化学发光法及其应用

化学发光法及其应用

摘要：对近年来化学发光分析法的研究应用最新进展作了评述,包括化学发光体系的类型,化学发光法的新方法，化学发光在无机、药物分析及食品中的应用。

关键字：化学发光法；化学发光体系；应用；

化学发光是在没有光、电、磁、声、热源激发的情况下，由化学反应或生物化学反应产生的一种光辐射。以此为基础的化学发光化学发光(Chemiluminescence ，简称CL)分析法是近30 年来发展起来的一种高灵敏的微量及痕量分析法，由于可以进行发射光子计量，又没有外来激发光源存在时散射光背景的干扰，因而具有很高的灵敏度(检出限可达

10-12-10-21mol)，很宽的线性范围(3-6个数量级)，同时仪器设备又很简单、廉价、易微型化，在二十世纪的最后十年发展非常迅速。

近来,在改进和完善原有发光试剂和体系的同时，新发光试剂的合成,新体系的开发，与其它技术的联用，尤其是流动注射技术，传感器技术，HPLC 技术及各种固定化试剂技术的联用，更显示出化学发光分析快速，灵敏，简便等优点，也进一步拓宽了化学发光的应用范围。并且，化学发光在多类复杂有机物质，如氨基酸、蛋白质、维生素、核酸、DNA、激素、生物碱及各类药物及毒物的检测，多种生物活性物质的分析，多种抗体和抗原的免疫分析，基因芯片、蛋白质芯片、受体芯片、酶芯片、微流控芯片研究中得到了广泛地应用，而且呈现出上升趋势。为生命科学、环境科学、材料科学的研究提供了许多新的、高灵敏度的、有效的分析手段，推动了这方面科学理论和高新技术的发展；同时，其他相关学科的研究成果也为化学发光和生物发光提供了许多新的技术和手段，出现了许多新的化学发光和生物发光法，如纳米发光、发光成像、发光活体分析，大大促进了化学发光的发展及应用。本文将从以下几个方面论述化学发光分析法。

1 化学发光分析法的原理

化学发光(Chemiluminescence，简称CL) 分析法是分子发光光谱分析法中的一类，是指物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或发光总量来确定组分含量的分析方法叫化学发光分析法[1]。

换句话说，化学发光是指吸收了化学反应能的分子由激发态回到基态时所产生的光辐射现象, 广义的化学发光也包括电致化学发光。一个化学反应要产生化学发光现象, 必须满足

以下条件: 第一是该反应必须提供足够的激发能, 并由某一步骤单独提供, 因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光；第二是要有有利的反应过程, 使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态；第三是激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子, 或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子。化学发光反应所以能用于分析测定，是因为化学发光强度与化学反应速度相关联，因而一切影响反应速度的因素都可以作为建立测定方法的依据。

化学发光反应一般可表示为:

A +

B →C* (1)

C*→C+ hν (2)

化学发光强度( I CL ) 取决于反应的速度(dP/dt) 和化学发光量子效率(ΦCL)

ICL(t)= ΦCL dP/dt (3)

式中ΦCL可表示为: ΦCL=ΦrΦf, 其中Φr为生成激发态产物分子的量子效率,Φf为激发态产物分子的发光量子效率。

对于一定的化学发光反应, ΦCL为一定值, 其反应速度可按质量作用定律表示出与反应体系中物质浓度的关系。因此, 通过测定化学发光强度就可以测定反应体系中某种物质的浓度。原则上讲,对任何化学发光反应, 只要反应是一级或假一级反应, 都可以通过公式(1) 进行化学发光定量分析。例如, 在上述化学发光反应中, 如果物质B保持恒定, 而物质A的浓度变化并可视为一级或假一级反应, 则:

I CL=∫I CL(t)dt=∫ΦCL〔dA(t)/dt〕dt=ΦCL C A (4)

即化学发光强度与A 的浓度成正比。

化学发光分析测定的物质可以分为三类: 第一类物质是化学发光反应中的反应物; 第二类物质是化学发光反应中的催化剂、增敏剂或抑制剂; 第三类物质是偶合反应中的反应物、催化剂、增敏剂等。这三类物质还可以通过标记方式用来测定人们感兴趣的其他物质, 进一步扩大了化学发光分析的应用范围[2]。

