实验四 腹水型单抗的制备及纯化
实验四腹水型单抗的制备及纯化
迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首先BALB/c 小鼠。本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有细胞及其残渣、小颗粒物质、脂肪滴以及小鼠的各种杂蛋白，因此在很多情况下要提纯后才能使用。而腹水单抗的纯化是一个相当困难的工作，本实验将进行IgG1型腹水单抗的提纯方法。
材料：
1、成年BALB/c小鼠。
2、灭菌液体石蜡或福氏不完全佐剂；处于对数生长期的杂交瘤细胞；新鲜采集的腹水
（或冻存的腹水）。
3、饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，正辛酸，0.1M NaOH，1M NaOH，0.06M，pH4.0
NaAc-HAc缓冲液，0.01M，pH7.4 PBS，10×PBS（0.01M，pH7.4）。
方法：
一、腹水的制备
1．取12周龄的BALB/ c小鼠腹腔注射灭菌石蜡，0.5ml/只或腹腔注射福氏不完全佐剂，
0.2-0.3ml/只。
2．1周后（注射灭菌液体石蜡）或3天后（注射福氏不完全佐剂）腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠1—3×106/0.3ml。
3．间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水。将腹水离心（2000rpm离心5min），吸去最上层的脂肪组织，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，将上清加入50﹪甘油冻存于－20℃冰箱，留下一小部分测定效价。
二、辛酸—硫酸铵法纯化腹水中的单抗
1．取3ml腹水，2500r/min离心弃杂质，加入0.06M，pH4.0 NaAc-HAc缓冲液3ml，调pH 至4.8（用0.1M NaOH调）；
2．加入99ul正辛酸（33ul/ml腹水），室温搅拌≥30min，4℃搅拌≥60min，逐滴加完，4℃澄清2h（20min）；
3．取出15000r/min离心30min（10min）（4℃），去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白），上清加入1/10体积的10×PBS（0.01M，pH7.4），用1M NaOH调pH至7.2；
4．上清滴加等量饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，使硫酸铵的饱和度为50％，继续搅拌10-30min，静置30min；
5．10000rpm（4℃）离心30min（10min），弃上清，将沉淀溶于1.2ml，0.01M，pH7.4 PBS 中，
6．0.01M，pH7.4 PBS透析过夜（4℃），其间换液3次，收集透析袋内液体，—20℃保存备用。少数测效价。
单克隆抗体制备的基本原理
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
纯化水检验试剂的配制及检验方法
纯化水 纯化水：本品为饮用水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜的方法制得的制药用水，不含任 何添加剂。（药典411页） 取样：微生物监测放水至少3分钟以上，理化检测放水20秒。 按干燥品计算：取未经干燥的供试品进行试验，并将计算中的取用量按检查项下测得的干燥失重（或 水分或溶剂）扣除。 【检查】 （1）酸碱度 A、试剂的配制 ①甲基红指示液：取甲基红0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液7.4ml使溶解，再加水稀释至200ml， 即得。变色范围pH4.2-6.3（红→黄）。（药典附录177） 0.05mol/L氢氧化钠溶液：取固体氢氧化钠0.2g，加水稀释至100ml，即得。 水：试验用水，除另有规定外，均系指纯化水。酸碱度检查所用的水，均系指新沸并放冷至室温的水。（药典凡例三十二） ②溴麝香草酚蓝指示液：取溴麝香草酚蓝0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.2ml使溶解，再加水稀 释至200ml，即得。变色范围pH6.0-7.6（黄→蓝）。