化学发光免疫分析方法

化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。

化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。

一、化学发光免疫分析方法的类别

化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为 3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。

（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。

1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。

鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。

2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析

吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。

（二）化学发光酶免疫分析

化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。此传统的化学发光体系（HRP－H2O2－lumi-nol）为几秒内瞬时闪光，存在发光强度低、不易测量等缺点。后来，在发光系统中加入增强发光剂，以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。碱性磷酸酶（ALP）已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。

碱性磷酸酶和1，2－二氧环己烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的化学发光体系。这类体系中具有代表性的是Bronstein 等提出的ALP－AMPPD 发光体系。AMPPD 为1，

2－二氧环己烷衍生物，它是一种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点是反应速度快，在很短时间内提供正确可靠的结果。在它的分子结构中有两个重要部分，一个是联接苯环和金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸根基团，它维持着整个分子结构的稳定。（三）电化学发光免疫分析方法电化学发光是指由电化学反应引起的化学发光过程。

Leland［3］等已对三联吡啶钌体系的电化学发光机理进行了深入的研究。电化学发光的反应在电极表面进行，发光底物为三联吡啶钌［Ru （ b p y）32+］，三丙胺（TPA）用来激发光反应。在阳极表面，两种物质同时失去电子。在电极板上Ru （bpy）32+被氧化成Ru （b p y）33+，TPA也被氧化成阳离子自由基（TPA+ *），TPA+ *自发地释放一个质子而变成非稳定分子（TPA*），将一个电子递给Ru （bpy）33+，形成激发态的Ru （bpy）32+*。Ru （bpy）32+*在衰减的同时发射一个波长为620 nm 的光子，重新回到基态Ru （bpy）32+。这一过程在电极表面反复进行，产生高效、稳定的连续发光，并不断增强。

二、化学发光免疫分析方法的应用

自1977 年Halman 等创立化学发光免疫分析方法以来，免疫化学分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用取得了很大的进展。

（一）医学检测

肺结核病常以人体血清中CA125 含量为疾病标记物，上海交通大学Wang 等建立了CA125 的毛细管化学发光免疫分析方法，以实现对肺结核病的检测。其方法的线性检测范围为2.5×10－11～1.0×10－9mol/L，检测限（S/N=3）为1.0×10－12mol/L，且标样的添加回收率为93％～109％。甲胎蛋白（AFP）为肿瘤疾病标志物，Yang等利用链霉素化毛细管柱，建立了AFP 的化学发光免疫分析方法。该方法的最低检测限为0.1ng/mL，线性检测范围为0.5～200 ng/mL。研究结果表明该方法具有结构简单、更好的实用性及较宽的线性范围等优点。Zhang等［7］利用磁性微粒子和包被小管建立了AFP 的化学发光酶免疫分析方法。

在该方法中，AFP抗体首先包被于两种不同的固相载体上，如磁性微粒子和包被小管。再分别对这两种包被模式建立的化学发光免疫分析方法进行比较，通过再抗体包被浓度、标记于抗体上HRP 的稀释比例，分析所需时间，化学发光动力学等角度进行衡量，显示磁性微粒子具有较大的优势。Zhan 等［8］建立了C 反应蛋白的电化学发光免疫分析方法。首先用生物素标记含有Ru （bpy）32+的脂质体后与亲和素反应，再与生物素化的C 反应蛋白抗体结合得到抗体包被的脂质体，同时亲和素包被的磁性微粒子与生物素化的抗体反应，得到抗体包被的磁性微粒子。两种抗体与C 反应蛋白结合，构成双亲和素桥联的、磁性微粒子为固相分离剂的反应模式。

通过溶解脂质体释放出Ru （bpy）32+测定其强度进行测定。该方法的最低检测限为100ng/mL，检测范围为100ng/mL～10μg/mL。Knight 等［9］采用化学发光免疫夹心分析方法对梅毒病毒进行检测，并与传统的分析方法快速血浆素反应（RPR）和酶免疫分析方法（ELISA）进行比较，通过对多种样品进行检测，并与RPR 及ELISA分析方法结果有99.1％的正确率。茶碱是一种磷酸二酯酶（PDE）抑制剂，用于呼吸系统疾病的治疗。