2 化学发光体系

2.1 鲁米诺化学发光体系

鲁米诺及其衍生物是使用最广泛的化学发光试剂之一。通过对鲁米诺类衍生物的氨基进行烷基化,增强鲁米诺及其衍生物的发光效率,一些性能优异的鲁米诺类衍生物( 图1 ) 已被研究并在生物、医药分析中广泛应用。由于鲁米诺类试剂苯环上的取代基对鲁米诺类试剂的发光性能影响较大,改变苯环上的取代基,人们研制了多种新型鲁米诺衍生物。它们主要分为两类:鲁米诺类发光衍生化试剂和鲁米诺类发光标记试剂[3]。

图1 鲁米诺类衍生物

鲁米诺化学发光体系已被广泛地研究和应用，已成功地用于测定痕量过氧化氢、空气中的氧、DNA杂交分析、生化免疫分析、滴定分析终点指示以及多种金属离子的测定，如Cu(Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Ag(I)、Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)、Fe(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、V(Ⅴ)、05(Ⅲ)、As(Ⅲ)等，也用于多种无机阴离子的测定，如CN-、SO32-、PO43-、NO2-、S2-、Cl-、Br-等。鲁米诺的衍生物ABEI，作为化学发光标记物己广泛地用于免疫分析。此外，鲁米诺及其衍生物化学发光体系也己广泛用于液相色谱和毛细管电泳的检测器。鲁米诺化学发光反应文献中已有很多报导，近年来，鲁米诺化学发光体系在多种金属离子测定、农药检测、人体血液、药物及保健品抗自由基能力的评价，用辣根过氧化物酶(HRP)标一记的酶联免疫分析中的应用以及药物分析等方面都发挥了重要作用；此外，人们也发现了一些新的鲁米诺发光反应的催化体系。

2.2 吖啶类化学发光体系

吖啶类衍生物,包括吖啶、吖啶酯及其衍生物,是一类优良的标记试剂和发光试剂。通过在吖啶环上9- 位的碳原子上链接具有特征结构的取代基,新的具有特殊性能的吖啶类化学发光标记试剂已广泛应用于生物和药物分析[4][5]。

尤其是吖啶酯化合物。这类化合物只要在过氧化氢和碱存在下就迅速产生化学发光，且有很高的发光效率，如吖啶芳香酯的量子产率可高达0.05。过氧化氢在C-9位发生亲电加成生成过氧化物，过氧化物经过过渡态二氧乙烷酮分解成激发态的N一甲基吖啶酮和CO2，前者返回到基态发出约430nm的光子。吖啶酯也能通过不发光的途径分解生成最终产物N-甲基吖啶酮。研究表明，分解历程受离去基团的性质、过氧化物的浓度、溶液pH值的影响。离去基团共扼酸的pKa小于H2O2(pKa=12)的pKa时有较高的发光效率。吖啶酯的化学发光量子产率比鲁米诺要高，是化学发光免疫分析和DNA发光探针中最重要的化学发光标记物，已广泛地用于多种传染疾病的灵敏检测和诊断。

2.3 1,2-二氧环乙烷类化学发光体系

自1969 年Kopecky 和Mumford 合成1,2- 环氧乙烷以来,1,2-二氧环乙烷及其衍生物是一

类重要的化学发光试剂。通过选择环烷烃、苯基、蒽基、烷氧基等不同取代基修饰1,2- 二氧

环乙烷,改变1,2-二氧环乙烷衍生物的发光和分解动力学性质, 1,2-二氧环乙烷类衍生物得到

不断发展。

1，2-二氧杂环丁烷类化合物化学发光反应机理的研究不仅具有理论意义，也有实际意义。主要在于许多化学发光反应和生物发光反应的中间体都涉及到氧杂四元环的生成，而这类化合物由于其结构上的简单性，十分有利于进行实验和理论探讨，其理论的发展必然深化对化学发光和生物发光本质的认识。同时，这些研究手段也为其他化学发光反应的研究提供许多可供借鉴之处。在分析化学也受到注意。利用1，2-二氧杂环丁烷类化合物作为化学发光探针和标记物，由于其刚性结构可方便地通过控制温度而产生化学发光，从而获取某一点的信息。根据发光位点的信息，就能实现对生物体系进行“原位”或“在位”(on-site)研究。

