基因工程与克隆技术

基因工程与克隆技术

考点1 基因工程

1.(2015·浙江10月选考,节选)从扩大培养的大肠杆菌中提取含有目的基因的DNA,用 分别切割含目的

基因的DNA 和农杆菌的Ti 质粒,然后用DNA 连接酶连接,形成重组DNA 并导入农杆菌。

2.(2016·浙江4月选考,节选)兔肝细胞中的基因E 编码代谢甲醛的酶,拟利用基因工程技术将基因E 转入矮牵牛中,以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力。请回答:

(1)从兔肝细胞中提取mRNA,在 酶的作用下形成互补DNA,然后以此DNA 为模板扩增得到基因E 。在相关酶的作用下,将基因E 与Ti 质粒连接在一起,形成 ,再导入用氯化钙处理的 ,侵染矮牵牛叶片,将被侵染的叶片除菌后进行培养,最终得到转基因矮牵牛。其中培养过程正确的是 (A.叶片在含合适浓度生长素的培养基上分化形成愈伤组织 B.愈伤组织在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽 C.再生的芽在细胞分裂素含量高的培养基

上生根 D.愈伤组织在含合适浓度植物生长调节剂的培养基上脱分化形成再生植株)。

(2)取转基因矮牵牛叶片,放入含MS 液体培养基和适量浓度甲醛且密封的试管中。将试管置于 上,进行液体悬浮培

养。一段时间后测定培养基中甲醛的含量,以判断基因E 是否在转基因矮牵牛中正常表达。培养过程中液体培养基的作用:

一是提供营养;二是 ,从而使叶片保持正常的形态。

3.(2018·浙江4月选考,节选)回答与基因工程和植物克隆有关的问题:

(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ酶切,在切口处形成 。选取含抗虫基因的DNA 片段与切割后的pBI121用DNA 连接酶连接,在两个片段相邻处形成 ,获得重组质粒。

(2)已知用CaCl 2处理细菌,会改变其某些生理状态。取CaCl 2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成 实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是 , 从而表达卡那霉素抗性基因,并大量增殖。

【考点梳理】

1.基因工程的工具

2.基因工程的原理与操作步骤

(1)基因工程的原理

①基本原理:让人们感兴趣的基因(即目的基因)在宿主细胞中稳

定和高效地表达。

②基本要素:多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等。

(2)基因工程的基本操作步骤

3.形成重组DNA 分子

(1)单酶切法（如右图）：将同一种限制性核酸内切酶切割的质粒与目的基因片

段混合,加入DNA 连接酶,两两连接的产物(重组DNA 分子)有以下3种:目的基因与目的基因的连接物;质粒与质粒的连接物;目的基因与质粒的连接物。其中,只有目的基因与质粒的连接物才是真正需要的。

(2)双酶切法

双酶切法的优点主要在于防止质粒和目的基因自身环化以及保证目的基因单向插入质粒。

【自我诊断】

1.转入外源基因的动物称为转基因动物。( √)

2.从猪血液中提取的胰岛素属于基因工程药物。( ×)

3.限制性核酸内切酶作用于DNA分子的氢键,使DNA双链断开。( ×)

4.限制性核酸内切酶能够特异性识别并切割烟草花叶病毒遗传物质。( ×)

5.基因工程的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶及质粒。( ×)

6.质粒中的抗生素合成基因等标记基因通常会用于含有目的基因受体细胞的筛选。( ×)

7.质粒是一种直链DNA分子,可作为基因工程中的载体。( ×)

8.DNA聚合酶和限制性核酸内切酶是基因工程中常用的两种工具酶。( ×)

9.土壤农杆菌转化法是将目的基因与农杆菌质粒重组,然后将重组DNA分子导入植物受体细胞。( ×)

10.基因工程的原理是让人们感兴趣的基因在宿主细胞中稳定的保存和表达。( √)

11.多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞是进行基因工程操作的基本要素。( √)

12.目的基因序列未知,可采用PCR扩增获得目的基因。( ×)

13.构建基因文库时需包含目的基因。( √)

