产一吨水蛭素提取纯化工艺设计

目录

第一章项目总论 (1)

1.1 水蛭素的介绍 (1)

1.1.1水蛭素的化学结构和理化性质 (2)

1.1.2水蛭素的生理功能 (3)

1.2 水蛭素的应用前景 (3)

1.3水蛭素生产工艺 (4)

1.3.1粗提纯 (4)

1.3.2水蛭素的纯化 (5)

1.3.3水蛭素蛋白质分析方法 (6)

第二章方案设计 (7)

2.1产品方案概述 (7)

2.1.1进行产品方案选择 (7)

2.1.2 简要论述选定方案 (7)

2.2工艺流程 (8)

2.2.1工程流程示意图 (8)

2.2.2工艺流程说明 (8)

2.2.3工艺流程论证阐述以及工艺参数 (9)

2.3物料衡算 (10)

2.3.1技术参数 (10)

2.3.2计算 (11)

第三章设备选型 (13)

3.1粉碎机 (13)

3.2过滤装置 (14)

3.3离心装置 (15)

3.4凝胶层析装置 (15)

3.5浓缩结晶装置 (16)

3.6冷冻干燥装置 (16)

第四章防污措施 (18)

4.1车间环境 (18)

4.2 设备和管道的清洗与杀菌 (18)

4.3 废水的处理 (18)

4.4 废渣的处理 (19)

第五章结语 (19)

参考文献 (20)

第一章项目总论

1.1 水蛭素的介绍

水蛭素(hirudin)是水蛭（Leech）及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65—66个氨基酸组成的小分子蛋白质（多肽）。水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最

强的凝血酶天然特异抑制剂。近年来在我国以水蛭素为主要成分的中成药已

有许多种，如抗血栓片、活血通胶囊等，其年产值达数千万元。含水蛭的新

药也在不断研究和推出。利用基因工程生产重组水蛭类多肽药物，以取代水

蛭素或作为抗凝化瘀药的添加成分，这在近期内就可实现。作为注射剂用于

心血管系统疾病和肿瘤治疗药物，则还需要进一步的临床研究。毋庸置疑，

重组水蛭素类多肽药物的开发将会带来巨大的社会效益和经济效益。所以对

水蛭素生产工艺研究的不断深入,完善水蛭素提取工艺就显得尤为重要。

1.1.1水蛭素的化学结构和理化性质

水蛭（Hirudo）为水蛭科动物蚂蟥（Whitmania pigra Whitman）、水蛭（Hirudo nipponica Whitman）或柳叶蚂蟥（Whitmania acranulata Whitman）的干燥全体，具有破血、逐瘀、通经作用，用于癥瘕痞块、血瘀经闭、跌扑损伤治疗。作为常用的活血化瘀中药，水蛭在临床广泛用于脑血栓、冠心病、脑水

肿等疾病的治疗，其有效成分主要为一种抗凝血物质，名为水蛭素（Hirudin）。它能阻止凝血酶对血小板的作用，抑制血小板受凝血酶的刺激而释放，从而

延缓或阻止血液的凝固。研究表明，水蛭素是由65个氨基与3个二硫键组成的多肽，分子量约为7 000，在干燥状态下稳定存在;室温下，在水中稳定存在6个月，80 ℃下加热15 min不被破坏;提高溶液的pH值，其稳定性下

降;20 ℃下，在0.1 mol/L的HCl或NaOH中可稳定15 min。

水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭

素可促进伤口愈合。研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。

动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。半致死剂量LD50＞50mgAg，远大于治疗所用的剂量(1mgAg)。尤其值得指出的是，水蛭素可以口服，这给用药带来很大方便。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，这就可以解释为何口服中药水蛭提取液仍然有疗效的原理。

