原生质体细胞融合技术

食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术

原生质体细胞融合技术

摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG（聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等，并对它们的优缺进行简要的评述。

关键词：原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展

正文：

原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合。目前，通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。

1 原生质体融合技术

微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生。

1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素

制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多，不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上，多采用对数生长中后期的细菌，这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感。对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中，用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5:3: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用

一种酶的效果好，在一定范围内，酶作用的时间和酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关，而与再生率成反相关。另外，EDTA作为鳌合剂，可以避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶脱壁效果，从而提高原生质体的形成率。据报道，对大肠埃希菌来说，用EDTA洗涤后，可以除去对酶解不利的金属离子。另一方面，在原生质体制备前，用适量的青霉素对菌体进行预处理，可以抑制肤聚糖合成过程中的转肤作用，有利于原生质体的形成。根据酶反应动力学原理，酶解温度直接影响酶促反应的速度，如放线菌的最适酶解温度为28℃一37℃，真菌的最适酶解温度为30℃一35℃。在高渗溶液中添加15 m L/ L聚乙烯毗咯烷酮( PVP)等原生质体扩张剂，有利于溶液中细菌的分散，有助于制备原生质体，添加 0.02 mol/ L镁离子，有利于原生质体的稳定。关于原生质体的再生，在原生质体高渗再生培养基中加入0.3mol/L的蔗糖和0.2 mol/L的丁二酸钠是合适的，还有报道说在高渗再生培养基中加入0.5mol/L的蔗糖是适宜的，这可能要根据不同的微生物种类而定。

1. 2 原生质体融合过程中的影响因素

1974年，匈牙利的Ferenczy报道了离心力诱导法对白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合。随后人们相继用NaCl、 KC1等作为诱变剂进行融合，但融合频率都很低。聚乙二醇在适量钙离子存在下能有效地诱导植物原生质体融合，钙离子主要是通过维持膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。原生质体膜外在蛋白上二价阳离子的存在使膜脂流动性减慢、稳定性增强，这种维持稳定性的效果大小与膜表面分子数量的多少呈正比例关系，PEG种类对原生质体融合的影响不大。此外，其融合率还受其他诸因素的影响。影响原生质体融合的因素很多，特别是环境中的阳离子存在，融合时的pH也对原生质体融合有较明显的影响。一般来讲钙离子,镁离子有助于融合。如有0.O1 mol/L钙离子存在时，可得到较高的融合率，但在缺乏钙离子时，若pH较低，融合频率也较高。这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生凝集所致。

2 原生质体融合的方法

2. 1 细胞融合仙台病毒(HVJ)诱导法

1962年日本冈田善雄偶然发现一种叫日本血凝性病毒HVJ或称仙台病毒能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础。细胞融合现象公布后引起细胞学界的高度重视。

1965年英国的Harris和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融合上作了大量的工作，并进一步将这种灭活病毒作为一种普遍的方法来诱导不同种动物细胞，他们在实验室中成功进行了人类细胞、动物细胞、鸟类和蛙类细胞之间的融合，并且可得到存活的杂合细胞。他们的研究工作证明了在病毒法诱导细胞融合中，其有效促融因子在于细胞的膜，病毒膜片(甚至在病毒灭活或被超声打碎后)能使细胞间产生凝聚和融合，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。

该方法的问题主要在于病毒制备困难，操作复杂，灭活病毒的效价差异大，实验的重复性差，融合率很低等。这种方法适用于动物细胞融合.主要用于实验室研究。

2. 2 细胞融合PEG(聚乙二醇)诱导法

1974年华裔加籍科学家高国楠(Kao)发现聚乙二醇( PEG:polyeth贝eneglycol)能促使植物原生质体融合，当加入一定分子量的PEG时，融合效率较病毒诱导法可提高1 000倍以上，Kao经过研究发现PEG在融合过程中起着稳定和诱导凝集作用。后来人们又发现还有许多其他的化学剂可使细胞凝集并融合，如磷酸盐、高级脂肪酸衍生物、脂质体等，不过这其中以聚乙二醇的效果较好。且由于病毒诱导细胞融合存在诸多缺点，所以1975年以后，利用PEG诱导细胞融合逐渐发展成为一种规范的重要化学融合方法，并代替了Sendai virus 在细胞融合中的地位，它将病毒法诱导的细胞融合率从1/105提高到1/103。另外，PEG法的好处是没有品种种间、属间、科间的特异性或专一性，动植物间的限制也被打破。不过PEG法对细胞毒性大，这极大地影响了融合率和融合后细胞的存活率。这种方法一直沿用至今，即使到了细胞电融合技术业已成熟的今天，PEG法依然以其低廉的实验成本和相对较高的融合率，而在许多实验中依然被大量应用。