2.4 铈( IV) 化学发光反应体系

在酸性介质中,Ce(IV)可以和许多物质发生氧化还原反应从而产生荧光特性或化学发光，利用该反应已经建立了一些化合物的测定方法。何治柯等人发现铈(IV)可以氧化钌( II)2联吡啶从而产生比较微弱的化学发光现象，并且发现α-羟基羧酸、巴比妥酸、丙酮酸、抗坏血酸、盐酸小檗碱[6]等作为增敏剂，对该反应有显著的增强作用，其增强的强度跟被测物质的浓度成正比，据此建立起一系列测定有机酸的新方法。并在此基础上提出了偶合化学发光机理，指出增强化学发光与有机酸结构的关系。王园朝等[7]还研究了Ce(IV)在增敏剂

Ru(phen)2+3存在时氧化SO2-3的化学发光特性，并用于测定葡萄酒中亚硫酸盐总含量，取得了满意结果。在酸性介质中，铈(IV)还可以与某些含有巯基的化合物发生发光反应。头孢类β-内酰胺抗生素、卡托普利、阿莫西林等有机化合物都可以在酸性介质中水解，产物中有巯基从而与铈(IV)可以产生弱发光，利用一些荧光物质如奎宁、吡哌酸、罗丹明B或罗丹明6G 等以及金属离子的增敏测定了如青霉胺、巯基酰甘氨酸、双氢克尿噻、氟罗沙星、头孢类β-内酰胺类抗生素、阿莫西林、吩噻嗪、氧乐果以及抗高血压药物卡托普利(巯甲丙脯酸) 等。同时也可以利用某些物质对铈( IV) 发光体系的抑制作用进行测定. 如赵亚娟等人[8]发现尼莫地平对铈( IV) 与Na2 CO3化学发光体系的抑制作用，据此建立了测定尼莫地平的新方法。以往测定亚硝酸根多用光度法、离子色谱法、荧光法等，前面这些方法多基于重氮化-偶联反应，所用试剂毒性较大，后者虽有较高灵敏度，但测定有色水样有困难。

2.5 钌( Ⅱ)联吡啶配合物化学发光体系

钌( Ⅱ)联吡啶配合物也是常用的化学发光体系之一。它具有独特的化学稳定性、氧化还原性和发光性。在酸性介质中,Ru(bpy)32+被氧化剂氧化成Ru(bpy)33+,然后与还原分析物反应产生化学发光以检测这些还原分析物。利用该体系可以检测二甲基亚硝胺、脯氨酸和四环

素类等。

THONGPOON等[9]基于高氯酸存在下,Mn(Ⅱ)对头孢菌素族抗菌素- Ru(bpy)32++2KMnO4的化学

发光反应的催化作用,建立了一种快速、灵敏检测甲氧噻吩头孢菌素、头孢菌素Ⅴ、头孢菌素Ⅳ、头孢羟氨下、氯氨下头孢菌素等6种头孢菌素族抗菌素的FI-CL新方法。WEI等[10]利用Ru(bpy)32+-PbO2化学发光体系,检测了甲氧萘丙酸,线性范围为2×10-8～6×10-6 mol/L，检出限达l.0×10-8mol/L。测定了甲氧萘丙酸和蛋白质间的键合常数和人血清白蛋白平衡液中的甲氧萘丙酸未键合片段。该项研究为研究甲氧萘丙酸和蛋白质之间的相互作用提供了一种灵敏、可靠和简单的技术，并在监测可能存在的药物滥用及防止不必要的人类健康风险等方面，具有较好的应用前景。