1.1.2水蛭素的生理功能

动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果。天然水蛭素是由65或66个氨基酸残基组成的单链多肽,分子量约为7 000,能在极端的pH和热条件下稳定存在。水蛭素的形状类似蝌蚪,蝌蚪头部是多肽的N端,富含半胱氨酸(cys),半胱氨酸间相互作用形成3个二硫键(Cys6-Cys14,Cys16-Cys28,Cys22-Cys39)。使N末端结构紧密;蝌蚪尾部是含有多个酸性氨基酸和一个被磺酸化的酪氨酸(Tyr63)的多肽C末端。凝血酶(thrombin)是血液凝固和止血过程中的中心酶,它不但能剪切纤维蛋白原,将纤维蛋白原

转化为纤维蛋白;还能激活其它的凝固血液的酶类,如凝血因子Ⅴ、Ⅷ、ⅩⅢ和抗凝血酶蛋白C(Fenton,1981)等。凝血酶与大分子底物的相互作用取决于三个不同的区域:催化反应位点的初级结合部位C(Magnusen,1971),邻近催化位点的非极性结合位点AB(Brlinr and Shen,1977;Sonder and Fenton,1984)和负责凝血酶与纤维蛋白原专一性作用的阴离子结合位点(识别位点)R(Fenton et al.1989;Henriksen and Mann,1988)。水蛭素的N端能封阻凝血酶的活性位点,其疏水结构域与凝血酶的非极性结合位点(AB)互补,该非极性结合

位点靠近凝血酶的催化中心。水蛭素C末端有6个酸性氨酸,能与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子

键。N端、C端两个功能域以协同的方式结合到凝血酶上,在凝血酶的活性部位形成一个帽子,阻止底物的结合。

1.2 水蛭素的应用前景

水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。

动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。半致死剂量LD50>50mgAg，远大于治疗所用的剂量(1mgAg)。尤其值得指出的是，水蛭素可以口服，这给用药带来很大方便。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，这就可以解释为何口服中药水蛭提取液仍然有疗效的原理。

近年来在我国以水蛭素为主要成分的中成药已有许多种，如抗血栓片、活血通胶囊等，其年产值达数千万元。含水蛭的新药也在不断研究和推出。利用基因工程生产重组水蛭类多肽药物，以取代水蛭素或作为抗凝化瘀药的添加成分，这在近期内就可实现。作为注射剂用于心血管系统疾病和肿瘤治疗药物，则还需要进一步的临床研究。毋庸置疑，重组水蛭素类多肽药物的开发将会带来巨大的社会效益和经济效益。

1.3水蛭素生产工艺

水蛭素的分离提取方法有很多：

1.3.1粗提纯

盐析沉淀法:中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。低浓度时中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶((salting in)。盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某些盐类离子后，带电层使蛋白质分子排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加

强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析(salting out)。盐析作用主要是由于中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由的水分子成为下一步最自由地可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。随着盐浓度的增加，蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。盐析沉淀的蛋白质保持着它的天然构象，能再溶解。用于盐析的中性盐以硫酸馁为最佳，因为它在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。

有机溶剂沉淀法:在等电点附近，蛋白质分子主要以偶极离子形式存在。这时如果添加有机溶剂，由于有机溶剂有较低的介电常数，会使溶液的介电常数减小，增强偶极离子之间的静电引力，从而使分子聚集而沉淀。

pH沉淀法:蛋白质是带有正电荷和负电荷基团的两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和数量则因pH不同而变化。蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。在等电点以上或以下的pH时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分或全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。

丙酮提取法：水蛭素的提取把水蛭浆分别按下列步骤进行提取，按水蛭浆:浓盐酸:丙酮=1: 0. 025:5. 5的配料提取。48h后滤取丙酮，残渣再用2. 5倍丙酮浸提48h，过滤，合并丙酮提取液。残渣在用适量的丙酮洗1次合并，加热到80℃一85 0C，去除杂蛋白，浓缩回收丙酮，得浓缩物，过滤得水蛭素粗品。

1.3.2水蛭素的纯化

1.4.1 离子交换层析法(IEC):离子交换层析(Ion Exchange Chromatography简称为IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。