2. 3 细胞融合电场诱导法

细胞电融合是20世纪80年代发展起来的一门新兴的细胞工程和生物物理技术。自电穿孔及电融合技术发明创造以来的20年里，电穿孔和电融合已成为一门成熟的学科。

有关细胞电融合现象为科学家Zimmermann在1978年所发现，并采用电脉冲方法成功地诱导了细胞融合，开创了细胞融合技术的新局而。日本科学家Senda也在1979年利用电场刺激实现了植物细胞的融合，并首次实现了电穿孔的实验和用电刺激植物原生质体融合的实验，其后他又对植物细胞电融合技术进行了研究。以后几年里，人们把这种新的融合手段从动、植物扩展到微生物和真菌的原生质体融合研究中，导致了原生质体融合技术的新突破。

与使用聚乙二醇( PEG)的化学法相比，电场刺激法是一种非常高效的细胞融合方法。电融合技术操作简单、电参数(如脉冲强弱、长短等)容易精确地调节、无化学毒性，对细胞损伤小，可以免去细胞融合后的洗涤程序，融合率高，可应用于许多种不同的细胞。故这种方法得以在短期内被广泛采用，成为细胞融合的主要技术手段。不过需要购置专用的细胞电融合设备(细胞电融合仪)。

2. 4 细胞融合激光诱导法

1984年，Schierenberg首次报道利用微束激光成功地进行了细胞融合实验，为细胞融合找到了另一种有效的方法。1987年，联邦德国海德堡理化研究所使用准分子激光器泵浦的染料激光器诱导哺乳动物细胞融合和植物原生质体融合。

细胞之间相互接触是实现细胞融合的前提，除了采用病毒、化学剂或电的方法使细胞接触，还可以利用激光的光镊建立两细胞间接触。简单地说，光镊所形成的光学势阱，会把细

胞拉向光束中心，钳住细胞，从而实现了对生物粒子的远距离、非接触式捕获。1991年Rosemarie, Wicgand, Steubing等人先后使用激光诱导法对骨髓瘤细胞间的接触实现了融合。不过激光诱导法中所使用的设备非常昂贵，而且是一种微操作法，对操作技术要求很高，总体来看这种技术的效率并不高。

3 细胞融合技术的最新进展

3. 1基于微流控芯片的细胞融合技术

随着微机电系统技术和微加工技术的发展，微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟，加之微通道网络可以整合到生物芯片之上，这将使得微流控系统成为细胞融合的理想平台，利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞。目前，基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合技术研究的重点领域。思德博格等研究人员已经在微流控系统中实现了单个成对细胞的融合。他们的成功证明了利用微流控技术使细胞之间可以实现可控融合。这种可控的融合势必对于未来杂交瘤细胞的制备、克隆技术以及对基因表达的研究方而产生巨大的影响。

利用基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控，比如转移、定位(移动到指定的位置)、变形等;也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞;细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现。此外由于在微通道内的腔体容积很小，所以会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量，同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高。

3. 2高通量细胞融合芯片

高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在细胞融合芯片的微米范围内产生的高强度高梯度辐射电场，使得细胞融合芯片中的细胞在此特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力，精确处理和刺激预定的细胞目标;从而使目标细胞按照预先设计的方向(细胞可以以任何预先设计好的方向)以预定的速度(可以使不同种的细胞以不同的速度定向)移动，从而可以按照设计要求准确地大批量地得到目标细胞配型;集成微电极阵列的微流控系统，可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移。由于在微通道内微电极间距可以做得很小，因此获得同样强度的辐射电场强度只需施加较低电压的交变电场和脉冲就可以了，不用加载昂贵的高电压发生装置。例如，在20um的电极对间距施加14 V的脉冲就相应地可以获得7 kV/cm的高强度场强，这足以形成细胞融合所需要的电场强度。

而且高通量细胞融合芯片可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结合，比如:在细胞融合缓冲液中加入少量的PEG可大大提高细胞的融合率。此外，二价阳离子(例如:CaZ')以及蛋白酶对细胞的预处理，融合率也可大幅提高。然而，截至目前各国与此相关的细胞融合实验工作只有几篇文章见诸报导。许多构想也只是在理论层次上的探讨，要达到此理想的目标相信还有相当漫长的道路要走。