Zhou等［10］建立了茶碱的化学发光免疫分析方法，该方法的最低检测限为0.51mg/L，线性范围为0.51～40mg/L，板内及板间变异系数分别为3.20％和3.57％。通过与FPIA 结果对30 例茶碱浓度进行比较，其相关系数为0.993。Peter 等［11］通过合成生物素睾酮标记物建立了睾酮的化学发光免疫分析方法，该方法的检测范围为0.2～20.0 nmol/L，最低检测限为0.125 nmol/L，板间方法的精密度为13％～16％，通过质谱仪器确证其方法的回收率为95％，显示了方法良好的灵敏度和准确率。Mirasoli等［12］建立了唾液中皮质醇的固相竞争化学免疫分析方法。通过人工重组的发光蛋白标记皮质醇而建立的免

疫分析方法检测限为3nmol/L，线性检测范围为10～1 000 nmol/L。其他关于这方面报道还有Perschel 等［13］通过化学发光免疫分析对原发性醛固酮过多症（PHA）进行快速筛选，Tudorache等［14］利用磁颗粒免疫支持液膜方法（m-ISLMA）检测唾液中的孕酮含量，Iwata 等［15］利用双夹心化学发光免疫分析方法测定血浆中内皮素－1的含量等。关于这方面的应用，化学发光免疫分析方法应用的最为广泛，正是在医学检测方面大量成功的应用，带动了化学发光免疫分析方法在其他学科方面的普及。

（二）食品安全检测

Quan 等［16］建立了食品中伏马菌素B1 的化学发光酶免疫分析方法，经方法优化后其线性检测范围为0.14～0.9μg/L，方法的灵敏度（IC50）为0.32 μg/L，方法的最低检测限（IC10）为0.09 μg/L，与伏马菌素B1 的ELISA 方法相比，其方法灵敏度提高了10 倍。且通过样品的添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与ELISA 分析方法与HPLC 方法有良好的相关性。

Yang等［17］建立了食品中葡萄球菌肠毒素B（SEB）的碳纳米管的化学发光免疫分析方法，通过将SEB 抗体吸附在碳纳米管表面，然后将抗体－碳纳米管固定在聚碳酸酯表面，再通过增强化学发光免疫法测定SEB 含量。牛奶、苹果汁和婴儿食品中的SEB 最低检测限为0.01 ng/mL，而ELISA 的最低检测限为1 ng/mL。Lin 等［18］人建立了食品中氯霉素的化学发光免疫分析方法，其方法灵敏度（0.05 ng/mL）、精密度、特异性及准确度等指标均与ELISA 分析方法类似。10个样品的板内和板间变异系数分别小于8％和20％，且样品的添加回收率在87％～100％。

四川大学华西医学院杨秀岑等人［19］建立了食品中沙门氏菌的化学发光免疫分析方法。该方法选用聚氯乙烯平片作为载体固定细菌，再与一抗及HRP 标记二抗温育，以化学发光免疫法测定食品中沙门氏菌。利用该方法对62 份食品样品进行检测，以P/N≥3作为阳性标准，符合率为85.5％。Magliulo 等［20］建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶免疫分析方法，通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。该方法的最低检测限为1 pg/mL，且板间板内数据的变异系数均低于9％，回收率在96％～122％之间。Lin 等［21］建立了农产品中黄曲霉毒素B1 的化学发光免疫分析方法。该方法线性检测范围在0.05～10 ng/g 之间，检测灵敏度为0.01 ng/g，板间及板内变异系数分别为12.2％及10.0％。农产品中样品添加回收率在79.8％～115.4％之间。同时，将建立的分析方法与黄曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关性试验，相关系数为0.9098，显示其有较好的应用前景。