14.将目的基因导入动物细胞和植物细胞最常用的方法分别是农杆菌转化法和显微注射法。( ×)

15.利用氯化钙处理农杆菌细胞,可以增加其细胞膜的通透性。( ×)

16.在宿主细胞中检测到目的基因存在,说明转基因技术操作成功。( ×)

17.限制性核酸内切酶和DNA连接酶为基因的分离和重组提供了必要手段。( √)

18.基因治疗是向目的细胞中导入正常基因以替换细胞中不正常的基因。( ×)

考向1 基因工程的工具

【例1】下列关于基因工程的有关叙述,正确的是( )

A.基因工程常用的工具酶是限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体

B.一种限制性核酸内切酶能识别几种特定的核苷酸序列,并在特定的切点上切割DNA

C.质粒是一种常用载体,是拟核外能自主复制的很小的环状DNA分子

D.DNA连接酶可代替DNA聚合酶用于DNA的复制

考向2 基因工程中形成重组DNA分子的形成方式

【例2】如表所示列出了几种限制性核酸内切酶识别序列及其切割位点,图1、图2中箭头表示相关限制性核酸内切酶的酶切位点。下列说法错误的是( )

A.

B.用图1中的质粒和图2中的目的基因构建重组质粒,不能使用SmaⅠ切割

C.图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状,不能使用EcoRⅠ

D.为了获取重组质粒,最好用BamHⅠ和HindⅢ同时切割质粒和外源DNA

考向3 基因工程的应用

【例3】 (2018·浙江全能生9月联考)重瓣紫堇具有较高观赏和药用价值,但自然状态下几乎高度不育。为解决重瓣紫堇的繁殖难题,科学家利用另一种植物的可育基因M,完成了对重瓣紫堇的改造,流程如图:(图中箭头指的是不同限制性核酸内切酶识别的位点)

请回答:

(1)在本例中,应选用的限制性核酸内切酶是,以避免质粒自身环化、错向连接等问题。连接目的基因和质粒时,关键需要催化键的形成。

(2)导入受体细胞时,应先用CaCl2处理,使其,从而有利于重组质粒的导入。

(3)利用紫堇根尖细胞培养成完整植株,依据的原理是

,理论上, (填“能”或“不能”)用紫堇的叶肉细胞代替根尖细胞完成上述改造工作。

(4)若图中所得的转基因紫堇植株自交一代,子代中能稳定遗传的个体所占的比例为。

解析:(1)根据质粒和目的基因所在DNA均存在三个限制性核酸内切酶切位点,且BalⅠ酶切位点处于目的基因M的中间,不适宜选用,因此应该选择HindⅢ和XhoⅠ进行酶切,且符合题中“避免质粒自身环化、错向连接”等问题;目的基因与质粒的连接需要DNA连接酶,具体催化的化学键是磷酸二酯键。(2)本题采用的是农杆菌转化法,其中重组质粒首先导入的受体细胞为农杆菌,再借助农杆菌侵染植物细胞的特性,将农杆菌细胞内的目的基因转移至最终的植物细胞中,因此CaCl2处理的对象是农杆菌,其具体机理是使得细菌处于感受态。(3)植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性,由于叶肉细胞同样具有本物种生长、发育、繁殖的全部遗传信息,所以也可作为受体细胞进行培养。(4)该转基因植物可写作“MO”型,在自交时,相当于杂合体,会导致后代性状分离,具体为MM∶MO∶OO=1/4∶1/2∶1/4,因此可稳定遗传的植株基因型为MM,占1/4。

答案:(1)HindⅢ和XhoⅠ磷酸二酯

(2)农杆菌处于感受态

(3)植物细胞的全能性能

基因工程中分子或个体水平的检测方法

具有重要的医用价值。如图是以基因工程技术获取重组

(1)如果HSA基因序列未知,可以采用的方法获取该目的基因,为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存,通常要先构建后才能导入宿主细胞。

(2)方框中的“?”一般选用的生物是,为了提高Ⅱ过程的导入成功率,通常用处理大肠杆菌。

(3)人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,所以,选择(填“Ⅰ”或“Ⅱ”)途径获取rHSA更有优势。