3. 3 空间细胞融合技术

植物细胞融合过程中由于地面上地球重力的存在，有液泡的原生质体与无液泡的原生质体的密度差加大，异源细胞融合得率十分有限。在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中，在地面上由于无法排除地球重力的影响，要提高B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。20世纪80年代以来，德国细胞电融合技术发明家Zmmcanann等人在空间材料科学的启发下，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。大量的飞行实验结果表明，在微重力条件下酵母细胞杂种得率有很大的增加。融合得率增加显然是由于没有重力沉降影响的缘故，杂种细胞活力增加可能是细胞排列时间缩短引起的。在取得这些成功实验的基础上，进一步研究融合后的细胞在空间培养的可能性己经开始。

3. 4离子束细胞融合技术

雷电、辐射等自然过程中产生的低能离子可作用于生物体，20世纪80年代中期，中国科学院等离子体物理研究所余增亮等人发现并证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在，建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系。在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变，据此原理，发展了离子束诱导细胞融合技术。由于用于辐照的离子束的参数除了能量可调外，离子种类、电荷、质量皆可调，因此，离子束的可操纵性高，可以用微束对细胞进行超微加工，有目的地切割染色体用于基因工程和细胞工程，通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的。此项研究一旦成功，将改变传统的一对一细胞融合的弊端，减少供体细胞导入的染色体范围，使融合更具目的性，大大减少筛选的工作量，将是细胞融合研究的一大进步。

3. 5非对称细胞融合技术

非对称细胞融合技术，是利用某种外界因素辐照某一细胞原生质体，选择性地破坏

其细胞核，并用碘乙酞胺碱性蕊香红6G处理在细胞核中含有优良基因的第2种原生质体，选择性地使其细胞质失活.然后融合来自这2个原生质体品系的细胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合，或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而在保留亲本之一全部优良性状的同时改良其某个不良性状。

实践表明，非对称细胞融合技术通过，射线照射，为实现供体亲本少数基因的转移，创造种间、属间杂种，提供了可能性.值得注意的是，此方法特别适用于细胞质雄性不育基因的转移，通过辐照胞质不育的原生质体，破坏其染色体，与具有优良性状品种的原生质体融合，从而获得实用的新的胞质不育系，这些都是常规育种所做不到的。

4 前景及展望

原生质体融合技术在生产实践中的应用产生的效益，已是举世瞩目，它已成为高新技术开发的重要领域。该技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定

位、衰老控制理念等领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值。通过原生质体融合进行细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。

参考文献：

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[4]崔彬彬,朱维红,冯大领.细胞融合技术研究进展[J].保定师范专科学校学

报.2007,20(2):48-51

植物原生质体的分离及融合

植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理 1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。 2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。本实验用PEG诱导原生质体融和。 PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。 PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。二．实验步骤 1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。（5）配平后，在700rpm下离心5min，弃去上清液；加洗涤液约3ml，吹打均匀，700rpm、5min重复离心一次，彻底去除酶液。（6）加200μl洗涤液，悬浮原生质体。（7）镜检原生质形态和浓度，看看是否有碎片；如碎片较多，利用蔗糖溶液漂浮1-2次。（8）蔗糖漂浮方法：取部分原生质体悬浮液，加入洗涤液定容至1ml。用注射器吸取20%蔗糖溶液，装上长针头后小心插入盛有原生质体悬浊液的离心管底部，缓缓、轻柔地将蔗糖溶液挤出。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。配平后在700rpm下离心5min。用装有长针头的注射器小心吹吸底部沉淀，连同底部碎片一起将底层蔗糖溶液吸出，再小心除去上清液，得到纯净完整的原生质体。 2.PEG融和