Alexandra 等［22］通过酶联免疫法和化学发光酶免疫法建立了DDT 及其代谢物的免疫分析方法，并对食物及环境样品中的DDT 及其代谢物进行检测。对DDT 及其代谢物，酶联免疫法的IC50值为0.6 ng/mL，而化学发光酶免疫法的IC50值为0.2ng/mL。David等［23］通过流动注射化学发光检测法对水样中的阿特拉津进行检测，对水样的最低检测限为 1.3 ng/mL，检测线性范围为2.15～150 ng/mL，通过SPE 柱净化浓缩后，对水样的最低检测限为14 ng/L。Samsonova等人［24］利用化学发光免疫分析方法建立了3 种三氮苯类除草剂（阿特拉津、草净津和莠灭净）的多残留免疫分析方法。在用建立的方法对含3 种除草剂混合物的环境样品进行检测，检出正确率为70％～100％。Waseem等人［25］通过流动注射化学发光免疫分析方法建立了除草剂西草净的检测方法，该方法的线性检测范围为0.01～2μg/mL，最低检测限（S/N=3）为7.5 ng/mL，4条标准曲线各抑制率的相对标准偏差为0.9％～2.3％。

利用建立的方法对水样中的西草净进行检测，回收率在97％～104 ％之间。中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所Jin 等［26］建立了蔬菜水果中三唑磷农药的化学发光免疫分析方法，该方法的线性检测范围为0.04～5 ng/mL，最低检测限为0.063 ng/mL，对生菜、

胡萝卜、苹果、水和土壤的添加回收率分别为78.71％，67.52％，118.3％，117.2％和122.0％。同时建立的方法与液质串联质谱法进行相关性实验，结果显示有着较好的相关性（R2= 0.8996）。Aldo 等［27］建立了牛尿样品中瘦肉精的化学发光免疫分析方法。该方法以384 孔化学发光黑板为固相载体，样品添加量仅为20 μL。方法精密度符合分析要求（变异系数小于10％），添加回收率在96 ％～110 ％之间，方法最低检测限为0.08ng/mL。利用384 孔板为固相载体，可减少80％的试剂用量，并可大大提高对阳性样品的初筛效率。

磺胺－5－甲氧嘧啶是一种兽药，但对人体有害，因此在食品中不得检出。Wu等［28］建立了牛奶和鸡蛋中磺胺－5－甲氧嘧啶的化学发光免疫分析方法。该方法的最低检测限为3.2 pg/mL，线性检测范围为10～2 000 pg/mL 之间，方法变异系数小于18％，样品添加回收率在85％～105％之间。其他还有如Kijek［28］建立了食品中葡萄球菌肠毒素B 的化学发光免疫分析等相关报道。

（三）环境科学

Christian 等［30］通过化学发光酶免疫分析方法建立了环境内分泌干扰物炔雌醇的免疫分析方法。其方法的检测限（S/N=3）为0.2±0.1 ng/L，信噪比为10 时其方法的检测限为1.4±0.8 ng/L，并通过建立的分析方法对表面水和污水处理厂的污水中的炔雌醇进行测定。Pittman等［31］通过磁性小珠和生物素－亲和素为载体建立了水样和土样中2，4，

6－三硝基甲苯的免疫夹心电化学发光免疫分析方法。该方法的最低检测限为0.1±0.8 ng/mL，检测范围为0.1～1 000 pg/mL，其方法灵敏度比文献报道的提高了600 倍。

Zhao 等［32］通过建立微板式磁化学发光酶免疫分析方法来对水样中17β－雌二醇进行检测。通过微板磁性分离器可避免前处理过程以达到高通量分析，再结合高灵敏度的化学发光体系，建立了该方法。该方法的检测灵敏度为5.4 pg/mL，检测范围为10～3 000 pg/mL，且板间和板内检测值的变异系数均低于15％。

三、化学发光免疫分析方法的发展趋势

目前，化学发光免疫分析方法的发展主要表现在：（1）常见发光体系的不断完善，随着化学发光底物、氧化剂、催化剂、增敏剂及固相材料研究的不断深入，性能更加优异的化学发光体系将在今后研究中不断涌现；（2）基因工程抗原、抗体的制备及广泛应用，将进一步促进化学发光免疫分析方法的发展；（3）化学发光免疫分析方法与包括毛细管电泳等其他方法联用，将提高化学发光免疫分析的速度以及灵敏度，拓宽化学发光体系的应用范围。