(4)为了鉴定宿主细胞中是否产生rHSA,可以用方法来进行检验。

A.检验HSA基因是否导入

B.检验细胞中是否产生相应的mRNA

C.抗原—抗体杂交

D.检测是否有标记基因

解析:(1)获取目的基因的方法有:从基因文库中获取、采用PCR技术扩增(适用于目的基因的核苷酸序列已知的情况下)、人工化学合成(适用于目的基因较小且序列已知的情况下)。因此如果HSA基因序列未知,可以采用从基因文库中提取的方法获取该目的基因;为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存,通常要先构建基因表达载体(重组DNA)后才能导入宿主细胞。

(2)将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法,因此方框中的“?”一般选用的生物是农杆菌;将目的基因导入微生物细胞时常用感受态细胞法,即用氯化钙处理微生物细胞,使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态。

(3)由于大肠杆菌是原核生物,其细胞中不含内质网和高尔基体,而人体合成的初始HSA多肽,需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性,所以,选择Ⅰ途径获取rHSA更有优势。

(4)检测目的基因是否表达形成蛋白质可以采用抗原-抗体杂交法。

答案:(1)从基因文库中提取重组DNA分子(2)农杆菌氯化钙(3)Ⅰ(4)C

考点2 克隆技术

1.(2018·浙江4月选考,节选)取田间不同品种水稻的幼胚,先进行,然后接种到培养基中培养,幼胚发生形成愈伤组织,并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织,再培养愈伤组织,以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有:培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比以及

(答两点即可)。

解析:组织培养时对幼胚先进行消毒处理,以免污染;幼胚经脱分化形成愈伤组织;影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素还有水稻的基因型、愈伤组织继代的次数等。

答案:消毒脱分化水稻的基因型、愈伤组织继代的次数

2.(2017·浙江11月选考,节选)(1)利用植物愈伤组织获得再生植株主要有两条途径:一是由愈伤组织的细胞先分化产生芽和根后再形成一个完整植株的途径。二是由愈伤组织的细胞产生胚状体后再萌发形成完整植株的胚胎发生途径。另外也可不通过愈伤组织阶段而直接采用带腋芽的茎段培养成丛状苗,再诱导生根获得再生植株,其原因是腋芽中存在。

(2)利用植物克隆培育新品种,一方面可利用带有目的基因的侵染植株,若将目的基因通过的方法导入植物细胞、组织或器官获得转基因植株。另一方面利用异源植物的进行融合产生杂种植株,或利用异源植物在试管内进行,对其产生的胚进行培养产生杂种植株。

(3)下列属于植物克隆和动物克隆共有的培养方法是。

A.悬浮培养、器官培养

B.贴壁培养、传代培养

C.器官培养、愈伤组织培养

D.原生质体培养、传代培养

解析:(1)利用愈伤组织获得再生植株,可以将愈伤组织通过器官发生途径分化成根和芽等分生组织后,获得完整植株,也可以由愈伤组织的细胞产生胚状体后再形成完整的植株。若不采用愈伤组织获得植株,还可利用茎段培养成丛状苗,然后诱导其生根,进而获得再生植株,该方法之所以采用腋芽等幼嫩组织进行培养,主要原因是腋芽等幼嫩组织中存在分生组织,能够完成器官分化和重建。(2)利用植物克隆培育新品种,可以利用带有目的基因的农杆菌侵染植株,或将目的基因通过显微注射导入植物细胞,进而获得转基因植株。也可利用异源植物的原生质体进行原生质体融合产生杂种植株,或利用异源植物进行试管内受精,将获得的未分化的胚进行培养进而获得杂种植株。(3)植物克隆和动物克隆时,都可进行液体悬浮培养,都存在组织和器官培养,贴壁生长是动物细胞培养的特点,愈伤组织和原生质体培养是植物克隆所特有的。

答案:(1)器官发生分生组织

(2)农杆菌显微注射原生质体受精

(3)A

3.(2016·浙江10月选考,节选)某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究。请回答:

(1)原生质体的分离:在无菌条件下,取烟草无菌苗的叶片,放入含有0.5 mol/L甘露醇(维持较高渗透压)的

混合液处理,经过离心纯化后获得原生质体。

(2)原生质体的培养:将原生质体进行培养,重新长出细胞壁,形成胚性细胞。此时,应该培养基中甘露醇的浓度,以利于胚性细胞继续培养形成细胞团,然后经两条途径形成再生植株。途径一:细胞团经球形胚、和胚状体,最后发育成植株。途径二:细胞团增殖为愈伤组织,然后在发芽培养基上诱导出芽,切割芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中含量相对较高的激素是,

胚性细胞的主要特点是(A.液泡小、细胞核小 B.液泡大、细胞核大 C.液泡大、细胞核小 D.液泡小、细胞核大)。

(3)为了对烟草的某些性状进行改良,分离得到两种烟草的原生质体后,通过方法将它们的遗传物质组合在一起,经培养获得具有新性状的再生植株。提取再生植株的DNA,采用扩增相关基因,来鉴定遗传物质是否成功重组。

解析:(1)用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得原生质体。(2)降低培养基中甘露醇的浓度,利于细胞团的形成。再生植株的形成途径之一是经球形胚、心形胚和胚状体,后发育成植株;发芽培养基中细胞分裂素浓度大于生长素浓度。胚性细胞液泡大,细胞核大。(3)两种烟草的原生质体通过原生质体融合将其遗传物质组合在一起。扩增DNA的技术是PCR。

答案:(1)纤维素酶和果胶酶

(2)降低心形胚细胞分裂素 B

(3)原生质体融合PCR

1.植物细胞全能性与表达能力下降原因分析

(1)概念:植物体的每个生活细胞都具有遗传上的全能性,因而都具有发育成完整植株的潜能。

(2)植物细胞全能性的原因:生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质,都有发育成为完整个体所必需的全部基因。

(3)植物细胞全能性表达的条件

①离体、无菌操作。

②一定的营养物质,如水、无机盐、蔗糖、维生素等。

③添加植物激素,如细胞分裂素和生长素。

④一定的外界环境条件(温度、酸碱度、光照的控制等)。

(4)植物细胞全能性的体现

①植物体的几乎所有组织的细胞通过诱导都可再生新植株。植物细胞的全能性比动物细胞更容易体现。

②植物组织培养中细胞全能性下降的原因

a.有可能是遗传物质变化:染色体畸变、细胞核变异、非整倍体产

生等。

b.生长发育条件变化:激素平衡被打破;细胞对外源生长物质的敏感性改变。

c.随时间推移,由于其他各种原因产生缺乏成胚性的细胞系。

2.植物组织培养的途径

(1)理论基础:植物细胞的全能性。

(2)植物组织培养途径

配制培养基:配制含有适当营养物质和植物生长调节剂的半固体培

养基

↓

切取消毒的组织块

↓

获得愈伤组织:由相对没有分化的活的薄壁细胞团组成的新生组织

①器官发生途径

愈伤组织芽和根→完整植株

②胚胎发生途径

愈伤组织胚性细胞(单细胞)→细胞团→球形胚→心形胚→胚状体→完整植株

(3)植物组织培养的意义

①可以在实验室、试管等器皿中进行植物受精过程和自受精卵进行的植物胚胎发育过程,以及调节控制这些过程的环境因素、遗传基础和分子及生理生化机理研究。

②可以进行遗传工程的操作,完成与植物生长发育有关的重要基因或影响因素的研究。

③可以方便地通过实验手段培育植物新品种。

3.原生质体培养与植物细胞工程

(1)原生质体的获得方法:在0.5～0.6 mol/L的甘露醇溶液环境(较高渗透压)下用纤维素酶和果胶酶混合液处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞,除去细胞壁。

(2)植物细胞工程操作过程

外源遗传物质

(DNA)受体植物细胞

(包括原生质体受体)