微生物原生质体融合技术研究进展_王春平

动物医学进展,2008,29(5):64267 Progress in Veterinary Medicine 微生物原生质体融合技术研究进展3 王春平1,2,韦　强1,鲍国连13,刘　燕1,邵泽香1,2,季权安1 (1.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021;2.山东农业大学动物科技学院,山东泰安271018) 摘　要:原生质体融合技术在遗传学、动植物远缘杂交育种、生物学、免疫学、兽医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值,文章就原生质体制备、再生及其融合过程中的影响因素做了综述,另外还对原生质体融合方法和融合子的筛选方法进行了比较,为选择适宜有效的诱导融合方法和筛选方法提供依据。关键词:原生质体融合;影响因素;融合方法;筛选方法中图分类号:Q813.2文献标识码:A文章编号:100725038(2008)0520064204 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交,是指细胞通过介导和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy L 等[2]采用离心力诱导的方法,报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术,并从微生物种内融合扩展到界间的融合。路玲玲等[3]采用融合技术成功构建耐高温高产酒精酵母,至此,原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。原生质体融合技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大[4]。 1　原生质体融合技术微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备,原生质体融合,原生质体再生[5]。1.1　原生质体制备与再生过程中的影响因素制备原生质体的最大障碍就是细胞壁,现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长中后期的细菌,这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肽聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感。王燕[6]对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中,用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5∶3∶1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好,在一定范围内,酶作用的时间和酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关,而与再生率成反相关。另外,ED TA作为螯合剂,可以避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶脱壁效果,从而提高原生质体的形成率。据报道,对大肠埃希菌来说,用ED TA洗涤后,可以除去对酶解不利的金属离子[7]。另一方面,在原生质体制备前,用适量的青霉素对菌体进行预处理,可以抑制肽聚糖合成过程中的转肽作用,有利于原生质体的形成。根据酶反应动力学原理,酶解温度直接影响酶促反应的速度,如放线菌的最适酶解温度为28℃～37℃,真菌的最适酶解温度为30℃～35℃[8]。在高渗Tris 溶液中添加15mL/L聚乙烯吡咯烷酮(PV P)等原生质体扩张剂,有利于溶液中细菌的分散,有助于制备原生质体,添加0.02mol/L镁离子,有利于原生质体的稳定。关于原生质体的再生,吴孔兴等[9]报道在原生质体高渗再生培养基中加入0.3mol/L的蔗糖和0.2mol/L的丁二酸钠是合适的,王玉华等[10]报道在高渗再生培养基中加入0.5mol/L的蔗糖是适宜的,这可能要根据不同的微生物种类而定。 1.2　原生质体融合过程中的影响因素 1974年,匈牙利的Ferenczy报道了离心力诱导法对白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合。随后人们相继用NaCl、KCl和Ca(NO3)2等作为诱变剂进行融合,但融合频率都很低。聚乙二醇在适量 3收稿日期:2008202203 基金项目:浙江省重点科技攻关项目(2005C12021,2005E60014) 作者简介:王春平(1982-),男,山东淄博人,硕士研究生,主要从事动物传染病研究。3通讯作者

植物原生质体的分离与融合

实验六植物原生质体的分离与融合一、实验目的： 1、掌握原生质体分离的方法； 2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。二、实验原理： PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。三、实验材料：（1）韭菜或大蒜叶；（2）红辣椒四、实验步骤： Ι 植物原生质体的分离与纯化 1、酶解：将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8, 去表皮面接触酶液），在适宜温度条件下，避光酶解数小时。 2、过滤：用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。 3、原生质体收集：在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。红辣椒800转/分离心5分钟。 4、洗涤：弃上清液，留沉淀约1ml，加入4ml13%CPW洗

液，相同条件下再离心，弃上清液。弃上清液，留沉淀约1ml，混匀呈悬浮备用。 5、纯化： **蔗糖漂浮法去除碎片法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。或者（1*）换一洁净离心管加入20%蔗糖溶液约3ml，然后小心将原生质体悬液平铺于离心管表面。（以上任一方法皆能看到明显界面） (2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处 (3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中。注意下步镜检决定是否需要:加入3～4ml13%CPW洗液离心，离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。 Ⅱ细胞融合 1．不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min； 2．融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太