3 其他新技术

3.1化学发光免疫分析

化学发光免疫分析(CLIA ) 是借助于化学发光反应的高灵敏性和免疫反应的高特异性而建立的一种测定方法, 是继荧光免疫分析法、酶免疫分析法和放射免疫分析法之后, 在近年来迅速发展起来的一种新型免疫分析技术[11]。它包括标记化学发光物质的化学发光免疫分析、标记酶的化学发光酶免疫分析和标记荧光物质的荧光化学发光免疫分析。1977 年,Halm an 第一次把化学发光与免疫分析结合, 1980 年化学发光免疫分析(CLIA ) 一词开始出现, 90 年代以来, CLIA 发展更为成熟, 应用领域更为广泛。

由于化学发光免疫分析是以发光剂标记或酶标记进行测定的,使其灵敏度可以赶上甚至超过放射免疫分析。章竹君等[12]在国内最早建立了偶合反应化学发光酶联免疫分析法,成功地应用于流动出血热病人的IgM 和乙型肝炎病人表面抗原抗体、甲胎蛋白、铁蛋白等的测定。他们还以HRP 标记粪样中的轮状病毒,将双孵式免疫技术改进成单孵式多层免疫技术, 以鲁米诺增强化学发光测定了轮状病毒,方法的灵敏度是常规化学发光酶联免疫分析的4倍,特异性、阳性检出率均有提高。Brown等[13]用苯氧取代的吖啶酯作为葡萄糖氧化酶活性的长寿命发光指示剂, 测定促甲状腺激素(TSH) 的检出限可达0.18fmol,线性范围为0.2-1. 65pmol/孔。但化学发光免疫分析也存在一些缺陷,如影响的因素较多、稳定性较差以及样品的发光不能再现等。最近,由IGEN 和BoehringerM annheim公司研制的免疫电化学发光(IECL)是一种更先进的发光免疫分析技术。它具有电化学和化学发光免疫分析的特点,已用于多种抗体、抗原和标记物的分析。Fuerst 等[14]报道了游离甲状腺(FT4)、人绒毛膜促性腺素(HCG) 和促甲状腺素(TSH) 的IECL 测定。Obenauer-Kutnre等[15]用夹心IECL方法测定了未稀释血清样品中的重组干扰素(IENα-26),该方法的准确度优于酶联免疫分析法(ELISA )。

3.2 流动注射化学发光分析法

1975年丹麦学者Ruzicka 与Hansen首次提出流动注射分析,目前流动注射分析方法的应用已渗透到分析化学的各个领域,从而促进了分析的自动化。流动注射作为一种自动化、简便易操作的进样和分离富集技术，可与多种化学分析手段如吸光光度法、原子光谱法、电化学以及发光分析法等联用。化学发光分析由于通常所使用的发光反应速度很快，难以保证样品与发光试剂能够快速、有效、高度重现的混合，从而导致选择性和重现性较差，限制了它的应用。将流动注射技术与化学发光分析相结合产生的流动注射化学发光分析法集两者的优点于一身，它是反应产物之间或反应产物与体系中某种组分发生化学反应，产生光辐射，用光电倍增管等光电元件检测发光强度!，根据发光强度与待测物浓度间的线性关系进行分析的一种方法。流动注射化学发光分析法是一种操作简便、快速灵敏的分析方法，具有可控性强、灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单等优点，在生物、医学、药学、环境科学、食品等诸多领域中受到人们的广泛关注[16]。

流动注射化学发光法以其灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、操作方便快捷等特点而被广泛应用于生物、医学及药学分析中，大大提高了生物、医学、药学分析的检测水平。

4 化学发光法在各领域的应用

4.1 化学发光法在无机化合物分析中的应用

4.1.1 无机阳离子分析

利用化学发光法可以测定许多无机阳离子。可以利用某些具有还原性的无机阳离子和发光试剂作用对其进行测定；有些离子对化学发光反应有增强或抑制作用，基于此，可直接测定此类离子。此外，可利用置换偶合反应间接测定某些离子。李卫华等[17]基于Hg(Ⅱ)置换Fe(Ⅱ)-EDTA 配合物中的Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅱ)-鲁米诺溶解氧产生化学发光的反应，建立了置换偶合反应流动注射化学发光测定痕量汞离子的新方法，检出限为3×10-8g·mol-1，方法成功用于工业废水中汞的测定。