（药典附录178） B、检验方法：取本品10ml，加甲基红指示液2滴，不得显红色；另取10ml，加溴麝香草酚蓝指示液 5滴，不得显蓝色。（药典411页） （2）硝酸盐 原理：二苯胺在酸性条件下被硝酸根离子氧化，生成蓝色的醌式联二苯。 A、试剂的配制 ①10%氯化钾溶液：称取氯化钾10.0g，加水使溶解成100ml，即得。 ②0.1%二苯胺硫酸溶液：称取二苯胺0.10g，加硫酸100ml使溶解，即得。 二苯胺试液：取二苯胺1g，加硫酸100ml使溶解，即得。（药典附录170） ③标准硝酸盐溶液：取硝酸钾0.163g，加水溶解并稀释至100ml，精密量取1ml，加水稀释成100ml，再精密量取10ml，加水稀释成100ml，摇匀，即得（每1ml相当于1μg NO3）。（药典411页） ④无硝酸盐与无亚硝酸盐的水：取无氨水或去离子水即得（检查：取本品50ml，加碱性碘化汞钾1ml，不得显色。）（附录151） 无氨水：取纯化水1000ml，加稀硫酸1ml与高锰酸钾试液1ml，蒸馏即得。（附录151）（注意：在水 中加入几滴浓硝酸pH＜2使得各种形态的氨氮转化为不挥发的铵盐再进行蒸馏，前后200ml流出液都应弃去，只保 留中间蒸出液。） 稀硫酸：取硫酸57ml，加水稀释至1000ml，即得。（附录174） 高锰酸钾试液：可取用高锰酸钾滴定液（0.02mol/L）（注意：置玻璃塞棕色玻璃瓶中密闭保存。） 高锰酸钾滴定液（0.02mol/L）：取高锰酸钾3.2g，加水1000ml，煮沸15分钟，密塞，静置2日以上，用垂熔玻璃，滤器滤过，摇匀。（再依照药典标定）（附录181） B、检验方法：取本品5ml置试管中，于冰浴中冷却，加10%氯化钾溶液0.4ml与0.1%二苯胺硫酸溶液 0.1ml，摇匀，缓缓滴加硫酸5ml，摇匀，将试管于50℃水浴中放置15分钟，溶液产生的蓝色与标 准硝酸盐溶液0.3ml，加无硝酸盐水4.7ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0.000006%）。 （药典411页） （3）亚硝酸盐 原理：亚硝酸盐+对氨基苯磺酰胺+萘乙胺→紫红色偶氮化合物
单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
常用实验室检查
一、血液检查： （一）红细胞计数和血红蛋白测定 红细胞：男（~）×1012/L 血红蛋白：男120~160g/L 女（~）×1012/L 女110~150g/L 新生儿（~）×1012/L 新生儿170~200/L 临床意义： 1.红细胞及血红蛋白减少：婴幼儿、15岁以前的儿童、部分老年人、妊娠中晚期；各种原因所致的贫血。 2.红细胞及血红蛋白增多：剧烈呕吐、大面积烧伤后；高原、剧烈运动；阻塞性肺气肿、发绀型先天心脏病及红细胞增多症等。 （二）白细胞计数及白细胞分类计数 白细胞：成人（4~10）×109/L；新生儿（15~20）×109/L；6个月~2岁（11~12）×109/L。 白细胞分类计数：类型/百分数/绝对值 1.中性粒细胞（N）：①杆状核（st）：0~5 ~ ②分叶核（sg）：50~70 2~7 2.嗜酸性粒细胞（E）：~5 ~ 3.嗜碱性粒细胞（B）：0~1 0~ 4.淋巴细胞（L）： 20~40 ~4
5.单核细胞（M）： 3~8 ~ 临床意义： ①白细胞计数增多与减少主要受中性粒细胞数量的影响。 1.中性粒细胞增多：新生儿、妊娠、分娩、高温、严寒、饱餐、剧烈运动等；急性感染（主要原因）、严重组织损伤及血细胞破坏、急性大出血（可作为内出血诊断指标）、急性中毒、白血病、骨髓增生疾病及恶性肿瘤。 2.中性粒细胞减少：感染（革兰阴性菌、病毒、原虫等）、血液疾病、理化损伤、单核-吞噬细胞系统功能亢进、自身免疫疾病。 3.核左移：常见于化脓性感染、急性失血/中毒/溶血反应及白血病。 4.核右移：主要见于造血功能减退。 ②嗜酸性粒细胞增多：变态反应性疾病、寄生虫病、皮肤病、血液病、恶性肿瘤、传染病。 ③嗜碱性粒细胞增多：变态反应疾病、血液病、恶性肿瘤等。 ④淋巴细胞。 1.淋巴细胞增多：4~6天的婴儿至6~7岁儿童；病毒\杆菌感染、淋巴细胞性恶性组织病等。 2.淋巴细胞减少：主要见于接触放射线、应用肾上腺皮质激素、先天\获得性免疫缺陷综合征等。 ⑤单核细胞增多：感染、血液病等。
单克隆抗体制备方法(全)