原生质体融合技术

原生质体融合技术的局限性植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。 1.技术局限性植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。 1.1诱导原生质体融合诱导原生质体融合是体细胞杂交的最基本的技术环节。融合方法的选择受到很多实验条件的限制。常用的化学方法有化学方法与电融合方法。化学方法中用的最多的是聚已二醇（PEG）融合技术。但是这种方法中PEG与高PH强加于原生质体的非常生理条件，PEG 的相对分子质量、纯度、浓度、处理时间、原生质体的状况和密度等都会影响PEG融合技术，而且其融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害作用；而影响电融合的因素有电融合技术中交流电的强弱、处理时间的长短、电脉冲的大小电极的材料和间距、直流脉冲的强度、宽幅以及次数等。而且对于不同的植物材料需要经过多次实验，才能找出这些参数的适当值。这就制约了原生质体融合技术成为常规育种方法。 1.2杂种细胞的选择为了将杂种细胞与未融合的、同源融合的亲本细胞区分开，一般有以下选择方法： 1.2.1利用或诱导各种缺陷型或抗性细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来；互补选择一般要求有相应的突变体。在体细胞杂交的研究中，虽然人们已经建立和利用了各种各样的突变体，但是在植物中要建立突变细胞系比较困难，如果要使突变细胞系保持再生能力就更难了，因此在实际应用中受到很大的限制。 1.2.2机械选择法利用荧光素标记分离杂种细胞取得了一定的成效，但是显微镜操作费工费时，选择出异

植物原生质体的分离与融合(3)

细胞工程实验六植物原生质体的分离与融合实验概要本实验介绍了原生质体分离的方法及利用PEG原生质体融合的原理和方法。实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高钙高pH法和电融合法；聚乙二醇（PEG）作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高钙高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。聚乙二醇（PEG）诱导如何的机理：聚乙二醇（PEG）由于含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当聚乙二醇（PEG）分子足够长时，可作为临近原生质表面之间的分子桥而使之粘连、聚乙二醇（PEG）也能连接钙等阳离子，钙可在一些负极化基团和聚乙二醇（PEG）之间形成桥，因而促进粘连。从而引起原生质体融合：高钙高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时渗透压冲击也可能起作用。原生质体分离纯化后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法时原生质体培养中最基础也是最关键的环节。PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。主要试剂 1. 20%蔗糖； 2. 13%CPW洗液： 27.2mg/L 磷酸二氢钾（KH2PO4）

原生质体细胞融合技术

食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术

原生质体细胞融合技术摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG（聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等，并对它们的优缺进行简要的评述。关键词：原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展正文：原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合。目前，通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。 1 原生质体融合技术微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生。 1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多，不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上，多采用对数生长中后期的细菌，这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感。对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中，用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5:3: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用

微生物原生质体融合育种技术及其应用

微生物原生质体融合育种技术及其应用摘要：工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位。微生物原生质体融合(microbialprotoplast fusion)技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点,是微生物育种最常用的方法之一。结合相关研究进展,分析了原生质体融合技术的组成,包括制备、再生、融合的影响因素以及融合子的筛选方法,重点评述了原生质体融合技术应用在微生物育种中的最新进展,以及微生物原生质体融合技术的发展前景。关键词：微生物原生质体融合遗传育种基因组重组引言：微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素,它决定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化价值。自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术,是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程。与其他育种技术相比,原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。 1974年,匈牙利的Ferenczy成功将白地霉(Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株的原生质体进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。本文就原生质体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。 1 资料和方法： 1.1 资料来源由第一作者在CNKI进行检索。网址：https://www.360docs.net/doc/319574110.html,/。英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。英文检索词为“protoplast fusion、research、progressions”；中文检索词为“原生质体融合、应用、研究进展”。 1.2 入选标准纳入标准：①原生质体融合技术过程及其影响因素。②原生质体在微生物工程中的应用③原生质体技术应用的工业实例。

真菌原生质体融合技术

大型真菌原生质体融合技术研究进展 1 发展史由于原生质体技术的形成，去除了细胞壁的障碍，使得种内、种间甚至属间杂交成为可能。原生质体融合起源于60年代，而真菌原生质体融合的第一篇报道是以白地霉(Geotrichum candidum Link)营养缺陷型突变株为材料，采用离心方法进行原生质体融合，其融合率低于10-6。之后，人们又利用一些化学试剂，如NaNO2，Ca(NO3)2，NaCl，KCl等进行融合，效果得到改进。1976年安(Ann)等把用聚乙二醇(PEG)诱导植物原生质体融合的方法引入到真菌原生质体的融合中来，使融合率达到10-2量级。PEG诱导原生质体融合的成功，推动了真菌原生质体融合的发展。1979年匈牙利的佩斯蒂(Pesti)首先报道了融合育种提高青霉素产量，从而开创了原生质体融合在实际工作中的应用。日本、英国、加拿大、中国等对双孢蘑菇、香菇、木耳、平菇等食用菌原生质体的分离、再生、融合做了大量卓有成效的工作。在过去的几十年中，人们已从54种食用菌中分离到原生质体；已进行了种内10种、种间19种，属间5种、目间3种的原生质体融合研究。然而PEG等化学方法诱导原生质体融合对细胞损伤大，有残留毒性。1979年森达(Senda)，1980年齐默尔曼(Zimmermann)等人报道了电场诱导细胞融合的新技术，电融合技术操作简单、无化学毒性，对细胞损伤小，融合率高。以后几年里，人们把这种新的融合手段从动、植物扩展到微生物的原生质体融合研究中，导致了原生质体融合技术的新突破。1988年张闻迪等又报道了激光诱导动物细胞融合。1998年又有报道螯合剂对原生质体融合具有促进作用。 2 原生质体融合中亲本的选择标记原生质体融合前首先必须对亲本进行遗传标记，从而有利于挑选融合子。在融合中，可采用营养缺陷型、抗药性、灭活原生质体、荧光染色、形态差异和自然生态标记等方法。

