质合成和分解是处于平衡的。如果人已经结

束了生长发育,没有怀孕哺乳,没有受伤患病,也没有进行体育锻炼,那么身体蛋白质将会保持平衡,而不会额外的储存蛋白质,合成肌肉。(蛋白质在人体不像脂肪可以储存,蛋白质在体内是不会额外储存起来的)

因此,如果每天的蛋白质足够的话,仅仅靠多富含蛋白质的食品是不能让人增加肌肉的。只有在通过锻炼刺激肌肉,令肌肉产生生长需要的时候,摄入富含蛋白质的食物才能有效的增加身体肌肉的量。否则,虽然多吃了富含蛋白质的食物,最后沉积在体内的只能是脂肪。

问答5:蛋白质变性了就失去营养价值了吗?

食物在加工过程中收到加热、搅拌、挤压等处理都破坏蛋白质的空间机构而导致变性,如鸡蛋从液体变成固态,牛奶从液态变成酸奶等。其实加热杀菌的原理也是加热造成蛋白质的变性,从而致死的。

其实蛋白质的变性只是改变了蛋白质的结构,并不影响氨基酸数量和比列,因此正常烹调对消化吸收率影响很小,并不会造成营养价值的损失。(高温油炸,烧烤等是由于蛋白质与其他物质发生反应或者生成了其他的物质导致蛋白质损失了而营养价值降低)

问答6:为什么荤菜比素菜有营养,怎样才能提高素菜的营养呢?

人们常说的荤比素有营养,这里常说的有营养一般指的是蛋白质的营养,因为荤(肉类)蛋白质含量相对高,而且各种必需氨基酸的量和比例都比较适合人体需要,所以营养价值高。

素材为什么营养价值低呢?那是因为素菜(植物性食物)中主要是水分,蛋白质含量低,而且素菜中的蛋白质氨基酸组成不够合理,必需氨基酸不足或数量少,不能满足人体需要,所以营养价值更低。

提高营养价值,关键在于食物搭配。因为基本每种素菜都缺少一种或几种必需氨基酸,如果能把多种蔬菜一起做,就能起到很好的取长补短的作用,因此要提高素菜的营养价值,建议是多种食材搭配着做,不但好看而且更营养。尤其是和豆类一起搭配,营养价值提高的更多。像八宝粥、红豆饭、大豆玉米窝头、红豆包等都是营养较高的素菜了。

问题7、蛋白质多了会怎么样?

首先蛋白质过多会导致蛋白质的浪费,还有可能导致肥胖;

另外,蛋白质过多会导致钙的排泄增多,从而加剧骨质疏松的危险;

三是过多的蛋白质代谢产物需要从肾脏排出,会加重肾脏的负担。

最后,如果从饮食中摄入过多的蛋白质,必然会导致摄入更多的脂肪和胆固醇,可能会造成多种慢性疾病风险的增加,像心脏病、肥胖。癌症、肾结石等。

养胃,你要知道的一些真相

饮食不规律,烟酒不离口,常吃刺激性食物……一些不健康的生活让我们的胃经常“闹情绪”。很多人都听说过各种养胃的方法,但到底哪些是有效的?胃不好要少吃什么?

维生素A和胡萝卜素基础知识

简介:维生素A (VA):典型的脂溶性维生素,不溶于水。意味着吸收需要脂肪帮助,而且必须有胆汁的参与。在体内可以储存,主要部位是肝脏,约占总量的90%。

体内维生素A有3种形式,视黄醇、视黄醛和视黄酸,前两种可以互相转化。它们只存在动物性食物中,植物性食物中的某些类胡萝卜素,被称作维生素A 前体,最典型的是β-胡萝卜素,在体内可以转变成VA,但并不是所有的类胡萝卜素都能转变成VA,而且转变效率较低。当身体需要时,效率会有所提高。

维生素A有什么功能?

1、维持视力正常:

一方面维护角膜正常,另一方面维持视神经的正常(视网膜上的视紫红质是由视蛋白和视黄醛结合而成的)。维生素A缺乏会导致视力障碍,暗适应能力降低(暗处看不清),严重者导致夜盲症。

注意,暗适应能力除了和VA缺乏有关外,还与蛋白质、锌缺乏有关。补充复合维生素(维生素A、复合维生素B和维生素C)以及锌有利于提高暗适应能力。

维生素A不足的极端表现是眼角膜干燥,即干眼症,进而发生角膜软化和溃疡,甚至穿孔,最后导致完全失明。

2、参与蛋白质合成,维持皮肤正常功能:

维生素A不足或缺乏,会导致皮肤干燥、粗糙、鳞片化,鼻、咽、和其它呼吸道、胃肠和泌尿容易感染。

3、维持骨骼健康、促进生长和生殖发育。

4、抗氧化活性:

维生素A缺乏症状及危害

因为维生素A可以在体内储存,因此短期缺乏不易发现。如果长期缺乏,小孩可表现出暗视或夜视能力降低,还可能会患皮肤角化如鱼鳞癣、蛇皮癣、毛囊角花,还有可能出现味觉减退、恶心、不育等。

维生素A的食物来源有哪些呢?

