蛭弧菌数量检测报告

蛭弧菌数量检测报告

1实验材料

1.1实验仪器

PH240A型培养箱上海一恒科技有限公司

LD4-40型离心机北京医用离心机厂

DHG-9078A型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司

ARC120型电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司

LXJ-IIB型低速大容量多管离心机上海安亭科学仪器厂

MJ-Ⅱ型霉菌培养箱上海一恒科技有限公司

BCM-1000A 生物洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司

HH-Zu 一列四孔表显水浴锅郑州长城科工贸有限公司

B1-220A 生物显微镜北京麦克奥迪仪器仪表有限公司

LDZX-40SCI型立式自动电热压力蒸气灭菌器上海申安医疗器械厂

1.2实验药品

牛肉浸膏生物试剂天津市英博生化试剂有限公司

蛋白胨生物试剂天津市英博生化试剂有限公司

琼脂生物试剂BIOSHARP 日本分装

盐酸分析纯天津市赢达稀贵化学试剂厂

NaOH 分析纯天津北方天医化学试剂厂

NacL 分析纯天津市塘沽化学试剂厂

Tris 分析纯华北地区特种化学试剂开发中心

1.3 宿主菌

大肠杆菌E.coli 天津农学院保藏菌种

2 检测步骤

蛭弧菌数量检测方法有两种，分别为自来水宿主双层平板和TRIS-YP培养基双层平板，视情况选择，两者出斑情况相差不大。培养基配制及使用方法如下：

1 自来水宿主双层平板培养基的配制及双层平板的制作

1.1 自来水宿主双层平板培养基的配制

(1)下层培养基采用煮沸后的自来水配制，琼脂含量为1%，pH值调节到7.2-7.4。

(2)上层培养基也采用煮沸后的自来水配制，琼脂含量为0.5%，pH值调节到7.2-7.4。

(3)灭菌：121℃高压灭菌20min。

1.2 自来水宿主双层平板的制作

1）样品的制作：采用梯度稀释法将蛭弧菌菌悬液稀释到不同浓度，准备加样。

2）倒下层培养基：在超净工作台中将灭过菌的下层培养基倒入无菌的培养皿中，每个平皿倒大约10毫升，只要把平皿底部盖过即可，倒的太多影响噬菌斑的观察。倒完下层培养基尽量不要移动平皿，以保持下层培养基平整。

3）蛭弧菌样品的制作：以无菌操作，将无菌水加到灭菌的空试管中，每支试管用无菌吸量管加9mL。用1mL灭菌吸量管吸取澄清的发酵液1mL慢慢注入9mL无菌水中，注入时应降吸量管悬空严禁伸入试管中液体中，尽量避免碰触试管中液体。用一支新的1mL吸管，吸入、吸出反复3次，制成1:10稀释液。以此类推，将发酵液的浓度稀释成10-1——10-7七个梯度。

4）加样：待下层培养基凝固后加入不同稀释度的蛭弧菌样品。灭过菌的上层培养基应放到60℃水浴锅中保温，防止琼脂凝固。

5）倒上层培养基：把保存的高浓度大肠杆菌菌悬液放到37℃培养箱中，使其温度达到37℃左右。然后倒入已冷却到45℃左右的上层培养基中，这样经过升温处理后的高浓度菌悬液加入到上层培养基中时可以防止培养基过早凝固。将含有大肠杆菌的上层培养基摇匀，此时上层培养基中大肠杆菌的浓度应为108——109cfu/mL。把含有大肠杆菌的上层培养基倒到已加完蛭弧菌样品的下层培养基表面，晃动平皿使上层培养基与蛭弧菌样品混匀，但要防止上层培养基产生气泡以及溅到平皿盖上。

6）培养：待所有双层平板彻底凝固后，放到30℃（高温蛭弧菌37℃）的培养箱中培养，箱中应保持一定的湿度，以免上层培养基脱水，24h后将平皿倒置培养。这样可以防止冷凝水留到上层培养基表面，从而减少染菌几率。一般培养3d—4d就可以出现噬菌斑，噬菌斑的生长速度很快，所以一定要注意观察。

2 TRIS-YP双层平板培养基的配制及双层平板的制作

TRIS-YP培养基：酵母膏3g，蛋白胨0.6g，Tris-Hcl缓冲液（0.05M,pH 7.5）1000mL。

1）下层培养基：将12g琼脂溶于1L蒸馏水中，121℃灭菌20min。等温度降到60℃时加入100mL已灭菌的TRIS-YP培养基，然后倒平板。将凝固的平板保持在室温下2-3天。

2）上层培养基：在试管中放5mL蒸馏水和0.6%琼脂，121℃灭菌20min。待其冷却到45℃时加入已灭菌的0.5mLTRIS-YP培养基和0.5mL不同稀释度的蛭弧菌菌悬液以及0.5mL大肠杆菌高浓度菌悬液，混合均匀后倒上层平板。倒完后要等其自然冷却凝固后才能移到培养箱中，否则容易导致上层培养基不均匀，影响出斑。

3）培养：待所有双层平板彻底凝固后，放到30℃（高温蛭弧菌37℃）的培养箱中培养，箱中应保持一定的湿度，以免上层培养基脱水，24h后将平皿倒置培养。这样可以防

止冷凝水留到上层培养基表面，从而减少染菌几率。一般培养3d—4d就可以出现噬菌斑，噬菌斑的生长速度很快，所以一定要注意观察。

注意事项：

1、制作宿主双层平板的过程应该在无菌环境下进行。

2、对样品进行梯度稀释时把空试管和无菌水分开灭菌，稀释前再用无菌吸量管把无菌

水加入，这样可以避免灭菌前向试管中加水时由于灭菌时升温造成水分的蒸发，从而减小误差。

3、稀释时一个试管对应一根吸量管，严禁混合使用。从一个浓度吸取1mL样品加到下

一个试管时使用的吸量管，要悬空加样，不要碰到试管壁和试管中的液体，加样完毕后换新的吸量管加下一个浓度。

4、如果吸量管标注吹字，就在加样时用吸耳球吹下管口的剩余液体。如果为标注就将

吸量管的末端在试管壁上轻轻接触即可。