人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆

人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆

吕勇刚1,窦科峰1,吴昱彤2,赵爱志1,刘　杰4,陈　刚5,陶开山1,药立波3

(1.第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西西安　710033;2.唐都医院信息科,陕西西安　710038;

3.基础部生物化学教研室;

4.基础部药理学教研室,陕西西安　710032;

5.西安交通大学第一医院血液科,陕西西安　710061)

摘要:目的　扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因,将其克隆到T 载体来构建T 载体文库。方法　收集乳腺癌患者外周转移淋巴结30例,TRIzol 法提取总RNA 、纯化mRNA ,行RT 2PCR 扩增,制备T 载体,用于PCR 产物的克隆。结果　总RNA 纯度高,完整性好,mRNA 获得率为1%。经RT 2PCR ,V H 、V λ、V κ的每一条5’端引物均与其相应的3’端引物成功地扩增出了可变区基因片段,轻、重链T 载体库分别为1.7×108和3.5×108。结论　所采用的引物能够

100%扩增目的片段,T 载体过渡能显著提高克隆效率,为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础。

关键词:聚合酶链式反应;乳腺癌;抗体基因;T 载体

中图分类号:R737.9 文献标识码:A 文章编号:167128259(2004)0620558204

Amplif ication of all human V genes of breast carcinoma

from peripheral lymphadens

L üY onggang ,Dou Kefeng ,Wu Yutong ,Zhao Aizhi ,Liu Jie ,Chen G ang ,Tao Kaishan ,Yao Libo

(Department of Hepatobiliary Surgery ,Xijing Hospital ,Fourth Military Medical University ,Xi πan 710033,China )

ABSTRACT :Objective To amplif y all human V genes of breast carcinoma by R T 2PC R.The p roducts of PC R were cloned int o T 2vect or t o const ruct clone library.Methods Perip heral lymp hadens of 30p atients wit h breast

carcinoma were collected ,f rom w hich t otal RNA was ext racted by TRIzol Reagent ,and m RNA was p urified wit h Oligotex m RNA kit.Then cDNA was derived t hrough reverse t ranscrip tion.PC R p roducts were amplified and cloned int o T 2vect or t o const ruct clone libraries.

Re sults Total RNA was ext racted p urely and intactly ,so was

m RNA w hich accounts f or 1%of t he f or mer.By R T 2PC R ,every p air of p rimers amplified t he V gene efficiently.Rep ert oires of V H and VL were 3.5×108

and 1.7×108

resp ectively.Conclusion The set of p rimers adop ted are

able t o recognize 100%of f unctional V genes wit h high efficiency.T 2vect or will f acilitate t he digestion ,w hich lays

a f oundation f or const ruction and selection of p hage library.

KE Y WOR DS :p olymerase chain reaction ;breast carcinoma ;antibody gene ;T 2vect or

收稿日期:2004204214 修回日期:2004205211基金项目:国家自然科学基金资助(No.30371399)通讯作者:药立波,T el :83374547211;E 2mail :bioyao @https://www.360docs.net/doc/3610151747.html, 作者简介:吕勇刚(19742),男(汉族),医师,在读博士.

噬菌体抗体库技术是90年代抗体工程领域的重大进展,能够绕开免疫途径,直接制备全人源化的抗体片段。它将选择能力和扩增能力偶联起来,较好地模拟了体内B 细胞产生特异性抗体的过程。传统的单克隆杂交瘤技术与之相比,已经显得“迟缓和笨拙”,有被逐渐取代的趋势1。PCR 技术的发展,使得人们可以用一组引物扩增全套抗体的可变区基因,是抗体库技术出现的先决条件之一2。我们采用一组高效引物,以乳腺癌患者的外周淋巴结为原料,扩增抗体的全套可变区基因,并将其首先克隆入T 载

体,构建各自的T 载体文库,有助于提高PCR 产物的酶切和高效克隆,为抗体库的构建打下基础,并在方法学上进行了探讨。1　材料与方法

1.1　酶和化学试剂　TRIzol 提取液购自Invitrogen

公司;DEPC 为Sigma 产品;r Taq DNA 聚合酶、dN TP 购自大连宝生物制品公司;mRNA 纯化试剂盒

为Q IA GEN 产品;反转录试剂盒为Promega 产品;DNA 凝胶纯化试剂盒、大提质粒试剂盒购自上海华

舜生物工程有限公司。

1.2　组织总RNA 的提取　术中剥离乳腺癌患者外

周淋巴结30例(标本均经病理证实),迅速冻于液氮,

第25卷第6期2004年12月西安交通大学学报(医学版)