维生素A的最有效来源是动物性食物:如肝脏、肾脏、鱼肝油、全脂奶、奶酪、蛋黄。(肝脏中VA最丰富,正常情况每周食用1~2次就足够了)

植物性食物中不含维生素A,但许多绿色、黄色和橙色蔬菜水果中含有丰富的类胡萝卜素,如β-胡萝卜素,可转化成VA。像菠菜、芥菜、小油菜、小白菜、绿菜花等。黄色和绿色蔬菜水果颜色越深,胡萝卜素含量越高,浅色水果蔬菜胡萝卜含量很低。

人每天需要多少维生素A?

维生素A的参考摄入量为700μg视黄醇单量/天,每天最高可耐受剂量为3000μg,孕妇中晚期每天增加70μg达到770μg/天,哺乳期每天增加600μg

达到1300μg/天。(注意:1μg视黄醇当量相当于12μg胡萝卜素,1IU维生素A=0.3μg视黄醇)

维生素A过量会怎样?

维生素A不易从体内代谢排出,摄入过量可能带来危害。正常膳食时并不容易发生,通常只有在长期大量摄入肝脏、鱼肝油或维生素A增补剂的情况下才会发生(合格保健食品按照推荐剂量使用是不会过量的)。过量维生素A可能导致骨骼生长异常,甚至发生骨质疏松。对于孕妇来说过量的维生素A可能带来胎儿畸形概率上升。另外长期大量摄入VA可能造成肝脏损害。

维生素A 问答

1、吃胡萝卜过多会中毒吗?

膳食中的胡萝卜素没有维生素A毒性,即使从蔬果中摄入过量的胡萝卜素,也只会出现皮肤变黄,但对健康无害。此时应该停止摄入富含胡萝卜素的食物,黄色会逐渐消退,不用太担心。

2、喝脱脂牛奶能补充维生素A吗?

由于维生素A是脂溶性维生素,因此脱脂牛奶再出去脂肪的同时也会把大部分的维生素A脱去,因此脱脂的牛奶或者酸奶补充维生素A的效果并不好。

3、服用维生素A补充剂应该什么时候吃?

维生素A是脂溶性的,消化吸收需要脂肪的帮助,因此建议餐后半小时服用。

简易营养配餐要诀

其实营养餐并不难,简单地说可以归结为三句话:①每餐有主食;②每餐有蔬菜;

③每餐有高蛋白食物。

1、主食:

指米饭、馒头、面条、米粉、面包、粥、玉米等谷类食物(粗粮也很重要),以及杂豆类(红豆、绿豆等)和薯类(土豆、地瓜、芋头)等富含淀粉的食物。它们是能量的主要来源,还提供B族维生素、矿物质和膳食纤维等营养素。主食每餐不宜除太多,否则易发胖。

2、蔬菜

主要提供维生素、矿物质和膳食纤维。蔬菜含能量极低,故多多益善。油菜、生菜、菠菜、菜心绿色叶菜营养价值最高,红黄色蔬菜如西红柿、胡萝卜、南瓜等

营养价值也很高。一句简单的概括是“蔬菜颜色越深,则越有营养”。需要提醒的是,木耳、蘑菇等食用菌,以及海带、紫菜、裙带菜等海藻也是蔬菜,且营养价值不低。

3、高蛋白食物最容易被忽视。

高蛋白食物是指鱼虾、肉类、蛋类、奶类和大豆制品,主要提供优质蛋白、维生素和微量元素,是均衡膳食的重要组成部分。因为蛋白质是人体最重要的营养素,且在体内难以储存,故餐餐食用最佳。(每天保证一个鸡蛋和一袋牛奶,鸡鸭鱼肉换着吃)

食物丰胸可信吗?(营养误区)

民间和网上流传各种据说可以丰胸的食物,木瓜是最经常听到的一个。西柚、蹄筋、海参及猪脚、蜂蜜、莴苣...以及胶原蛋白、蛋白粉等保健品都曾名列其中。然而,食物(或保健品)丰胸是不折不扣的自欺其人。

先了解下乳房的解剖结构(如图)。

从深到浅依次为:肋骨、胸大肌、乳房后间隙、腺体组织(乳腺小叶和输入管)和脂肪组织。乳房的高度基本就由这5部分构成。

乳房怎样才能增大呢?

1.肋骨就不用说了,不管你如何吃,也不能使肋骨轮廓或厚度增加。

2.胸大肌发达的话,既可以增加胸围(围绕胸部一周的长度),又可以增加乳房的高度。但除非进行力量训练,否则肌肉不会仅仅因为吃哪种食物或者哪种保健品而发达起来。

3.乳房后间隙很小,正常情况下对乳房高度和胸围影响很小。但通过手术在该部位放置乳房假体(隆胸材料),可以使乳房增高增大,改变外形。但这些均与进食无关。

4.腺体组织,包括乳腺小叶和输入管的体积大小主要取决于先天遗传和激素(催产素、雌激素、孕激素)水平。妊娠期间乳腺增大即为这几种激素水平变化所致。正常饮食不含上述激素,故不能影响乳房腺体组织的大小。正常剂量的避孕药(雌激素或孕激素)对乳房腺体组织仅有轻微的刺激作用,一般不能达到丰胸目的。

5.脂肪组织是最易于变化的部分。增加进食量,尤其是高脂肪高糖类食物导致肥胖后,脂肪在胸部堆积,胸围会明显增加。但乳房高度,尤其是相对于胸壁的高度不会明显增加。恰好相反,由于乳房周围的胸部脂肪堆积更明显,乳房的高度被“埋没”,常常看起来乳房更小一些。另一方面,胸围大乳房高的人减肥后,胸围减少但乳房相对高度并不变小。