单克隆抗体制备方法 1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。 主要仪器设备： 超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，一般的单克隆抗体制备方法大同小异。 方法 动物的选择与免疫 1. 动物的选择 BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2. 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。
单克隆抗体研制最详细步骤
单克隆抗体研制最详细步骤 作者：时间：2008-05-15 15:54:24 来源: 生物谷浏览评论 1、单抗的标记 目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断（盒）的形式提供，其中核心为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。 （1）酶标记 A、辣根过氧化物酶（HRP）标记 辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。 程序一： a. 将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 b. 加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 c. 加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。 d. 称取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。 e. 用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。 f. 将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集第一峰。 g. 酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量（mg/ml）=OD403×0.4 IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62 克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。 h. HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。 程序二： 1. 将5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。 2. 再加1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色；随后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。 3. 移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。 4. 吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光；加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用7小时。 5. 再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。 6. 用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。
如何纯化化学试剂
如何纯化化学试剂 在化学分析、仪器分析、无机制备、有机合成以及其他的科学实验工作中经常会遇到所用的化学试剂纯度不够，或买不到所需纯度的化学试剂，这就需要在实验室自己对现有的化学试剂进行纯化，以便得到所需纯度的化学试剂。实验室中常用的纯化化学试剂的方法主要有：蒸馏和精馏、重结晶、萃取、区域熔融和色谱分离等，下面将分别加以简单介绍 蒸馏和精馏： 使用广泛的纯化方法，根据液体混合物中液体与蒸汽之间混合组分的分配差别进行纯化，是纯化挥发性和半挥发性化学试剂的第一选择。 蒸馏和精馏的实际应用： 蒸馏和精馏主要用于液体、或是加热可成为液体的化学试剂，特别是用于有机化学试剂的纯化。在蒸馏或精馏之前，有时可加入某些化学试剂，与欲纯化的化学试剂中的杂质发生化学反应，生成沸点更高（或更低）的物质，在蒸馏或精馏是更容易除去。 在蒸馏或精馏时，往往是除去最初馏出的馏分和最后剩下的馏分，两头除去的越多，得到的化学试剂纯度就越高，但产率越低。。。 