植物原生质体融合方法的研究进展

龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/319574110.html, 植物原生质体融合方法的研究进展作者：李琦来源：《种子科技》2018年第06期摘要：原生质体融合（protoplast fusion）是指通过物理或化学方法使两个细胞的原生质体进行融合，经培养获得具有双亲全部或部分遗传物质后代的方法。应用植物原生质体融合技术，可以克服远缘杂交不亲和的障碍，打破物种之间的生殖隔离，扩大杂交亲本范围，实现基因在物种间的转移和遗传重组，培育新品种和创造新物种。主要就植物原生质体融合的方法进行了阐述。关键词：植物原生质体；融合方法；研究进展文章编号： 1005-2690（2018）06-0038-02 中图分类号： Q943 文献标志码： A 原生质体是组成细胞的一个形态结构单位，原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的主要材料。1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体，Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液，在一定条件下培养一段时间后，发现大部分细胞的细胞壁被降解，从而制备出大量有活力的原生质体。 1 原生质体融合的目的及意义原生质体融合技术可克服不同原生质体间的排斥力，使两种不同种属的原生质体间发生膜融合、胞质融合和核融合，进而形成具有含两种遗传物质的杂交细胞，克服远缘杂交的不亲和性和子代不育等障碍。另外，可转移优良的生物性状，实现基因重组，而改良现有品种。目前原生质体融合所改良的目标性状包括抗冻、抗干旱、抗病毒、抗虫、耐高盐等，还可按照人们预先的期望创造出新物种。 2 原生质体的融合方法 2.1 自发融合在酶解细胞壁形成原生质体的过程中，相邻的原生质体会因细胞间胞间连丝的扩展和粘连而彼此融合形成同核体（homokaryon）。每个同核体内可包含两个或多个核，这种类型原生质体的融合被称作为自发融合。多核融合体常出现在植物幼嫩叶片或分裂旺盛的培养细胞制备的原生质体中。如在玉米胚乳愈伤组织细胞和玉米胚悬浮细胞原生质体中，大约有50%是多核融合体。 2.2 高pH-高Ca2+法

原生质体分离与融合

原生质体的分离、融合与培养一、实验目的 1.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理。 2.掌握植物原生质体分离、融合和培养的基本过程。 3.了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。二、实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。三、实验材料、试剂与仪器

1．材料新鲜的菠菜叶片 2．试剂（1）酶液：依次加入 1.25%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.04%甘露醇、20mmol/LKCl和20mmol/L2-吗啉乙磺酸（MES），55℃水浴10min，冷却至室温，再加10mmol/LCaCL2、5mmol/Lβ-巯基乙醇和0.1%BSA，0.45um微孔滤膜过滤，溶液呈透明橙色。（2）PEG溶液：4GpPEG4000\3mL去离子水、2.5mL0.8mol/L甘露醇和1mL1mol/L CaCL2。（3）MMg溶液：0.4mol/L甘露醇、15mmol/LMgCl2、mmol/LCaCl2和4mmol/LMES。（4）W5溶液：154mmol/LNaCl、125 mmol/LCaCl2、5 mmol/LKCl、和2 mmol/LMES （pH5.7）（5）MS母液：依次加入，大量元素mg/L、微量元素mg/L、铁盐mg/L、有机物质mg/L。（6）0.2mol/LCaCL2，pH6.8磷酸缓冲液，植物激素，13％CPW洗液、20％蔗糖溶液、无菌蒸馏水0.1% HgCl2 3.试剂三角瓶、离心管、离心机、烧杯、解剖刀、镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、