综上所述,食物只能改变胸部脂肪组织,而不能改变腺体组织或肌肉组织。而胸部脂肪堆积虽然增加胸围,但并不会使乳房增高增大。因此,依靠吃某种食物或保健品来丰胸(增加乳房高度和体积)是不可能的。除非它悄悄地添加了激素

类药物。

反过来想想吧,如果吃食物或者保健品真的能丰胸,那些国际大牌又何必冒着风险对乳房开动手术或/和植入假体。@王兴国

减肥的低脂饮食怎么做

想减肥是很多女性的希望,而低脂饮食是合理减肥饮食必不可少的一部分,但是很多人不知道什么是低脂饮食,低脂饮食要怎么做,今天给大家说说低脂饮食。

首先必须知道脂肪的来源有哪些?

脂肪主要来源于三类食物,一是食用油:如大豆油、花生油、玉米油、菜籽油、橄榄油等;

二是各种天然食物:各种肉(肥瘦都有)、蛋、大豆制品、坚果等高脂肪的食物;三是油脂的加工食品,如油炸食品、饼干、面包、方便面、汉堡、零食等。

知道来源成功一大步了,接下来是怎么控制的问题?

一、控制食用油

每天摄入15~20克左右(两汤匙)或更少一些的食用油,建议使用带刻度的油壶烹调,严格控制用量,(具体可参见:厨房革命降三高)。烹调避免用油炸油煎,

多蒸煮或者凉拌。坚决不用动物油,尽量选用单不饱和脂肪酸的山茶油和橄榄油。

二、肉类如何低脂

第1,选择“瘦”肉,如鱼虾、海鲜、鸡肉、兔肉、瘦猪牛羊肉等,尽量不选脂肪含量高的肉类,如肥肉、肥瘦肉、五花肉、肥牛肉、肥羊肉、猪排、牛排、鸭肉、鹅肉等。另外可以用大豆制品(不是大豆)代替一部分肉类。

第2,用脱脂牛奶或低脂牛奶代替普通牛奶;

第3,吃蛋去除蛋黄(蛋中脂肪主要在蛋黄)

第4,在烹调的时候把肉眼可见的脂肪剔除掉,如鸡皮、肥肉、肉皮、鱼子等。

三、控制零食

三种分析蛋白结构域的方法

三种分析蛋白结构域(Domains)的方法 1,SMART入门,蛋白结构和功能分析 SMART介绍 SMART (a Simple Modular Architecture Research Tool) allows the identification and annotation of genetically mobile domains and the analysis of domain architectures. More than 500 domain families found in signalling, extracellular and chromatin-associated proteins are detectable. These domains are extensively annotated with respect to phyletic distributions, functional class, tertiary structures and functionally important residues. Each domain found in a non-redundant protein database as well as search parameters and taxonomic information are stored in a relational database system. User interfaces to this database allow searches for proteins containing specific combinations of domains in defined taxa. For all the details, please refer to the publications on SMART. SMART(,可以说是蛋白结构预测和功能分析的工具集合。简单点说,就是 集合了一些工具,可以预测蛋白的一些二级结构。如跨膜区(Transmembrane segments),复合螺旋区(coiled coil regions),信号肽(Signal peptides),蛋白结构域(PFAM domains)等。 SMART前该知道的 1,SMART有两种不同的模式:normal 或genomic 主要是用的数据库不一样。Normal SMART, 用的数据库 Swiss-Prot, SP-TrEMBL 和 stable Ensembl proteomes。Genomic SMART, 用全基因组序列。详细列表:,一些名词解释 进行时 可以直接用各个数据库蛋白的ID。如Uniprot/Ensembl??ID / Accession number (ACC)。或是直接蛋白序列。运行SMART也可选择signal peptides、PFAM domains等的预测,勾上就是。看下图 SMART结果 运行后的结果用图表表示。其实运行后的结果都有明确的解释。详细请看下面。

蛋白质提取与制备的原理和方法

蛋白质提取与制备蛋白质种类很多,性质上的差异很大,既或是同类蛋白质,因选用材料不同,使用方法差别也很大,且又处于不同的体系中,因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的,大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异,主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例,其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液(如血浆、消化硫等)中,可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质,只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物,如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质,最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后,用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂,将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物,即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时,共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中,脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷(Digitonin)溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液,可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白 : 一般在等电点时不溶于水,但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白: 溶于水,可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70~80%乙醇中,不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水,也不溶于稀盐酸,易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸,易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸,易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异,除脂蛋白外,一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中,脂蛋白如脂肪部分露于外,则脂溶性占优势,如脂肪部分被包围于分子之中,则水溶性占优势。 蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有了不改进,但其主要原理仍不外乎两个方面: 一是利用混合物中几个组分分配率的差别,把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中,如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等; 二是将混合物置于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的,如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化,也不能蒸发,所能分配的物相只限于固相和液相,并在这两相间互相交替进行分离纯化。 制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度Word版