下面介绍几个用蒸馏或精馏方法纯化的化学试剂： 1.盐酸的提纯： （1）除去一般杂质的盐酸 用三次离子交换水将一级盐酸按盐酸：水=7：3的体积比稀释（或按1：1稀释，按此比例稀释仅得到浓度为6N的盐酸）。将此盐酸1.5升装入2升的石英或硬质玻璃蒸馏瓶中，用可调变压器调节加热器，控制馏速为200毫升/小时，弃去前段馏出液150mL，取中段馏出液1升，所得的纯盐酸浓度为6.5～7.5N，铁、铝、钙、镁、铜、铅、锌、钴、镍、锰、铬、锡的含量在5′10-6--2′10-7%以下。 （2）除去砷的盐酸 用三次离子交换水将一级盐酸按7：3的体积比稀释，加入适量氧化剂（按体积加入2.5%硝酸或2.5%过氧化氢或高锰酸钾0.3克/1.5升）。将此盐酸1.5升装入2升的石英或硬质玻璃蒸馏瓶中，放置15分钟后，以100毫升/小时的馏速进行蒸馏。弃去前段馏出液150毫升，取中段馏出液1升备用。砷的含量在1′10-6%以下。 2.硝酸的提纯 于2升硬质玻璃蒸馏器中，放入1.5升硝酸（一级品），在石墨电炉上借可调变压器调节电炉温度进行蒸馏，馏速为200-400毫升/小时，弃去初馏份150毫升，收集中间馏份1升。将上述得到的中间馏份2升，放入3升石英蒸馏器中。将石英蒸馏器固定在石蜡浴中进行蒸
常用实验室检查
常用实验室检查 ［血液检查］ 1.红细胞计数（RBC）正常值：成年男性为（4.0—5.5）×1012/L；女性为（3.5—5.0）×1012/L。 2.血红蛋白（Hb）正常值：成年男性为120—160g/L;女性为110—150g/L。 3.红细胞与血红蛋白病理性增多常见于慢性肺心病患者。 4.红细胞与血红蛋白降低均称为贫血，其中血红蛋白的降低值对贫血程度判断更重要。 5.红细胞生成减少见于缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血等患者。 6.红细胞破坏过多见于各种溶血性贫血，如遗传性球型红细胞增多症，阵发性睡眠性血红蛋白尿、免疫性溶血性贫血等。 7.白细胞计数（WBC）正常值：成人为（4.0—10.0）×1012/L。 8.白细胞分类计数（DC）中性粒细胞（包括杆状核、分叶核）占50％—75％。 9.白细胞及中性粒细胞增多最常见于急性感染（尤其是化脓菌感染）；急性失血、急性溶血、急性中毒、组织严重损伤或坏死、恶性肿瘤等疾病均可引起白细胞及中性粒细胞增多。10.白细胞及中性粒细胞减少多见于病毒感染和部分格兰阴性杆菌感染（如伤寒、流感）；再生障碍性贫血、脾功能亢进、电离辐射、使用某些化学药物等均可引起白细胞及中性粒细胞减少。 11.外周血液中中性粒细胞不分叶核粒细胞增多（>5％）即为核左移；核左移常见于急性化脓菌感染、急性失血、急性中毒及急性溶血反应等患者。 12.外周血液中中性粒细胞核分叶5叶以上者增多（>3％）即为核右移；核右移常见于巨幼细胞性贫血、恶性贫血、慢性感染、尿毒症等患者。 13.嗜酸性粒细胞增多见于变态反应性疾病，如支气管哮喘、药物过敏反应等。 14.淋巴细胞增多见于病毒感染、结核感染及慢性淋巴细胞性白血病等。 15.血小板计数（PC或PLT）正常值：（100—300）×109/L。 16.女性月经期的第1日可引起血小板生理性减少。 17.血小板病理性减少常见于再生障碍性贫血、急性白血病、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、脾功能亢进、弥散性血管内凝血(DIC)等患者。 18.网织红细胞的增减可反映骨髓造血功能的盛衰；网织红细胞增多见于各种增生性贫血，网织红细胞减少见于再生障碍性贫血等患者。 19.测定红细胞沉降率（血沉）时，标本中应加入的抗凝剂为3.8％的枸橼酸钠0.4ml。 20.血沉病理性增快见于各种急慢性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等患者。 ［尿液、粪便检查］ 21.做尿常规检查尿标本可随时留取新鲜尿液100ml左右，但以晨尿最好。 22.正常成人每天尿量为1000—2000ml；超过2500ml为多尿；少于400ml为少尿；少于100ml 为无尿。 23.每升尿内含有血量超过1ml即出现淡红色，称肉眼血尿；尿液离心沉淀后每高倍视野平均见到3个以上红细胞称为镜下血尿。 24.肉眼血尿或镜下血尿常见于泌尿系统炎症、肾结核、肾结石、肾肿瘤等。 25.新鲜尿液若呈白色或黄色混浊为脓尿或菌尿；尿液离心沉淀后每高倍视野平均见到5个以上白细胞为镜下脓尿。 26.脓尿或菌尿、镜下脓尿常见于泌尿系统感染，如肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎等。 27.尿液呈深黄色且震荡后出现黄色泡沫为胆红素尿；胆红素尿见于阻塞性黄疸和肝细胞性黄疸患者。 28.尿液呈酱油色多见于血红蛋白尿；血红蛋白尿见于各种原因引起溶血的患者。 29.尿液呈乳白色为乳糜尿；乳糜尿见于丝虫病、肾周围淋巴管阻塞的患者。