细菌原生质体融合步骤

细菌原生质体融合实验步骤一、实验目的了解原生质体融合技术的原理。学习并掌握以细菌为材料的原生质体融合技术。二、实验原理原核微生物基因重组主要可通过转化、转导、接合等途径，但有些微生物不适于采用这些途径，从而使育种工作受到一定的限制。1978 年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，有人提出微生物细胞原生质体融合这一新的基因重组手段。由于它具有许多特殊优点，所以，目前已为国内外微生物育种工作所广泛研究和应用。 (一)、原生质体融合的优点 (1)、克服种属间杂交的“不育性”，可以进行远缘杂交。由于用酶解除去细胞壁，因此，即使相同接合型的真菌或不同种属间的微生物，皆可发生原生质体融合，产生重组子。 (2)、基因重组频率高，重组类型多。原生质体融合时，由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用，使细胞相互聚集，可以提高基因重组率。原生质体融合后，两个亲株的整套基因组(包括细胞核、细胞质)相互接触，发生多位点的交换，从而产生各种各样的基因组合，获得多种类型的重组子。 (3) 可将由其他育种方法获得的优良性状，经原生质体融合而组合到一个菌株中。 (4) 存在着两个以上亲株同时参与融合，可形成多种性状的融合子。 (二)、原生质体融合步骤 (1)、选择亲本选择两个具有育种价值并带有选择性遗传标记的菌株作为亲本。 (2)、制备原生质体经溶菌酶除去细胞壁，释放出原生质体，并置高渗液中维持其稳定。 (3)、促融合聚乙二醇加入到原生质体以促进融合。聚乙二醇为一种表面活性剂，能强制性的促进原生质体融合。在有Ca2+ 、Mg2+离子存在时，更能促进融合。 (4)、原生质体再生原生质体已失去细胞壁，虽有生物活性，但在普通培养基上不生长，必须涂布在再生培养基上，使之再生。 (5)、检出融合子利用选择培养基上的遗传标记，确定是否为融合子。 (6)、融合子筛选产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型，前者性能不稳定，要选出性能稳定的单倍重组体，反复筛选出生产性能良好的融合子。 (三)、原生质体再生率和融合率计算三、实验材料 (一)、菌种：枯草芽孢杆菌T4412 ade- his-、枯草芽孢杆菌TT2 ade-pro- (二)、培养基(配制方法见下一页附录)： (1)、完全培养基(CM，液体)； (2)、完全培养基(CM，固体) 液体培养基中加入2.0%琼脂； (3)、基本培养基(MM)； (4)、补充基本培养基(SM) 在基本培养基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的纯化琼脂，75 Pa 灭菌20min； (5)、再生补充基本培养基(SMR) 在补充基本培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖，1.0％纯化琼脂作上层平板，2.0％纯化琼脂作底层平板、75 Pa 灭菌20 min。 (6)、酪蛋白培养基(测蛋白酶活性用)。 (三)、缓冲液：

原生质体融合技术在微生物遗传育种中的应用

原生质体融合技术在微生物遗传育种中的应用摘要原生质体融合技术是微生物遗传育种中的一项重要技术，它具有遗传信息传递量大，不受亲缘关系的影响，可有目的地选育理想的融合株，便于操作等优点，在遗传育种中具有广阔的应用前景。文章从原生质体融合的特点以及融合技术应用等方面进行了综述。关键词原生质体；原生质体融合；遗传育种’ 原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使其在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体。然后将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇助融，使它们相互凝集，通过细胞质融合接着发生两次基因组之间的接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体。两个具有不同基因型的细胞，采用适宜的水解酶剥离细胞壁后，在融合剂作用下，两原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基因重组的目的，最后对重组体进行生产性能，生理生化和遗传特性分析。一、原生质体融合的特点 1.杂交频率较高由于原生质体没有细胞壁的障碍，而且在原生质体融合时加入融合促进剂PEG，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交方法。 2.受接合型或致育性的限制较小由于两亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利不同种属间微生物的杂交。另外，出于原生质体融合是和致育性没有关系的细胞杂交，所以其受接合型或致育性的限制就比较小。 3.重组体种类较多由于原生质体融合后，两个亲株的整套基因组之间发生相互接触.有机会发生多次交换，可以产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组体二、原生质体融合技术的应用在微生物育种中，常根据不同需求通过原生质体融合技术培育出优质、高产、抗逆性强等优点的微生物菌种。 1.标记菌株的筛选