4.1.2 无机阴离子及化合物分析

在无机阴离子及化合物分析中,化学发光也得到了广泛应用。许申鸿[18]采用“CuCl-H2O2-邻菲罗啉-碳酸盐缓冲液”作·OH 产生体系，研究了产生和检测·OH 的新化学发光体系，对于研究筛选清除·OH 的药物有一定应用价值。高岐[19]将亚硝酸盐在酸性条件下氧化亚铁氰化钾为铁氰化钾的反应，和尿酸-铁氰化钾-鲁米诺化学发光反应相偶合，建立了一种间接测定亚硝酸根离子的新方法，用于环境水样及食品中亚硝酸盐的测定，取得满意效果。4.2 化学发光法在药物分析中的应用

4.2.1 抗生素的测定

抗生素也叫抗菌素, 是以消除病源微生物一类的特效药物此类药物可分为β—内酞胺

类、大环内酸类、四环素类、氨基糖苷类、抗肿瘤类和其它抗生素类药物。阿莫西林、青霉素、头孢氨苄和头孢拉定、等许多抗生素药物可被高锰酸钾或等Ce(Ⅳ)强氧化剂直接氧化产生发光而被测定,氧氟沙星、琥乙红霉素一些抗生素可通过对鲁米诺体系的化学发光具有增强或抑制作用而被测定近年来化学发光法测定药物的文献报道还有妥布霉素、吡哌酸、氨基喋吟、盐酸小蘗碱、金霉素、氯霉素、洛美沙星、利福平、美洛昔康等。

4.2.2 维生素的测定

维生素是人体的六大营养要素之一, 是维持机体正常代谢和机能的必需物质, 常用的

维生索可分为水溶性维生素和脂溶性维生素两大类。目前化学发光法对维生素C测定的研究较多, 检出限达10-3mol/L。维生素的测定多采用鲁米诺化学发光体系, 通过间接法、抑制法、增强法进行测定, 取得满意结果。此外, 芦丁、叶酸等也可通过化学发光法测定, 检出限在10-7～10-8数量级。

4.2.3 中枢神经系统药物的测定

化学发光法用于检测麻醉剂、镇痛剂、兴奋剂等中枢神经系统药物, 充分发挥了其灵敏度高的优点。吗啡类生物碱具有镇痛、中枢抑制、呼吸抑制等作用, 孙宇峰等[20]以酯酶为脱乙酰剂, 促使海洛因分子水解生成吗啡, 采用吗啡-普米诺-过氧化氢体系建立了快速、灵敏的海洛因检侧方法, 检出限为3×10-9mol/L。熊迅宇等利用高锰酸钾-Na2SO3化学发光体系测定对乙酰氨基酚, 检出限为(3R)2.0×10-9mol/L。已有文献报道的中枢神经类药物包括盐酸多巴胺、奋乃静、盐酸丙卡特罗、盐酸利多卡因、氯丙嗪和异丙嗪等。

4.2.4 氨基酸的测定

化学发光法直接用于氨基酸的测定受到的干扰因素较多, 结合高效液相色谱、毛细管电泳等分离技术, 采用化学发光法柱后检测, 方法的选择性和灵敏度非常高采用。采用

[Ru(bipy)3]2+作为发光活性物质, 可通过电致化学发光法测定多种氨基酸, 不仅具有化学

发光分析的灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点, 而且具有电化学分析控制性强、选择性好等优点。半胱氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酸、酪氨酸等许多氨基酸的化学发光分析均有文献报道。

4.2.5 其它药物的测定

除上述以外, 化学发光法还广泛用于测定生物碱、激素、循环系统药物等各种药物, 包括银杏黄酮、盐酸青藤碱、硫酸长春新碱、丹皮酚、孕酮、己烯雌酚、肾上腺素、氢化可的松、酚妥拉明、卡托普利、多巴酚丁胺、硫酸沙丁胺醇、异烟肼等[20]。