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
常用有机试剂的纯化
常用有机溶剂的纯化 有机化学实验离不开溶剂，溶剂不仅作为反应介质使用，而且在产物的纯化和后处理中也经常使用。市售的有机溶剂有工业纯、化学纯和分析纯等各种规格，纯度愈高，价格愈贵。在有机合成中，常常根据反应的特点和要求，选用适当规格的溶剂，以便使反应能够顺利地进行而又符合勤俭节约的原则。某些有机反应（如Grignard 反应等），对溶剂要求较高，即使微量杂质或水分的存在，也会对反应速率、产率和纯度带来一定的影响。由于有机合成中使用溶剂的量都比较大，若仅依靠购买市售纯品，不仅价值较高，有时也不一定能满足反应的要求。因此了解有机溶剂性质及纯化方法，是十分重要的。有机溶剂的纯化，是有机合成工作的一项基本操作，这里介绍了市售的普通溶剂在实验室条件下常用的纯化方法。 1．无水乙醚( absolute ether ) bp 34.5℃， 1.3526， 0.71378 20D n 20 4d 普通乙醚中含有一定量的水、乙醇及少量过氧化物等杂质，这对于要求以无水乙醚作溶剂的反应（如Grignard 反应），不仅影响反应的进行，且易发生危险。试剂级的无水乙醚，往往也不合要求，且价格较贵，因此在实验中常需自行制备。制备无水乙醚时首先要检验有无过氧化物。为此取少量乙醚与等体积的2%碘化钾溶液，加人几滴稀盐酸一起振摇，若能使淀粉溶液呈紫色或蓝色，即证明有过氧化物存在。除去过氧化物可在分液漏斗中加人普通乙醚和相当于乙醚体积1/5的新配制硫酸亚铁溶液(1)，剧烈振摇后分去水溶液。然后除去过氧化物，按照下述操作进行精制。 [步骤] 在250 mL 圆底烧瓶中，放置100 mL 除去过氧化物的普通乙醚和几粒沸石，装上冷凝管。冷凝管上端通过一带有侧槽的橡皮塞，插人盛有10 mL 浓硫酸(2)的滴液漏斗。通人冷凝水，将浓硫酸慢慢滴人乙醚中，由于脱水作用所产生的热，乙醚会自行沸腾。加完后摇动反应物。 待乙醚停止沸腾后，拆下冷凝管，改成蒸馏装置。在收集乙醚的接受瓶支管上连一氯化钙干燥管，并用与干燥管连接的橡皮管把乙醚蒸气导人水槽。加人沸石，用事先准备好的水浴加热蒸馏。蒸馏速度不宜太快，以免乙醚蒸气冷凝不下来而逸散室内(3)。当收集到约70 mL 乙醚，且蒸馏速度显著变慢时，即可停止蒸馏。瓶内所剩残液，倒人指定的回收瓶中，切不可将水加人残液中（为什么？）。将蒸馏收集的乙醚倒入干燥的锥形瓶中，加入1g 钠屑或1g 钠丝，然后用带有氯化钙干燥管的软木塞塞住，或在木塞中插入一末端拉成毛细管的
常用实验室检查正常值
临床常用实验室检查正常值 血液检查 红细胞成年男性（4.0~5.5）×1012/L 女性（3.5~5.5）×1012/L 新生儿（6.0~7.0）×1012/L 血红蛋白成年男性120~160g/L 女性110~150g/L 新生儿170~200g/L 白细胞成人（4~10）×109/L 新生儿（15~20）×109/L 6个月~2岁（11~12）×109/L 白细胞分类N 50~70% E 0.5~5% B0~1% L20~40% M3~8% 血小板（100~300 ）×109/L 红细胞比容男0.4~0.5 女0.37~0.48 红细胞平均指数MCV82~92fl MCH27~31pg MCHC320~360g/L 出血时间Duke法 1~3min 凝血时间试管法 4~12min 凝血酶原时间11~13s 网织红细胞0.5%~1.5% 平均1%新生儿2%~6% 红细胞沉降率男0～15mm/h 末女0～20mm/h末 尿液检查 颜色淡黄色 尿量1000~2000ml/24h 平均1500ml/h 比重最大变动范围 1.003~1.030以上 一般变动范围 1.015~1.025 晨尿 1.020左右 尿沉渣检查 红细胞 0~偶见/HP 上皮细胞 0~少量/HP 白细胞＜5/HP 透明管型 0~偶见/LP 12小时沉渣计数（Addis计数） 白细胞＜1000000 /12h 红细胞＜500000/12h 管型＜5000/12h 1小时尿细胞计数 白细胞男＜7×104/h女＜14×104/h