实验报告 学院:第二临床医学院专业:临床医学年级:2013级班级:1班姓名:学号:日期:2014,3,8 得分:实验课程:生物化学实验 实验名称:蛋白质的定量测定(五)——考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 【实验目的】 掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。 【实验原理】 考马斯亮蓝G-250(Coomassie G-250)是一种甲基取代的三苯基甲烷,分子中磺酸基的蓝色染料,在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液,引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移,在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595n处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收,因此可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定,适合于蛋白质类的定量分析尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高,最低测试蛋白质量在1ug左右。 【试剂与器材】 试剂: 考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇,加入100ml质量浓度为0.85g/ml 的磷酸,用蒸馏水稀释到1000ml。 标准蛋白质溶液:结晶牛血清清蛋白,预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量,然后根据该蛋白的纯度用0.15mol/LNacl配制成1.0mg/ml蛋白溶液。

器材: 试管和试管架 722型分光光度计 吸量管 移液枪 【实验步骤】 一、制作标准曲线 各管混匀后,静置3min,以0号管为空白管调零,在595nm波长下分别测定各管溶液的吸光度值(A595). 以A595值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘制标准曲线。 二、待测蛋白质浓度测定 测定方法同上,1ml待测蛋白质家5ml考马斯亮蓝试剂,。用上述0号管调零,测出血清的A595值。 【实验结果】

蛋白提取步骤

提蛋白及WB的步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作:前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、 当天准备:洗玻璃板、开紫外,冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、 开低温高速离心机 细胞裂解液配制: 1ml cell lysis 10ul NP-40(离心机后) 25ul 焦磷酸钠 40ul NaF 1ul β-甘油磷酸 2 ul Na3VO4 1ul 蛋白酶抑制剂(用完即放回冰箱) 10ul PMSF(最后加,随加随用,有毒) 细胞裂解和收集 1.观察细胞状态,并准备提蛋白:吸走培养基、用PBS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBS,左 右轻轻摇),倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上,加裂解液(体积网上推荐:一般106加),冰上静置1-2min。 3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往 上,从上往下全面刮,(刮的时候要迅速),最后用枪吸取裂解液至离心管。 细胞破碎 4.超声波破碎细胞:准备三个小烧杯,加满冰块,三个小夹子。(超声波破碎仪的铁棒不 要碰到离心管的壁和底部) 超声波设置: 工作功率5% 工作时间3min 开机时间15s,关机时间30s 温度0度, 报警温度1度 5.4℃、13000r/min,离心15min。(离心机用后一直保持打开的状态,) 蛋白保存 6.蛋白保存及分装:吸上清液至离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。-80℃保存。注意事项:PMSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30min内就会降解一半。样品处理超过1h,补加一次。

BCA测定蛋白浓度 1、测空白板,选差异较小的孔。 BCA测定法波长570,Bracford:595 2、标准蛋白的稀释(5mg/ul):分装1ml PBS来使用,稀释标准蛋白至ul。 取5ul标准蛋白+45ul PBS 3、加样: 浓度0 BSA(ul)0481216 PBS(ul)20161284 4、样品蛋白稀释20倍:2ul蛋白+18ul PBS 5、配BCA:每个孔200ul,一个样品2个重复,A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量, 一般防止损耗,多算一个样。 6、加BCA:悬空加、37℃孵育30 min。(手不能碰板的底部,影响测定结果) 7、计时30min 8、配分离胶,灌胶,加水封。 9、计时20min。 10、测蛋白:先振板、再设置参数。 11、计算上样体积: 12、配浓缩胶,灌胶,加梳子,等1-2min,出现缩胶的地方补上。 13、打开干式加热器 10、蛋白质上样:根据计算结果乘以稀释倍数,算出蛋白浓度,以体积最大的为准,其他用 水补足。(最大上样量为20ul,除去buffer的体积,蛋白质最大上样体积为16ul) 标记离心管 加样顺序:水、buffer(1/4)、蛋白、离心-涡旋-离心。100℃变性10min(迅速,确保变性程度一致) 11、计时10min ,变性10min。 12、安装电泳槽: 电泳液(1X):配制:90ml(10X)+810ml水(只能用一次) 液面刚覆盖胶,不能有气泡。 13、上样:maker 上样量为3ul。依次上样(吸样品时最好一次吸完)枪头不能撬板,笔直打进去 14、电泳 分离胶100V,20min左右、条带都跑开即可。 浓缩胶145V 1h 有等紫色部分跑到底结束。 转膜 准备工作:转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、PVDF膜 PVDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。 用海绵和滤纸之前先浸湿。 转膜:负极(黑板)海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-正极(白板)。 三层滤纸和膜都需要赶气泡。

蛋白质结构解析的方法对比综述 (1)