J our nal of Xi πan J iaot ong U niversity (Medical Sciences )V ol.25N o.6Dec.2004

置研磨器研成粉末,移入匀浆器加入TRIzol研至透亮,按照说明书(Invitrogen)操作得到总RNA,紫外分光光度仪定量并检测其完整性,质量较差者弃用,重新提取,最后30例所得总RNA各取等量混合, -80℃冻存备用。

1.3　mRNA纯化　按照试剂盒(Qiagen)进行,部分改良。按说明加入OEB(第8步)后,仔细吹打完毕, 70℃保温5min,迅速于26℃、16000×g离心2min,取小份定量,测定A260nm/A280nm值。1.4　反转录　按照试剂盒说明书进行(Promega),部分改良。取mRNA约0.5μg,70℃保温20min打开二级结构,迅速置冰上。按说明书依次加入各成分,置室温20min,42℃3min后再加入抑制剂和AMV反转录酶,总体系20μL。42℃90min,95℃5min。

1.5　引物设计与合成　引物设计参见文献3,适当改动和取舍,由赛百盛公司合成,PAGE纯化。我们在所有引物的5’端延长一段保护序列:①VH Back primers:TT A TCA TCG AG C CCG CTC G AG—;②VH Forward primers:G AT TGG TTT G CC CT A G CT AG C—;③Vλand VκBack primers:AG C AAG CGG CG C TTG G CG CG C—;④Vλand VκForward primers: GTT ATG GTC G AA CG C GTC G AC—。下划线依次引入XhoⅠ、N heⅠ、Bss HⅡ、S alⅠ酶切位点,第二轮PCR的引物同保护序列。

1.6　PCR反应　共进行两轮。第一轮以0.5～1μL 反转录产物cDNA作为模板,3′端引物等摩尔混合,分别与5′端各引物反应。反应条件为:94℃5min 热启动,94℃1min变性,55℃1min退火,72℃1min延伸,共30循环。最后进一步延伸7min,反应体系为25μL,将得到的PCR产物按比例混合(V H 混合,VL和V K以1∶2混合),胶回收纯化后100倍稀释,作为第二轮PCR的模板。反应体系同上。最后每管加入0.3μL dA TP继续延伸30min,目的是下一步连入T载体。经胶回收纯化后得到可变区抗体基因。

1.7　T载体的制备　T载体的前身是pSP73,我们实验组赵爱志博士去除相应的酶切位点后命名为pSP732T,转入大肠杆菌TG1,用于制备T载体。挑取TG1菌落转接于500mL培养液,摇过夜后大提质粒,平端酶Eco RⅤ使pSP732T线性化,酚/氯仿、氯仿抽提纯化后在r2Taq酶,d TTP作用下于72℃加温2h,琼脂糖电泳纯化后定量备用。

1.8　轻、重链T载体库的构建　V H、VL经胶回收定量后各取1.5μg和2μg T载体连接,体系20μL。16h后70℃30min灭活T4DNA连接酶。取1μL 连接产物与50～100μL感受态细胞进行规模电转化(TG1感受态的制备见文献4,电转参数:0.1mm～1.8kV;0.2mm～

2.5kV;电阻、电容均分别为200Ω;25μV),每次电转后用1mL37℃预热的SOC洗出并快摇1h复苏,取小份倍比稀释,铺抗生素琼脂板计算菌量,随机挑克隆双酶切验证阳性率。其余铺氨苄琼脂板,过夜后收获细菌提质粒,即为V H、VL 的T载体库。

2　结 果

2.1　总RNA及mRNA的提取和纯化　总RNA经1 g?L-1甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,90V4h,0.1 mol?L-1NH4AC浸泡凝胶20min后,在含有0.4 mg?L-1E B的0.1mol?L-1NH4AC中染色30min,紫外透射读胶仪上观察RNA电泳条带并照像。28S带的亮度为18S带的两倍,说明总RNA完整性好,未被降解(图1)。总RNA的量为1mg,mRNA的量为10μg,获得率为:10μg/1000μg=1%,A260nm/A280nm= 2.0。表明mRNA纯度高,

没有污染。

图1　淋巴结总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳

Fig.1Total RNA from human lymphadens analyzed by formalde2 hyde denaturing agarose electrophoresis

2.2　cDNA的同位素示踪　反转录后取少量行碱性琼脂糖凝胶电泳,经放射自显影,结果表明,cDNA合成为连续拖影,片段大小相似,分布范围较宽,从0.3kb到9.4kb,主要集中在2kb左右,结果证实了模板mRNA的完整性(图2)。