红细胞男＜3×104/h女＜4×104/h 中段尿培养菌落形成单位（CFU） 杆菌：＞105CFU肯定为感染 球菌：＞103CFU肯定为感染 尿葡萄糖定性（—）定量斑氏法 0.1~0.9g/d 尿蛋白定性（—）定量＜150mg/24h 尿蛋原 稀释试验＜1∶20 定量 0~5.9mol/L（0~3.5mg/d） 尿酮体试验定性（—） 尿胆红素试验定性（—） 尿妊娠试验定性乳胶法（—） 粪便检查 颜色：黄褐色量100~300g/日细胞（上皮细胞或白细胞）0~偶见/HP，食物残渣、大量植物细胞、淀粉颗粒、肌纤维等。隐血试验阴性。 血清蛋白测定 总蛋白60~80g /L 白蛋白40~55g/L 球蛋白20~30g/L A/G比值 1.5：1~2.5：1 甲胎蛋白（α-FP，AFP）0~25μg/L （0~25ng/ml）血清C反应蛋白（CRP） 单向免疫扩散法〈8mg/L 尿素氮成人3.2~7.1 mmol/L 儿童1.8~6.5 mmol/L 尿酸119~238μmol/L 肌酐全血88.4~176μmol/L 血清男性53~106μmol/L 女性44~97μmol/L 血糖（空腹） 全血（Folin-吴法）4.4~6.7（80~120 血清（邻甲苯胺法）3.9~6.4 mmol/L(70~110 mg/dl） 血钾（K+）4.1~5.6 mmol/L（4.1~5.6 mEq/L） 血钠（Na+）135~144 mmol/L（135~144 mEq/L） 血钙（Ca2+） 2.2~2.7 mmol/L
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都
腹水抗体制备一般流程
腹水抗体制备(实验室级别) 2012-8-27 一、实验原理： 将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。 二、实验材料： 药品：血清培养基、液体石蜡、生理盐水 仪器：电热恒温水浴箱、CO2培养厢、超净工作台、低速自动平衡离心机 三、制备步骤： 1.打石蜡 在细胞培养前两周，取8周-10周的Balb/C小鼠，按每个细胞株注射3只，1ml/只，以促进小鼠肠道蠕动，进行分笼，写好标记，十天后准备注射细胞； 2.杂交瘤细胞复苏与扩大培养 (1)12孔细胞培养板，每孔中加入的细胞培养液约2ml。 (2)按冻存细胞的液氮罐位置，取出冻存的细胞管，在37℃水浴箱中搅动1min 左右，快速融化冷冻的杂交瘤细胞。 (3)将融化的细胞吸入5mL的细胞培养液中，尽量收集细胞，装入EP管，然后 平衡EP管，800rpm，8min，进行离心。 (4)将离心好的细胞上清液吸除，吸取3mL细胞培养液混匀沉淀细胞，将该细胞 液吸出，按1ml/孔混匀到相应培养板孔中，显微镜下观察复苏后的细胞数量，生长形态和背景是否有污染及杂质，然后放入细胞培养厢中进行孵育。 3.杂交瘤细胞收集与注射 (1)待细胞处于对数生长期，即可收集。吸取上清1ml后，吹打细胞，使贴壁细 胞脱落，然后收集到15ml离心管中，800rpm，8min离心， (2)吸取离心上清液(冻存备用)，然后每管加入4ml生理盐水，混匀后，同样条 件再次离心，弃去上清液，每管再加人2-3ml生理盐水，混匀后吸入5ml注射器，按约1ml-0.5ml/只，注射小鼠腹腔。从注射后起一周后，每天注意观察小鼠腹腔隆起程度和小鼠生命状态，防止小鼠死亡。 4.腹水收集 (1)取经过免疫的腹部隆起的小鼠，颈部处死，用消毒酒精浸泡，用剪刀剪开腹 部上皮，撕开腹部皮肤，挑起腹腔膜，剪开，注意不要全部剪开，将吸管插进去，挤压腹水后，再吸取腹水到15ml离心管中，800rpm，30min离心，收集油脂层一下淡黄液体，即为腹水抗体。 (2)正常情况下，每只小鼠可收集2-3ml腹水。抗体浓度0.5-5mg/ml。按1ml/ 管，用1.5mlEP管分装后放-80℃冻存。 5.抗体纯化 (1)ProteinG亲和层析柱准备:填料（1ml）装柱后，超纯水流洗3-5个柱床体积 以洗掉乙醇，用平衡缓冲液洗5-10个柱床体积平衡柱子。 (2)上样：将样品上柱，上柱前需将样品超滤浓缩至1ml上柱。 (3)洗涤：平衡缓冲液洗5-10个柱床体积，直至洗涤液用检测液检测无明显显 色反应为止。
Fe(OH)3溶胶制备纯化及性质实验报告 华师