蛋白质结构解析的方法对比综述 工程硕士李瑾 摘要:到目前为止,蛋白质结构解析的方法主要是两种,x射线衍射法和NMR法,这两种方法各有优点和不足。 关键词:x射线衍射法 NMR法 到目前为止,蛋白质结构解析的方法主要是两种,x射线衍射法和NMR法。其中X射线的方法产生的更早,也更加的成熟,解析的数量也更多,第一个解析的蛋白的结构,就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和不足[1]。 首先是X射线晶体衍射法。该方法的前提是要得到蛋白质的晶体。通常是将表达目的蛋白的基因经PCR扩增后克隆到一种表达载体中,然后转入大肠杆菌中诱导表达,目的蛋白提纯之后摸索结晶条件,等拿到晶体之后,将晶体进行x射线衍射,收集衍射图谱,通过一系列的计算,得到蛋白质的原子结构[2]。 x射线晶体衍射法的优点是:速度快,通常只要拿到晶体,最快当天就能得出结构,另外不受肽链大小限制,无论是多大分子量的蛋白质或者RNA、DNA,甚至是结合多种小分子的复合体,只要能够结晶就能够得到其原子结构。所以x射线方法解析蛋白的关键是摸索蛋白结晶的条件。该方法得到的是蛋白质分子在晶体状态下的空间结构,这种结构与蛋白质分子在生物细胞内的本来结构有较大的差别。晶体中的蛋白质分子相互间是有规律地、紧密地排列在一起的,运动性较差;而自然界的生物细胞中的蛋白质分子则是处于一种溶液状态,周围是水分子和其他的生物分子,具有很好的运动性。而且,有些蛋白质只能稳定地存在于溶液状态,无法结晶[2]。 核磁共振NMR(nuclear magnetic resonance)现象很早就被科研人员观察到了,但将这种方法用来解析蛋白质结构,却是近一二十年的事情。NMR法具体原理是对水溶液中的蛋白质样品测定一系列不同的二维核磁共振图谱,然后根据已确定的蛋白质分子的一级结构,通过对各种二维核磁共振图谱的比较和解析,在图谱上找到各个序列号氨基酸上的各种氢原子所对应的峰。有了这些被指认的峰,就可以根据这些峰在核磁共振谱图上所呈现的相互之间的关系得到它们所对应的氢原子之间的距离。[3]可以想象,正是因为蛋白质分子具有空间结构,在序列上相差甚远的两个氨基酸有可能在空间距离上是很近的,它们所含的氢原子所对应的NMR峰之间就会有相关信号出现[4] 。通常,如果两个氢原子之间距离小于0.5纳米的话,它们之间就会有相关信号出现。一个由几十个氨基酸残基组成的蛋白质分子可以得到几百个甚至几千个这样与距离有关的信号,按照信号的强弱把它们转换成对应的氢原子之间的距离,然后运用计算机程序根据所得到的距离条件模拟出该蛋白质分子的空间结构。该结构既要满足从核磁共振图谱上得到的所有距离条件,还要满足化学上有关原子与原子结合的一些基本限制条件,如原子间的化学键长、键角和原子半径等[4]。 NMR解析蛋白结构常规步骤如下:首先通过基因工程的方法,得到提纯的目的蛋白,在蛋白质稳定的条件下,将未聚合,而且折叠良好的蛋白样品(通常是1mM-3mM,500ul,PH6-7的PBS)装入核磁管中,放入核磁谱仪中,然后由写好的程序控制谱仪,发出一系列的电磁波,激发蛋白中的H、13N、13C原子,等电磁波发射完毕,再收集受激发的原子所放出的“能量”,通过收集数据、谱图处理、电脑计算从而得到蛋白的原子结构[5] [6]。 用NMR研究蛋白质结构的方法,可以在溶液状态进行研究,得到的是蛋白质分子在溶液中的结构,这更接近于蛋白质在生物细胞中的自然状态[7]。此外,通过改变溶液的性质,还可以模拟出生物细胞内的各种生理条件,即蛋白质分子所处的各种环境,以观察这些周围环境的变化对蛋白质分子空间结构的影响。在溶液环境中,蛋白质分子具有与自然环境中类

考马斯亮蓝法测蛋白质

考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、原理 考马斯亮蓝G-25(Coomassie G-250是一种甲基取代的三苯基甲烷,分子中磺酸基的蓝色染料,在 465nm 处有最大吸收值。考马斯亮蓝 G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质一考马斯亮蓝复合物蓝色溶液,引起该染料的最大吸收入max的位置发生红移,在 595nm 处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在 595nm 处的光吸收远高于考马斯亮蓝在 465nm 处的光吸收,因此,可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定,适合于蛋白质类的定量分析,尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高,最低测试蛋白质量在 1ug 左右。 二、操作步骤 1. 标准曲线测定法 分别取六只试管,其中一只加入 1.0ml蒸馏水做空白,5只分别加入不同体积的浓度为 100ug/ml 牛血清清蛋白标准液,补充水到 1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂,摇匀放置5min,在紫外 -可见分光光度计 595nm 处测定吸光值。以 A595 吸光值为纵坐标,牛血清清蛋白的 ug 数量为横坐标绘制标准曲线。具体操作见下表。

蛋白质标准曲线测定加样 在标准蛋白质测定时,为了减小误差,每一个浓度的蛋白质做3支平 行管。 3?试剂配置 a. 牛血清清蛋白标准液结晶牛血清清蛋白或酪蛋白,预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光系数 是6.6来计算其百分含量。然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为 100 ug/ml的蛋白溶液。 b. 考马斯亮兰G— 250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G—250,溶于 50ml 95%的乙醇后,再加入100ml 85%的磷酸,用水稀释至1升

细胞总蛋白提取方法

细胞总蛋白提取方法 一、溶液配制 1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml 称取NaF 41.99mg,超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2.100 mM PMSF 3.RIPA溶液100ml 成分分子量终浓度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4) NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中,待溶解后加入HCl调pH值至7.4,定容至100 ml。 ※使用前加入 成分储存浓度加入量终浓度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl 二、方法 1.细胞收取 1)细胞传代至60mm培养皿中,待细胞融合约100%,收集细胞 2)弃培养基,加入PBS 2ml清洗培养皿一次,弃PBS。 3)加入0.05%胰酶2ml,37℃温育1min。 4)待细胞变形后,将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中,10,000rpm×3min,4℃ 5)弃上清,1ml预冷的PBS清洗沉淀,10,000rpm×