转基因细胞或重组细胞新植株。

4.动物细胞和组织培养流程及相关名词

(1)动物细胞和组织培养流程

(2)动物细胞、组织培养过程中的相关名词

①原代培养:从机体取出后立即进行的细胞、组织培养的过程。

②传代培养:将原代培养细胞分成若干份,接种到若干份培养基中,使其继续生长、增殖。

③细胞系:指可连续传代的细胞。可分为连续细胞系(恶性细胞系,具有异体致瘤性;不死性细胞系,保留接触抑制现象,不致癌)和有限细胞系。

④细胞株:通过一定的选择或纯化方法,从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞。可分为连续细胞株和有限细胞株。

⑤克隆培养法:把一个单细胞从群体中分离出来单独培养,使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。基本要求是必须肯定所建成的克隆来源于单个细胞。

5.动物的细胞融合技术及其应用

(1)细胞融合

多核体杂交细胞多个杂交细胞

聚乙二醇(PEG)、灭活的仙台病毒等

(2)单克隆抗体的制备流程

①优点:特异性强、灵敏度高,可大量制备。

②用途:用于治疗疾病;作为特异探针,研究相应抗原蛋白的结构、细胞学分布及其功能。

6.细胞核移植和动物的克隆繁殖

(1)核移植:利用一个细胞的细胞核来取代另一细胞中的细胞核,形成一个重建的“合子”。

(2)动物的克隆繁殖

(3)动物难以克隆的根本原因

在动物的个体发育过程中,分化的结果使得细胞在形态和功能上高度特化,这是由于细胞内伴随着它们在发育过程中时间、空间的变化,基因表达的调控使得细胞中合成了专一的蛋白质。

7.

1.植物组织培养的理论基础是植物细胞具有全能性。( √ )

2.通过液体悬浮培养,可将愈伤组织分散成单细胞。( √ )

3.动物细胞培养过程中,用胰蛋白酶处理可使动物细胞分散开来。( √ )

4.胚性细胞具有细胞核大,细胞质丰富,液泡大的特点。( × )

5.去掉植物细胞壁常用的酶是纤维素酶与果胶酶。( √ )

6.恶性细胞系具有异体致瘤性,不死性细胞系保留接触抑制。( √ )

7.植物组织培养过程中,器官发生和形态重建主要是通过平衡植物激素的种类进行调控。( × )

8.制备原生质体时,采用低渗甘露醇,防止原生质体失水过多失去生物活性。( × )

9.不同种类植物或同种植物的不同基因型个体,其细胞全能性的表达程度大不相同。( √ )

10.植物组织培养过程中,培养物的胚胎发生和器官形成能力下降的可能原因有染色体畸变、细胞核变异或非整倍体产生等,但其结果是可逆的。(

× )

11.克隆培养必须保证分离出来的细胞是一种类型的多个细胞,而不是多种类型细胞。( × )

12.动物细胞培养时,

通入CO 2的目的是刺激细胞呼吸。( × )

13.原生质体培养需要先对原生质体的活力进行检测,可以采用质壁分离的方法。( × )

14.诱导动物细胞融合常用的化学方法有聚乙二醇(PEG)或灭活的仙台病毒作为诱导剂。( × )

15.获得植物次生代谢产物(如某些中药:紫草素等),通过大量培养特定细胞系即可(获得愈伤组织即可),无需获得植株。( √ )

16.单细胞发育成胚的过程为单细胞→细胞团→心形胚→球形胚→胚状体。( × )

17.有限细胞系大多是发生转化了的细胞系,具有异倍体核型。( × )

18.理论上各种细胞都可被克隆,但是单细胞通常不如群体细胞;原代细胞、有限细胞系通常不如无限细胞系、转化或肿瘤细胞。( √ )

19.在单克隆抗体的制备中,取小鼠的B 淋巴细胞之前,一定要给小鼠注射相应的抗原(或相应的疫苗)。( √ )

考向1 植物克隆

【例1】 如图中的①②③代表通过植物组织培养技术培育新植株的三条途径,请回答:

(1)外植体c 来自同种植株,植株C 中的细胞,全能性表达程度 (填“相同”或“可能不同”)。

(2)途径②和③需要用到 和 (填培养基的物理性质)两种培养基。将含B1的试管放在摇床上,通过 培养可以分散成单细胞。

(3)外植体c 脱去细胞壁过程中需要加入适宜浓度的 (A.甘露醇 B.盐酸 C.蒸馏水 D.氯化钠)以保持一定的渗透压。原生质体培养成功标志着 技术又向前迈进了一步。

(4)通过大量培养特定细胞系,可以实现能产生重要 (如某些中药)的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。

解析:(1)外植体a 、b 、c 来自同种植株,由于不同细胞的分化程度不同,因此植株C 中的细胞全能性表达程度可能不同。

(2)途径②中用到摇床,因此需要用液体培养基,而途径③需要用到固体(或半固体)培养基。将含B1的试管放在摇床上,通过液体悬浮培养可以分散成单细胞。

(3)外植体c 脱去细胞壁过程中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压。原生质体培养成功标志着植物细胞工程技术又向前迈进了一步。

(4)通过大量培养特定细胞系,可以实现能产生重要次生代谢产物(如某些中药)的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。

植物克隆涉及的技术比较利用全能性诱导为完整植株,克服远缘杂交不亲和的障碍,定向改造植物的性状利用全能性诱导为完整植株,克服远缘杂交不亲和的障碍

(1)将外源遗传物质与受体植物细胞(包括原生质体受体)遗传物质重新组合,除了转基因技术外,还有 等方法,这些方法解决了传统育种方法存在的 的缺陷。植物原生质体的获取可以在较高渗透压环境下,用 酶处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞的细胞壁。

(2)如果构建重组细胞的目的是为了获取重要的次生代谢产物(如某些中药),可以通过大量培养特定 来达成目

的。

(3)如果农杆菌侵染对象为某植物叶片,将被侵染的叶片除菌后进行培养,最终得到转基因植物。下列叙述中正确的

是 。

A.愈伤组织在合适条件下经脱分化形成再生植株

B.再生的芽在细胞分裂素含量较高的培养基上生根

C.叶片在含合适浓度生长素的培养基上经再分化形成愈伤组织

D.愈伤组织在细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽

解析:(1)将外源遗传物质与受体植物细胞(包括原生质体受体)遗传物质重新组合,除了转基因技术外,还有细胞融合或显微注射等方法,这些方法解决了传统育种方法存在的远缘亲本难以杂交(或生殖隔离)的缺陷。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶,根据酶的专一性原理去除植物细胞壁应该用纤维素酶和果胶酶。(2)如果构建重组细胞的目的是为了获取重要的次生代谢产物(如某些中药),可以通过大量培养特定细胞系来达成目的。(3)愈伤组织在合适条件下经再分化形成再生植株;再生的芽在细胞分裂素含量较高的培养基上发芽,在生长素含量较高的培养基上生根;叶片在含合适浓度生长素的培养基上经脱分化形成愈伤组织;愈伤组织在细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽。

答案:(1)细胞融合或显微注射 远缘亲本难以杂交(或生殖隔离) 纤维素酶和果胶 (2)细胞系 (3)D

考向2 动物细胞和组织培养

【例2】 如图为动物细胞培养过程中细胞增殖情况的变化曲线(图中B,E 两点表示经筛选、分装后继续培养),请据图回答下列问题:

(1)OB段的培养称为培养,AB段可能发生了现象,使增殖速率减缓,用酶可使组织细胞分散开来,分装到多个卡氏瓶中进行培养。

(2)B点的细胞群体称为。B点时筛选出一个细胞,通过单独培养使之繁衍成一个新的细胞群体,该细胞群体称为。

(3)E点后的细胞大多数具有核型,从而可连续传代。

解析:(1)人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养,分瓶后的培养称为传代培养;当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖,即会发生接触抑制现象,用胰蛋白酶可使组织细胞分散开来。

(2)细胞系指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群,称细胞株。

(3)已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系,称连续细胞系或无限细胞系,无限细胞系大多已发生异倍化,具异倍体核型。