2.3　抗体可变区基因的扩增　反转录共进行了120管,完毕后所有产物混合,各取一半分别扩增V H和VL。两轮PCR共进行约500管。中间随机抽样电泳,监测产物扩增情况。经过R T2PCR,每一对引物都扩增出了相应的可变区片段(图3),V H、VL分别为375bp和360bp,与文献报道一致3。

2.4　T载体库的构建　复苏后取小份倍比稀释,铺琼脂糖氨苄板计数,V H、VL菌量分别为5×108和2.8×108,随机挑克隆双酶切,V H、VL阳性率分别为70%和60%,故V H、VL T载体库库容分别为

3.5×108和1.7×108。

955

6期吕勇刚,窦科峰,吴昱彤,等.人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆

图2　cDNA 碱性琼脂糖电泳后放射自显影

Fig.2Autoradiogram of first strand cDNA after electro phoresis

3　讨 论

3.1　是否要纯化mRNA 有些人认为直接以总RNA 为模板进行R T 2PCR 即可,可以省略mRNA 的

纯化这一步骤,而且t RNA 和rRNA 的存在对mRNA 有保护作用。我们的体会是如果总RNA 量比较少,可以直接反转录,但是在原材料来源充足,欲构建大容量抗体库的情况下,最好纯化mRNA 。因为,以mRNA 为模板将更加灵敏和高效,至于会失去保护

的问题,可用即时纯化、即时反转录的办法来解决。另外即便有t RNA 和rRNA 的保护,也需要彻底灭活RNAse ,如:金属器械180℃干烤8h 以上,塑料用品

保证初次开封使用或DEPC 浸泡24h 以上,操作中戴好干净的帽子、口罩,并及时更换手套等等。这对

于保证RNA (mRNA )的纯度和完整性都是非常重要的,也是后续PCR 操作成败的关键

。

图3　V 区基因的PCR 扩增

Fig.3PCR amplification of V gene

Lane 1～7:VH ;Lane 9～17:VL ;Lane 19～22:V K;Lane 8:DL2000Marker 3.2　反转录引物的采用　AMV 反转录酶具有RNAse 活性,在反转录时它一方面以RNA 为模板合

成cDNA ,另一方面它会切掉DNA/RNA 杂交体中的RNA 。所以,当目的片段接近于基因的5′端时,用Oligo 2d T 做引物会出现转录不到目的片段或还没有

转录完就被切断RNA 模板的问题。鉴于此,我们选择了随机六聚体引物来合成位于抗体基因5′端的可变区片段。

3.3　关于引物　引物的设计是决定抗体库多样性的

关键,影响着抗体库是否能够真实地反映原始抗体基因的分布情况,尤其是在天然抗体库中。1995年Tomlinson 等5归纳整理出V BASE 库,1998年Bradbury 等3依此为据设计引物,其设计标准是引

物的3′端至少和V 区基因有16bp 的同源性,总的简并度不超过8,最少的引物二聚体形成。结果可以100%地扩增抗体可变区基因,这一点也为我们的实

验所证实(图3)。其他如Marks 6、Welshof 7、Watkins 8、De Boer 等9设计的引物均在V BASE 公

布之前,对V 基因的扩增效率分别为59.5%、62.8%、62.8%、37%。所以,我们采用Bradbury 设计的

高效引物,这是抗体库多样性的保证之一。

引物的5′端设计长达21bp 的保护序列,目前还未见文献报道。其作用至少有3点:一是便于进行第二轮PCR 扩增,二是引入酶切位点,三是便于下一步PCR 产物的酶切。因为,酶切位点太靠近末端,将使

酶切效率极为低下10。我们在实验中发现,这么长的保护序列是不会影响引物与模板的特异性结合的。

引入酶切位点的依据,一是各酶之间的“合作性”,如:是否能用通用缓冲液,是否能用相同的酶切温度等。此外,还应该避免酶切位点出现在可变区基因之内。Persic L 等11和王琰等12对V 基因段各限制性酶切位点可能出现的频率进行了总结。对比

065　西安交通大学学报(医学版)第25卷

可知,我们采用的引物,其引入的四种限制性内切酶在相应的轻、重链V区出现的可能性均为0。避免了抗体库酶切过程中出现“异常重组子”12。这从另一个侧面证明我们所采用的引物是经得起检验的。