6)重复PBS清洗一次 7)弃上清,-80℃冻存待裂解 2.蛋白提取 1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS 1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin) 后冰上放置40mins 2)10,000rpm×15min,4℃ 将上清转移至一个新的ependorf 管中(约250μl)

蛋白质结构分析原理及工具-文献综述

蛋白质结构分析原理及工具 (南京农业大学生命科学学院生命基地111班) 摘要:本文主要从相似性检测、一级结构、二级结构、三维结构、跨膜域等方面从原理到方法再到工具,系统地介绍了蛋白质结构分析的常用方法。文章侧重于工具的列举,并没有对原理和方法做详细的介绍。文章还列举了蛋白质分析中常用的数据库。 关键词:蛋白质;结构预测;跨膜域;保守结构域 1 蛋白质相似性检测 蛋白质数据库。由一个物种分化而来的不同序列倾向于有相似的结构和功能。物种分化后形成的同源序列称直系同源,它们通常具有相似的功能;由基因复制而来的序列称为旁系同源,它们通常有不同的功能[1]。因此,推测全新蛋白质功能的第一步是将它的序列与进化上相关的已知结构和功能的蛋白质序列比较。表一列出了常用的蛋白质序列数据库和它们的特点。 表一常用蛋白质数据库 网址可能有更新 氨基酸替代模型。进化过程中,一种氨基酸残基会有向另一种氨基酸残基变化的倾向。氨基酸替代模型可用来估计氨基酸替换的速率。目前常用的替代模型有Point Accepted Mutation (PAM)矩阵、BLOck SUbstitution Matrix (BLOSUM)矩阵[2]、JTT模型[3]。 序列相似性搜索工具。序列相似性搜索又分为成对序列相似性搜索和多序列相似性搜索。成对序列相似性搜索通过搜索序列数据库从而找到与查询序列相似的序列。分为局部联配和全局联配。常用的局部联配工具有BLAST和SSEARCH,它们使用了Smith-Waterman 算法。全局联配工具有FASTA和GGSEARCH,基于Needleman-Wunsch算法。多序列相似性搜索常用于构建系统发育树,这里不阐述。表二列举了常用的成对序列相似性比对搜索工具

蛋白质提取方法

蛋白质提取方法-------列举10种方法 一、植物组织蛋白质提取方法(summer) 1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4 小时)。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜,样品制备完成。 蛋白质提取液:300ml 1、1Mtris-HCl(PH8)45ml 2、甘油(Glycerol)75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g 这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳! 二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1 小时),然后真空干燥沉淀,备用。 4、上样前加入裂解液,室温放置30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。 药品: 提取液:含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少! 三、组织:肠黏膜(newinbio) 目的:WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤: 含蛋白质上清液中加入异丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)倒转混匀,置室温10min 离心:12000 g,10min,4度,弃上清,加入0.3M盐酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE 用量)振荡,置室温20min 离心:7500g,5 min,4 度,弃上清 重复0.3M盐酸胍/95%乙醇步2 次 沉淀中加入100%乙醇2ml 充分振荡混匀,置室温20 min 离心:7500g,5min,4度,弃上清吹干沉淀,1%SDS溶解沉淀 离心:10000g,10min,4度 取上清-20 度保存(或可直接用于WESTERN BLOT) 存在的问题:加入1%SDS 后沉淀不溶解,还是很大的一块,4 度离心后又多了白色沉定,SDS 结晶?测浓度,含量才1mg/ml左右。 解决:提蛋白试剂盒,另外组织大小适中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮5-10分钟,

考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白

考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量 原理: 考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收在465nm,后者在595nm在一定蛋白质浓度范围内(1-1000μg),蛋白质与色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。 考马斯亮蓝G-250于蛋白质结合反应十分迅速,2min左右即达到平衡。其结合物在室温下1h内保持稳定。此法灵敏度高,易于操作,干扰物质少,是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低,且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。 材料、仪器设备及试剂 1、材料 小麦叶片、马铃薯块茎、或其他植物材料 2、仪器设备 分光光度计、研钵、烧杯、移液管 3、试剂 (1)标准蛋白质溶液:100μg·Ml-1牛血清白蛋白:称取牛血清白蛋白25mg,加水溶解并定容至100ml,吸取上述溶液40ml,用蒸馏水稀释至100ml即可。(2)考马斯亮蓝G-250溶液:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50ml90%乙醇中,加入100ml85%(W/V)的磷酸,再用蒸馏水定容到1L,贮于棕色瓶中,常温下可保存一个月。 方法: 1、标准曲线的绘制 取6支具塞试管,按表加入试剂。混合均匀后,向各管中加入5ml考马斯亮蓝 G-250溶液,摇匀,并放置5min左右,在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水量(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质含量(μg) 0 20 40 60 80 100 2、样品测定 (1)样品提取:取鲜样0.5g,加入2ml蒸馏水研磨,磨成匀浆后用6ml蒸馏水冲洗研钵,洗涤液收集在同一离心管中,在4000r/min下离心10min,弃去沉淀,上清液转入容量瓶,以蒸馏水定容至10ml,摇匀后待测。 (2)吸取样品提取液0.1ml,放入具塞试管中(每个样品重复2次),加入5ml 考马斯亮蓝G-250溶液,充分混合,放置2min后在595nm下比色,测定吸光度,并通过标准曲线查得蛋白质含量。 (3)结果计算(单位mg/g)样品中蛋白质含量=(C·VT)/(1000 VS·WF) 式中:C—查的标准曲线值(μg)