答案:(1)原代接触抑制胰蛋白传代

(2)细胞系克隆培养法细胞株

(3)异倍体

考向3 动物的细胞融合技术及其应用

【例3】 (2018·绍兴9月模拟)回答与动物克隆有关的问题:

(1)广义的动物组织培养包括

和器官培养,器官培养是指、器官的一部分或整个器官在体外和人工控制的条件下得以保存、生长。

(2)细胞融合是细胞工程的主要技术手段之一,其中电融合技术的原理是在低压交流电场

中;而细胞杂交是的细胞间的融合。

(3)单克隆抗体的制备中,往往在经过免疫的动物的(器官)中获得能产生抗体的B细胞,经融合和筛选再培养,其培养的基本要求是

。

(4)若想通过基因工程制备大量的单一抗体,下列方法可行的是( )

A.将抗体基因直接导入小鼠骨髓瘤细胞

B.将含有抗体基因的重组DNA分子导入小鼠骨髓瘤细胞

C.将含有抗体基因的重组DNA分子导入人的浆细胞

D.将含有调控抗体产生基因的重组DNA分子导入人的浆细胞

解析:(1)广义的动物组织培养包括细胞培养、组织培养和器官培养,器官培养是指器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外和人工控制的条件下得以保存和生长。(2)细胞融合可以在基因型相同也可以在基因型不同的细胞间进行,而细胞杂交是基因型不同的细胞间的融合。电融合技术的原理是在低压交流电场中击穿质膜脂双层,导致细胞质融通。(3)单克隆抗体的制备中,从经过免疫的动物的脾脏中获得能产生抗体的B细胞,与无限传代的骨髓瘤细胞融合,经过筛选、克隆培养,获得来自单一细胞的既能产生特异抗体、又能无限增殖的杂交瘤细胞克隆。(4)若要通过基因工程制备大量的单一抗体,可将含有抗体基因的重组DNA分子导入小鼠骨髓瘤细胞中。

答案:(1)细胞培养、组织培养器官的原基

(2)击穿质膜脂双层,导致细胞质融通不同基因型

(3)脾脏获得既能产生特定抗体又能无限增殖的单个细胞(4)B

考向4 细胞核移植和动物的克隆繁殖

【例4】 (2018·嘉兴9月基础测试)回答与动物克隆有关的问题:

(1)克隆培养法的基本要求是所建立的克隆必须来源于,以下不属于提高克隆成功率的是(A.添加血清

B.持续通入氧气

C.使用CO2培养箱

D.胰岛素刺激)。

(2)克隆绵羊的诞生证明的体细胞还能恢复到类似

时期的功能,同时在胚胎和个体发育中具有调控细胞核发育的作用。

(3)人—鼠杂交细胞通常会丢失人的染色体,因此, (填“能”或“不能”)利用该细胞杂交技术对鼠的基因进行定位。通过杂交瘤技术制备的单抗可以作为与抗原发生反应,用以研究抗原蛋白的结构、细胞学分布及其功能。

解析:(1)克隆培养法的最基本要求是保证所建立的克隆来自于单个细胞。提高细胞克隆形成率的措施有:选择适宜的培养基、添加血清、滋养细胞支持生长、激素(胰岛素)刺激、使用二氧化碳培养箱等。(2)克隆绵羊的诞生证明高度分化的体细胞还能恢复到类似受精卵时期的功能,同时在胚胎和个体发育中细胞质具有调控细胞核发育的作用。(3)人—鼠杂交细胞通常会丢失人的染色体,因此,可以利用该技术对人的基因进行定位。通过杂交瘤技术制备的单抗可以作为特异性探针与抗原发生反应,用于研究抗原蛋白的结构、细胞学分布及其

功能。

答案:(1)单个细胞 B (2)高度分化受精卵细胞质(3)不能特异性探针

【热点变式】 (2018·浙江质检)回答与基因工程和动物克隆有关的问题:

FtsZ是病原菌中引导细胞分裂的蛋白质。靶向FtsZ蛋白的抑制剂可有效抑制细菌的分裂。

(1)持续用抗生素杀灭病原菌,易产生,但使用FtsZ蛋白抑制剂不易产生,原因是FtsZ蛋

白

。

(2)为减少家畜养殖过程中抗生素的使用,科学家合成了可抑制FtsZ蛋白合成的sula蛋白基因,并通过下列方法培育出转sula基因奶牛。

①根据sula蛋白中氨基酸序列化学合成了多个目的基因,则这些目的基因的碱基序列及控制的性状是(A.一种、相同性状 B.一种、不同性状 C.多种、相同性状 D.多种、不同性状)。

②未受精的卵母细胞去除细胞核时常用的物理方法是

。核移植时需借助精密的显微操作仪和高效率的法,得到重组细胞。

③重组细胞培养至胚胎过程中, (填“需要”或“不需要”)在培养基中添加饲养层。为提高胚胎的利用率,可对所得胚胎进行。

解析:(1)持续使用抗生素,会因选择作用,造成细菌产生抗药性。FtsZ是细菌正常分离合成的一类蛋白质,使用该蛋白质抑制剂不会造成细菌抗药性。(2)①由于密码子具有简并性,因此通过氨基酸序列逆推DNA序列,可得到多种基因序列,但是各种基因表达的蛋白质序列相同。②克隆操作时,未受精卵母细胞去除细胞核常用的方法是紫外线照射破坏细胞核,进行核移植时需要借助精密显微操作仪和高效率的细胞融合法,获得重组细胞。③饲养层抑制细胞分化,胚胎培养过程中,不需要加入饲养层。为提高胚胎的利用率,可对胚胎进行胚胎分割。

答案:(1)耐药性是细菌正常分裂必须合成的蛋白质

(2)①C ②紫外线(照射)处理细胞融合(或电脉冲细胞融合) ③不需要胚胎分割

考向5 植物克隆与动物克隆综合分析

【例5】 (2018·浙江9月联考)回答与植物克隆和动物克隆有关的问题:

(1)植物组织培养:将经过的植物组织块,放在半固体培养基上培养,获得一团的薄壁细胞组成的愈伤组织,再以适当配比的营养物质和生长调节剂诱导再生出新植株。培养过程中不同植物细胞全能性表达程度有很大的不同,是因为不同植物之间存在

。

(2)动物细胞培养:首先用胰酶消化动物组织中的和细胞外的其他成分,获得,制成细胞悬浮液;然后在人工控制的条件下培养,由于细胞之间的相互依存,培养的细胞也会像在体内一样呈现一定的。

(3)下列关于植物克隆和动物克隆的叙述,正确的是( )

A.离体的植物组织或器官都必须通过脱分化才能形成愈伤组织

B.植物组织培养过程中都会形成细胞质丰富、液泡小而细胞核大的胚性细胞

C.在动物细胞培养时,培养保持接触抑制的细胞在卡氏瓶上可形成多层细胞

D.同属于一个细胞系的细胞群,由于来自一个共同的祖细胞,所以称为纯系

解析:(1)进行植物组织培养,需要先对待培养的组织块进行消毒处理,以杀灭病菌。进行植物组织培养,经脱分化会得到一团相对未分化的愈伤组织,配以适当的植物生长调节剂,可诱导产生新植株。植物组培时,由于不同植株的遗传差异,因此不同植物细胞全能性表达程度不同。(2)进行动物细胞培养,首先用胰蛋白酶消化动物组织中的胶原纤维和一些细胞外成分,获得单个细胞,制成细胞悬液。这些单个的细胞也会像在体内一样呈现一定的组织特性。(3)离体的植物细胞经脱分化后才可形成相对未分化的愈伤组织;愈伤组织细胞经液体悬浮培养才会形成胚性细胞;动物细胞具有接触抑制,不能形成多层细胞;纯系是来自一个细胞分裂的后代,细胞系中具有不同类型的细胞。

答案:(1)消毒相对没有分化遗传性的差异 (2)胶原纤维单个细胞组织特性(3)A