3.4　PCR产物的克隆　如上所述,尽管我们在引物的5’端设计长长的保护序列,但我们发现这只能在一定程度上提高酶切效率,而且要用加大酶量和延长酶切时间为代价。酶切时间过长又会出现星号活力等问题,会使PCR产物受损或降解,造成后续连接的效率低下。另外,即使酶切充分,也只是在PCR产物两边末端减少了几个碱基,很难用常规的电泳检测出来,往往连接效率低还找不到原因,构建一个大约109的库,要成千上万次的重复,这对于一般的实验室是难以忍受的。T/A克隆是PCR产物克隆的常用策略,从未有人将其应用到抗体库的构建,其原理是普通r Taq酶扩增得到的PCR产物3′末端带有A,可以和T载体3′端的T连接。

抗体库的多样性取决于如下条件:首先是标本的用量。从国内外发表的大量文献看,最少有1～213

例标本已经能建库并成功筛选到特异性抗体。收集的标本当然越多越好,考虑到取材的时间和难度,我们共收集淋巴结30例,这是抗体基因多样性的最初来源。外周转移的淋巴结体积较大,便于操作失败时重新提取。另外,要取用富含B细胞的皮质部分。体内抗体重链的多样性约107,所以单克隆B细胞的多样性也应该达到这个数量级,才能保证抗体基因的多样性。从我们总RNA的量推算,B细胞的数量应该在108以上;其次是高效引物的采用;再次是PCR 产物的高效克隆。它们将为大容量抗体库的构建和筛选打下基础。

参考文献:

[1]Sheets MD,A mersdorf er P,Finner n R.Efficient const ruction

of a large noni mmune p hage a ntibody library:The p roduction of high2affinity huma n single2chain a ntibodies t o p rotein a ntigens J.Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(11):6157-6162.

[2Willia ms SC,Fri ppiat J P,Tomlinson IM.Sequence a nd evolu2 tion of t he huma n ger mline V la mbda repert oire J.J Mol Bi2 ol,1996,264(2):220-232.

[3Sblattero D,Bradbur y A.A definitive set of oligonucleotide p ri mers f or a mplif ying huma n V regions J.I mmunotech2 nology,1998,3(4):271-278.

[4Zabarovsk y ER,Winberg G.High efficiency elect rop oration of ligated DNA int o bacteria J.Nucleic Acids Res,1990,18

(19):5912.

[5Cook GP,Tomlinson IM.The huma n i mmuno globulin V H repert oire J.I mmunol Toda y,1995,16(5):237-242.

[6Mar ks J D,Triste m M,Kar pas A,et al.Oligonucleotide p ri mers f or p olymerase chain reaction a mplification of huma n

i mmunoglobulin variable genes a nd design of f a mily2specific

oligonucleotide p robes J.Eur J I mmunol,1991,21(4):985-991.

[7Welschof M,Ter ness P,Kolbin ger F.A mino acid sequence based PCR p ri mers f or a mplification of rearra nged huma n heavy

a nd light chain i mmunoglobulin variable region genes J.J I m2

munol Met hods,1995,179(2):203-214.

[8Wat kins BA,Davis A E,Fiorentini S.V2region a nd class specif2 ic R T2PCR a mplification of huma n i mmunoglobulin heavy a nd light chain genes f rom B2cell lines J.J I mmunol,1995,42

(4):442-448.

[9de Boer M,Cha n g S Y,Eichinger G,et al.Design a nd a nalysis of PCR p ri mers f or t he a mplification a nd cloning of huma n i m2 munoglobulin Fab f ragments J.Hum A ntibodies H ybridomas, 1994,5(1-2):57-64.

[10Kauf ma n DL,Eva ns GA.Rest riction endonuclease cleava ge at t he ter mini of PCR p roducts J.Biotechni ques,1990,9(3): 304-306.

[11Persic L,Roberts A,Wilt on J.A n inte grated vect or syste m f or t he eukaryotic exp ression of a ntibodies or t heir f ragments af ter selection f rom p hage display libraries J.Gene,1997,187(1): 9-18.

[12]王琰,王刚,化冰.人噬菌体抗体库中异常重组子的分析J.细

胞与分子免疫学杂志,2002,18(1):63-66.

[13Clar k MA,Hawkins NJ,Pa paioa nnou A.Isolation of huma n

a nti2c2erbB22Fabs f rom a lymp h node2derived p hage display li2

brary J.Clin Ex p I mmunol,1997,109(1):166-174.

(编辑　韩维栋)

165

6期吕勇刚,窦科峰,吴昱彤,等.人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