提取蛋白的常规方法

1、原料的选择 早年为了研究的方便,尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小,如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料, - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑,注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难,或含量 来源均理想,但分离纯化操作繁琐,反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系,如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶,马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性,对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性,用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时,原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质(本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白)时,不但 使用种属一定的原料,而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异(如饥饿时脂肪和糖类相对减少),采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验,则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分,对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎,使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织,其细胞破坏难 易不一,使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软,作普通匀浆器磨研即 可,肌肉及心组织较韧,需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有:①高速组织捣碎机(转速可达 10000rpm,具高速转动的锋利的刀片),宜用于动物内脏组织的破碎;②玻璃匀浆器(用两 个磨砂面相互摩擦,将细胞磨碎),适用于少量材料,也可用不锈钢或硬质塑料等,两面间

蛋白质提取与制备的原理和方法

蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多,性质上的差异很大,既或是同类蛋白质,因选用材料不同,使用方法差别也很大,且又处于不同的体系中,因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的,大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异,主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例,其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液(如血浆、消化硫等)中,可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质,只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物,如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质,最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后,用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂,将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物,即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时,共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类能溶于稀盐溶液中,脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷(Digitonin)溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液,可被50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水,但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水,可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70~80%乙醇中,不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水,也不溶于稀盐酸,易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸,易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸,易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异,除脂蛋白外,一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中,脂蛋白如

蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法

蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法 [实验目的] 学习、掌握考马斯亮蓝法(Bradford 法)测定蛋白质含量的方法 [实验原理] (蓝色)变为氨基酸芳香族 碱性 染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ??→?+ - [器材与试剂] 器材 722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂 1.标准蛋白质溶液,用牛血清清蛋白(BSA ),配制成1.00mg/ml 。 2.考马斯亮蓝G-250染料试剂:称100mg 考马斯亮蓝,溶于50ml 95%的乙醇后,再加入120ml 85% 的磷酸,用水稀释至1升。 [实验方法] 标准方法 1.取10支试管,分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白(或未知蛋白)、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后,立即在漩涡混合器上混合。 2.加完染料20min 后,使用722分光光度计,塑料比色皿,在595nm 处测量吸光度A 595。 3.用标准蛋白浓度(mg/ml )为横坐标,用A 595为纵坐标,进行直线拟合,得到标准曲线。根据测得的未知样品的A 595,代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) = ) 测定时提取液体积()样品重() 提取液总体积()查得的蛋白质(ml g ml g g ??/μ SDS 干扰实验 1.取5支试管,分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后,立即在漩涡混合器上混合。 2.加完染料20min 后,使用753分光光度计,塑料比色皿,在595nm 处测量吸光度A 595。 [实验数据与结果分析] (一)标准方法的数据和图 表1 考马斯亮蓝标准法实验表格

蛋白质的提取方法

沉淀法分级蛋白质: 水溶性蛋白质分子表面带有亲水性基团,因此很容易进行水合作用,顺利进入水溶液中。如果溶液的pH偏离等电点,则所有分子会带相同电荷,这进一步增进了它们的分散能力。因此,凡是能破坏蛋白质分子水合作用或者减弱分子间同性相斥作用的因素,都可能降低蛋白质在水中的溶解度,使其沉淀。常用的方法有盐析法和有机溶剂法。 (一)盐析法向蛋白质水溶液中加入中性盐,可以产生两种影响:一是盐离子与蛋白质分子中的极性和离子基团作用,降低蛋白质分子的活度系数,使其溶解度增加。在盐浓度较低时以这种情形为主,蛋白质表现为易于溶解,称为盐溶现象;二是盐离子也与水这种偶极分子作用,使水分子的活度降低,导致蛋白质水合程度的降低,使蛋白质溶解度减少。在盐浓度较高时这种情形起决定性作用,蛋白质便会沉淀,称为盐析现象。采用加入中性盐的方法使各种蛋白质依次分别沉淀的方法称为盐析法。 各种离子盐析能力的强弱可用Hofmeister序列表示: PO4>SO4>C2O4>(CHOHCOO)2>AC>Cl>NO3, K>Rb>Na>Cs>Li>NH4 实际工作中,常用的盐析剂是硫酸铵,因为它盐析能力强,在水中溶解度大,价格便宜,浓度高时也不会引起蛋白质生物活性的丧失。硫酸铵浓溶液的pH约为5.5,配置硫酸铵饱和溶液时,可在水中加过饱和量的硫酸铵,加温至50℃,至大部分盐溶解,室温放置过夜后,再用NaOH或硫酸调所需pH。 (二)有机溶剂沉淀法在等电点附近,蛋白质分子主要以偶极离子形式存在。这时如果添加有机溶剂,由于有机溶剂有较低的介电常数,会使溶液介电常数减小,根据库伦定律,这样会增强偶极离子之间的静电引力,从而使分子聚集沉淀。另一方面,有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层,也促使蛋白分子脱水沉淀。选用有机溶剂的原则是:1.必须能与水完全混溶;2.不与蛋白质发生反应;3.要有较好的沉淀效应;4.溶剂蒸汽无毒,且不易燃。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。在低介电常数环境中,蛋白质分子基团间的作用力会受到影响,超过限度时会使蛋白质变性。因此,有机溶剂沉淀法一般都要在低温下进行。蛋白质分子本身是多价离子,对溶液介电常数有相当贡献。当蛋白浓度太低时,如添加有机溶剂过度会产生变性现象,若这时加入介电常数大的物质(如甘氨酸),可避免蛋白变性。蛋白浓度高时,介电常数也相应提高,可以减少蛋白变性。 (三)有机聚合物沉淀法除了盐和有机溶剂能使蛋白质沉淀外,水溶性中性高聚物也能沉淀蛋白质。分子量高于4000的PEG可以非常有效地沉淀蛋白质。最常用的使分子量6000和20000的PEG。PEG可以看作是聚合的有机溶剂,其作用原理可能与有机溶剂类似。聚丙烯酸可以沉淀带正电蛋白质。聚丙烯酸分子上有相当多的羧基,碱性蛋白质含较多的碱性基团,羧基和碱性基团形成盐键,则把聚丙烯酸和碱性蛋白结成成很大颗粒沉淀下来。沉淀时碱性蛋白与溶液分开,加入钙离子后,聚丙烯酸成钙盐,蛋白质则游离出来。