4.3化学发光法在食品中的应用

具有操作简便、快速、选择性好等优点的流动注射化学发光法，现也被广泛应用于食品

检测中。卢利军等基于叔丁基茴香醚(BHA)和2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)与铬(Ⅵ)发生氧化还原反应,产生的铬(Ⅲ)可催化Luminol-H2O2化学发光体系,结合流动注射技术,建立了一种高灵敏度的快速测定BHA与BHT的新方法。该方法的线性范围为2.0×10-9～4.0×10-5mol/L和2.8×10-9～1.0×10-5mol/L，检出限为6.0×10-10和8.0×10-10，RSD分别为1.2%和1.4%和（1.0×10-7mol/LBHA和BHT，n=11)。该方法具有灵敏度高、准确性好、线性范围宽等优点，用于进口食品中痕量BHA和BHT的测定,结果令人满意。李卫华等基于Fe(Ⅲ)氧化SO32-生成Fe(Ⅱ)的反应和Luminol-O2- Fe(Ⅱ)化学发光反应相偶合,建立了流动注射化学发光测定SO32-的方法。该方法用于食品中SO32-的测定，结果令人满意，朱粉霞等研究了表面活性剂对痕量Pb(Ⅱ)催化H2O2氧化鲁米诺-邻菲啰啉化学发光反应的影响.以吐温-20为增敏剂,建立了增敏反应化学发光测定痕量铅的新体系。PH范围由原来的3拓宽为3～8。该方法可用于食品营养添加剂——丙酸钙、乳酸钙、醋酸钙和卵黄高磷蛋白中铅的测定，结果良好。何云华等发现在甲醛存在下，高锰酸钾在酸性溶液中可以氧化碘离子，产生很强的化学发光。据此，建立了利用高锰酸钾-甲醛-碘化学发光体系测定碘的流动注射化学发光分析法。该方法设备简单，操作方便，选择性高，用于食品中碘含量的测定，结果令人满意。

5 回顾与展望

对化学发光进行大量研究始于20 世纪初，但直到20 世纪60 年代，由于现代电子技术和高灵敏度的光电传感器的发展，提供了许多研究和测定化学发光的新手段。加之生命科学、环境科学和材料科学的兴起，也对该领域的发展起到了极大的推动作用，化学发光作为一种分析方法才得到了迅速发展。国内化学发光分析方面的研究始于80 年代初，短短十年多的时间，已取得长足的进步，有关这一方面的文献报道在逐年增加。了如鲁米诺、光泽精、高锰酸钾、过氧化草酸酯等成熟的化学发光体系。

近几年来，化学发光的发展将主要表现在：(1)继续完善现有的化学发光体系，使其成为一种常规的分析方法；(2)新体系的不断建立和完善，主要是新体系增敏剂的研究，这是开发这些化学发光体系的关键；(3)化学发光与其他方法或技术联用，将化学发光与数学、物理学、生物学等三大学科结合，与流动注射技术，传感器技术、HPLC 技术联用改善化学发光法的性能，拓宽化学发光体系的应用范围。与许多有效的分离方法如高效液相色谱和毛细管电泳相结合，提高化学发光体系的选择性和灵敏度；(4)进一步研究有关的化学发光反应机理，从最初以化学反应方程式进行推测，发展到借助荧光光谱、吸收光谱、反应中间体的捕捉等证实；在实验基础上，运用分子轨道理论、热力学原理解释机理，为提高化学发光效率提供理论基础；(5)仪器的研究与开发迅速发展，制备高效的化学发光探针，以及化学发光仪器的微型化、智能化和遥控化，为化学发光的进一步发展创造条件；(6) 扩大了化学

发光分析的应用范围，将化学发光引向有机、冶金、药物、临床、食检、生命科学、环境和材料科学等各个领域。

6 结语

化学发光分析法的应用领域不断扩大, 化学发光分析法因其仪器简单、操作方便, 化学发光分析法因其仪器简单、操作方便,可以预见, 随着性能更优良的化学发光试剂的开发、开发新的发光体系, 并结合其他技术, 化学发光分析法的应用范围将会更加广阔，尤其在环境监测分析及免疫分析上将会有更广泛的应用。然而,在应用过程中还有许多方面需要进一步的完善和深入探讨。此外,设计一种自动化程度更高、便于携带、能实现实时实地检测的分析仪器将更加显示出此方法简便、快速的优点。

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