总结生物药物分离纯化的方法

总结归纳本课程介绍的可用于物质分离纯化的方法，并说出每种方法的原理。

萃取分离法

溶剂萃取法原理：

利用物质在两种互不相溶的液相中分配特性不同而进行的分离

设法使一种溶解于液相的物质传递到另一液相的操作

pH影响分配系数-表观分配系数

双水相萃取原理：利用生物物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行分离的过程

反胶束萃取原理：表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，非极性基团在外，极性基团则排列在内，形成一个极性核，此极性核具有溶解极性物质的能力。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水性物质能够溶于极性核内部的水中，由于周围的水层和极性基团的保护，蛋白质不与有机溶剂接触，从而不会造成失活。

超临界萃取原理：当气体物质处于其临界温度(Tc)和临界压力(Pc)以上时，不会凝缩为液体，只是密度增大，具有许多特殊的物理化学性质：流体的密度接近于液体的密度,粘度接近于气体；在临界点附近,超临界流体的溶解度对温度和压力的变化非常敏感；

固相析出分离法

盐析法原理：

盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。

破坏双电层：在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。

破坏水化层：中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。

有机溶剂沉淀法原理：

1、降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。

2、水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

等电点沉淀法原理：

Pl时分子表面静电荷未零，双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用。主要：去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。

成盐沉淀法原理：

1.金属离子沉淀

所用的金属离子，包括Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+等。

蛋白质和酶分子中因为含有羟基、氨基、咪唑基和硫氢基等，均可以和上述金属离子作用形成盐复合物。

分离沉淀→复合物分解→除金属离子（离子交换或金属螯合剂EDTA）

2.有机酸类复合盐

含氮有机酸如苦味酸、苦桐酸和鞣酸等能够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉析出。工业上用此法制备蛋白质时，需采取较温和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。

亲和沉淀法原理：

配基+可溶性载体→偶联成载体-配基复合物（亲和沉淀剂）可选择性地与蛋白质结合而沉淀出来它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。所以其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。

高分子聚合物沉淀法原理:

水溶性非离子型高分子聚合物能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。

PEG、壬苯乙烯化氮（NPEO)、葡聚糖

双水相或单高聚物其中应用最多的是聚乙二醇。无毒，对产品的影响小，但不易除去

表面活性剂沉淀法原理：

CTAB（十六烷基三甲基季胺溴化物）、CPC(十六烷基氯化吡啶)：沉淀酸性多糖

与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出。

SDS：分离胰蛋白或核蛋白目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。

结晶原理：溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体。只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。通过结晶，溶液中的大部分杂质会留在母液中，经过滤、洗涤可得到纯度高的晶体。

吸附法

基本原理：界面上的分子同时受到不相等的两相分子的作用力，界面分子的力场不饱和，即存在一种固体的表面力，能从外界吸附分子、原子或离子，并在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层。

凝胶层析

基本原理：凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。离子交换法

基本原理：利用溶液中带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。带电粒子与离子交换剂间的作用力是静电力。

亲和纯化技术

亲和层析的原理

配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。

吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质.

样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。

亲和错流过滤原理：

亲和层析+超滤

基质及大分子亲和配基

基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内核表面。配基对提取的目标物进行专一可逆的吸附，形成复合体；

用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨大可被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其它成分分离。

亲和膜原理：

短粗型亲和层析柱有利提高分离操作速度

微孔膜：柱高无限低，柱径无限大

亲和配基固定在膜孔表面，流体在对流透过膜的过程中目标蛋白与配基接触而被吸附

亲和萃取原理：

利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行的双水相萃取，在亲和配基的亲和结合作用下

促进目标产物在PEG相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。

亲和反胶团萃取原理：

指在反胶团相中除通常的表面活性剂以外，添加另一种亲水头部为亲和配基的助表面活性剂通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配。

亲和沉淀原理：

是生物亲和相互作用与沉淀分离相结合的生物大分子的分离纯化技术。

亲和电泳原理：

亲和+电泳