标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量(精)

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量 一、标准曲线 一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。 二、蛋白质含量测定方法 1、凯氏定氮法 2、双缩脲法 3、Folin-酚试剂法 4、紫外吸收法 5、考马斯亮蓝法 三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 (一)、试剂: 1、考马斯亮蓝试剂: 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)H3PO4。 2、标准蛋白质溶液: 纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。 (二)、器材: 1、722S型分光光度计使用及原理()。 2、移液管使用()。 (三)、标准曲线制作: 1、 2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、

40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。 1)、利用标准曲线查出回归方程。 2)、用公式计算回归方程。 3)、或用origin作图,测出回归线性方程。即A595nm=a×X( )+6 一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上。 4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。 (四)、蛋白质含量的测定: 样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。 一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。 (五)、注意事项: 1、玻璃仪器要洗涤干净。 2、取量要准确。 3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。 4、对照:用被测物质以外的物质作空白对照。

蛋白提取方法

?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、1组织与细胞得来源: ?1。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(>40,000g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCA) 丙酮 二硫苏糖醇(DTT) ?尿素?CHAPS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝R350 ?抑肽素A?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。1、4溶液配制?(1) PBS: ?NaCl8g,KCl 0、2 g,Na2HPO4 1。44 g,KH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pH至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)EDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2H2O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0(约需2 g NaOH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(3) 亮肽素储存液(50 μg/ml,100×) 10mg/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ml储液,-20℃保存; (4) 抑肽素储存液(70μg/ml,100×) 1 mg/ml溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成70 μg/ml储液,-20℃保存; (5) PMSF储存液(10mM,100×): 17.4mgPMSF,溶于1ml异丙醇中,—20℃保存。?DTT储存液(1 M): ?0。31gDTT溶于2 mlH2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis buffer A (9M urea,4%w/v CHAPS, 1%w/v DTT, 0.5%CA and a cocktailof proteaseinhibitors)??Lysis buffer B (7 M urea, 2M thiourea,4% w/v CHAPS, 1%w/v DTT,0、5% CA andacocktailofprotease inhibitors) ?Lysisbuffer C 40 mMTris-base (pH 9。5)inultrapure H2O Lysis buffer D (8 Murea, 4%CHAPS, 40mM Tris(base), 40 ml) ?Lysis buffer E ?(5M urea, 2 M thiourea, 2%SB3-10, 2%CHAPS,1% w/v DTT, 0、5% CAandacocktail ofprotease inhibitors) 100μL SDSsample solution (1% w/v SDS, 0、375M Tris-HCl, pH8。8, 50 mM DTT,25%v/vgly ?LysisbufferF? cerol) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DTT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物[3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml or 1 mM EDTA 0、3mg/ml (1 mM) 抑肽素 0。7 μg/ml?亮肽素 0、5μg/ml? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 1、2.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1]?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(3)将粉末悬浮于含DTT(0。2%w/v)得10%三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–20℃沉淀过夜; ?(5)35000×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含0.2%DTT得预冷丙酮中; ?(7)-20℃放置1h; 35000×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×g,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(50-100mg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Bradford法[2]测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品

蛋白质的十种提取方法

蛋白质的十种提取方法.txt大人物的悲哀在于他们需要不停地做出选择;而小人物的悲哀在于他们从来没有选择的机会。男人因沧桑而成熟,女人因成熟而沧桑。男人有了烟,有了酒,也就有了故事;女人有了钱,有了资色,也就有了悲剧。蛋白质提取方法-------列举10种方法 [ 来源:绿谷生物网点击数: 4587 更新时间: 2008年05月30日 ][ 收藏本文 ] 一、 植物组织蛋白质提取方法(summer) 1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液,可根据材料不同适当加入),准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4 小时)。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜,样品制备完成。 蛋白质提取液:300ml 1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml 2、甘油(Glycerol)75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g 这种方法针对SDS-PAGE,垂直板电泳! 二、 植物组织蛋白质提取方法 (summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1 小时),然后真空 干燥沉淀,备用。 4、上样前加入裂解液,室温放置30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm 以上1小 时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。 药品: 提取液:含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M 的 DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少! 三、 组织:肠黏膜(newinbio) 目的:WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达

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