溶胶的制备、纯化及稳定性研究 一、前言 1、实验背景 胶体现象无论在工农业生产中还是在日常生活中，都是常见的问题。为了了解胶体现象，进而掌握其变化规律，进行胶体的制备及性质研究实验很有必要。 氢氧化铁胶体因其制备简单、带有颜色和稳定性好等特点被广泛应用于大学物理化学实验中，并且是高中化学中的一个重要实验。但是采用电泳方法测定溶胶的电动电势（ζ）却是始终是一个难点，因为溶胶的电泳受诸多因素影响如：溶胶中胶粒形状、表面电荷数量、溶剂中电解质的种类、离子强度、PH、温度和所加电压。 2、实验要求 (1)了解制备胶体的不同方法，学会制备Fe(OH)3溶胶。 (2)实验观察胶体的电泳现象，掌握电泳法测定胶体电动电势的技术。 (3)探讨不同外加电压、电泳时间、溶胶浓度、辅助液的pH值等因素对Fe(OH)3溶胶电动电势测定的影响。 (4)探讨不同电解质对所制备Fe(OH)3溶胶的聚沉值,掌握通过聚沉值判断溶胶荷电性质的方法。 二、实验部分 1.实验原理 溶胶的制备方法可分为分散法和凝聚法。分散法是用适当方法把较大的物质颗粒变为胶体大小的质点，如机械法，电弧法，超声波法，胶溶法等；凝聚法是先制成难溶物的分子(或离子)的过饱和溶液，再使之相互结合成胶体粒子而得到溶胶，如物质蒸汽凝结法、变换分散介质法、化学反应法等。Fe(OH)3溶胶的制备就是采用化学反应法使生成物呈过饱和状态，然后粒子再结合成溶胶。 在胶体分散系统中，由于胶体本身电离，或胶体从分散介质中有选择地吸附一定量的离子，使胶粒带有一定量的电荷。显然，在胶粒四周的分散介质中，存在电量相同而符号相反的对应离子。荷电的胶粒与分散介质间的电位差，称为ξ电位。在外加电场的作用下，荷电的胶粒与分散介质间会发生相对运动。胶粒向正极或负极（视胶粒荷负电或正电而定）移动的现象，称为电泳。同一胶粒在同一电场中的移动速度由ξ电位的大小而定，所以 电位也
实验四 腹水型单抗的制备及纯化
实验四腹水型单抗的制备及纯化 迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首先BALB/c 小鼠。本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有细胞及其残渣、小颗粒物质、脂肪滴以及小鼠的各种杂蛋白，因此在很多情况下要提纯后才能使用。而腹水单抗的纯化是一个相当困难的工作，本实验将进行IgG1型腹水单抗的提纯方法。 材料： 1、成年BALB/c小鼠。 2、灭菌液体石蜡或福氏不完全佐剂；处于对数生长期的杂交瘤细胞；新鲜采集的腹水 （或冻存的腹水）。 3、饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，正辛酸，0.1M NaOH，1M NaOH，0.06M，pH4.0 NaAc-HAc缓冲液，0.01M，pH7.4 PBS，10×PBS（0.01M，pH7.4）。 方法： 一、腹水的制备 1．取12周龄的BALB/ c小鼠腹腔注射灭菌石蜡，0.5ml/只或腹腔注射福氏不完全佐剂， 0.2-0.3ml/只。 2．1周后（注射灭菌液体石蜡）或3天后（注射福氏不完全佐剂）腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠1—3×106/0.3ml。 3．间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水。将腹水离心（2000rpm离心5min），吸去最上层的脂肪组织，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，将上清加入50﹪甘油冻存于－20℃冰箱，留下一小部分测定效价。 二、辛酸—硫酸铵法纯化腹水中的单抗 1．取3ml腹水，2500r/min离心弃杂质，加入0.06M，pH4.0 NaAc-HAc缓冲液3ml，调pH 至4.8（用0.1M NaOH调）； 2．加入99ul正辛酸（33ul/ml腹水），室温搅拌≥30min，4℃搅拌≥60min，逐滴加完，4℃澄清2h（20min）； 3．取出15000r/min离心30min（10min）（4℃），去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白），上清加入1/10体积的10×PBS（0.01M，pH7.4），用1M NaOH调pH至7.2； 4．上清滴加等量饱和硫酸铵（pH7.2-7.4）溶液，使硫酸铵的饱和度为50％，继续搅拌10-30min，静置30min； 5．10000rpm（4℃）离心30min（10min），弃上清，将沉淀溶于1.2ml，0.01M，pH7.4 PBS 中， 6．0.01M，pH7.4 PBS透析过夜（4℃），其间换液3次，收集透析袋内液体，—20℃保存备用。少数测效价。