微生物专业的开题报告

南昌大学

研究生学位论文开题报告

高活性发酵豆粕生产菌株筛选及其最佳发

酵条件的研究

报告人: 刘剑飞

指导老师: 熊涛(教授)

专业名称: 南昌大学生命科学院微生物系

申请学位类别: 硕士

2010年1月

目录

一、前言 ............................................................................................... 错误！未定义书签。（一）豆粕发酵研究现状..................................................................... 错误！未定义书签。

1.1 饲料中大豆小肽的作用.......................................................... 错误！未定义书签。

1.2小肽的生产方法....................................................................... 错误！未定义书签。

1.3生物发酵法制备大豆多肽的理论创新................................... 错误！未定义书签。（二）研究价值和意义......................................................................... 错误！未定义书签。二．研究方案 ....................................................................................... 错误！未定义书签。（一）研究内容..................................................................................... 错误！未定义书签。（二）仪器设备..................................................................................... 错误！未定义书签。（三）工艺技术路线............................................................................. 错误！未定义书签。（四）实验材料及方法......................................................................... 错误！未定义书签。

1.实验材料 (8)

1.1培养基....................................................................................... 错误！未定义书签。

1.2分离菌株菌源........................................................................... 错误！未定义书签。2试验方法. (9)

2.1单菌种发酵的菌种选取........................................................... 错误！未定义书签。

2.2进行豆粕发酵试验................................................................... 错误！未定义书签。

2.2.1试验材料 (10)

2.2.2试验设计 (11)

2.2.3发酵液的制备 (11)

2.2.4发酵种子液的生长曲线制备 (11)

2.2.5豆粕的发酵方法 (11)

2.2.6pH的测定 (13)

2.2.7干物质的测定 (13)

2.2.8高活性单菌发酵豆粕蛋白的测定 (14)

2.2.9 高活性菌种的真空冷冻干燥保藏 (14)

2.2.10 多菌种混合发酵豆粕 (16)

2.2.11 发酵豆粕的动物食用试验 (17)

三、研究的可行性及可能遇到的困难 ............................................... 错误！未定义书签。（一）研究的可行性............................................................................. 错误！未定义书签。（二）可能遇到的困难......................................................................... 错误！未定义书签。

四、预期成果 ....................................................................................... 错误！未定义书签。

五、经费预算 ....................................................................................... 错误！未定义书签。

六、研究计划及时间安排 ................................................................... 错误！未定义书签。

七、参考文献: ...................................................................................... 错误！未定义书签。

一、前言

豆粕是指以大豆为原料用预压浸提或浸提法提取油脂后，经适当热处理与干燥所得的产品[1]。其蛋白质含量高达43%～45%，赖氨酸含量达 2.5%～2.8%，氨基酸比例平衡[2]。豆粕是目前饲料工业、养殖业使用量很大的一种优质蛋白饲料。与棉粕、菜粕、花生粕相比，豆粕具有氨基酸平衡（赖氨酸含量高、接近理想氨基酸模式）、消化率高、适口性好等特点；与动物源性蛋白饲料（如鱼粉、肉骨粉、血浆蛋白粉等）相比，豆粕具有货源充足、不易被病原菌污染或氧化腐败，含毒害物质概率低、安全系数高等特点。例如在我国水产配合饲料中，鱼粉因其蛋白质含量高、氨基酸较平衡、不饱和脂肪酸含量丰富及其诱食性较好等优点，是动物配合饲料中不可缺少的蛋白质饲料。但由于鱼粉供需之间的矛盾日益加剧，使用豆粕等植物性蛋白质饲料部分或全部取代鱼粉是养殖业发展的必然趋势[3]。

（一）豆粕发酵研究现状

1.1 饲料中大豆小肽的作用

以往的观点认为,豆粕蛋白质在肠道中都被消化成氨基酸,然后通过肠壁被机体吸收,为使畜禽获得最佳生产性能,饲粮中只要提供各种必需氨基酸,就能达到目的。事实上,许多试验表明,饲粮中粗蛋白含量过低,即使添加足够的必需氨基酸也不能获得预期的效果。现代研究认为，蛋白质在消化道中的消化终产物的大部分往往是小肽而不是游离氨基酸(FAA)[4]。小肽能完整地通过肠黏膜细胞而进入动物体内循环[5]，它的吸收具有转运速度快、耗能低、载体不易饱和等优点，且各种肽之间转运无竞争性与抑制性[6]。为了达到最佳生产性能,日粮必须有一定数量的小肽(二、三肽)。肽是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物,小分子肽比等量游离氨基酸具有更高的活性和营养价值。大豆多肽(豆源肽)是以大豆浓缩蛋白为原料(饲料厂广泛使用的豆粕)经蛋白酶水解后产生的由2～10个氨基酸残基组成的低肽混合物,分子量为1 000左右。由于大豆多肽除了具有优于大豆蛋白的加工特性(保湿性、发泡性、非酸沉性等)与无豆腥味等特性外,还具有易消化、吸收快、抗原性低等许多独特的生理功能,因此,大豆多肽作为功能性饲料蛋

白质而受到广泛关注。

1.2小肽的生产方法

世界研究肽有100多年的历史。在过去的几十年中,世界科学家、专家研究、开发、生产小肽的主要方法是基因表达法和化学合成法。基因表达法是从动物,如从牛、猪胸腺和人的组织及血液中分离或提取合成,此类产品如胸腺肽、胸腺五肽、白细胞介素I、白细胞介素II、白细胞介素III、免疫球蛋白、人血清白蛋白、干扰素、脑活素、肿瘤细胞坏死因子、表皮生长因子,此法在过去的一定时期发挥了一定的作用,但此法获得肽成本高,副作用大;化学合成法就是用精细化工生产的氨基酸进行人工嫁接成单肽,此法同样成本高、成功率低,与现代绿色化学的要求有一定距离。酶法生产大豆多肽的方法有直接酶解法和生物发酵法。直接酶解法[7、8]由于使用高价格的酶而提高了大豆多肽的生产成本,因而限制了其在饲料行业中的应用。生物发酵法[9]则采用高科技现代生物发酵工程技术,通过发酵过程中微生物分泌的酶将大豆粕中的部分蛋白酶解为大豆多肽。生物发酵法由于把蛋白酶的发酵生产和大豆多肽的酶解生产有机地结合在一起,降低了大豆多肽的生产成本,应用前景较好。

1.3生物发酵法制备大豆多肽的理论创新

生物发酵法制备大豆多肽的理论创新在于:与基因表达法和化学合成法的理论有所不同是在对所含肽的辨认、确定及生理功能的研究上。过去的研究认为,一定要确认某个肽是由哪几个氨基酸组成,对多肽进行辨认、分离等等。生物发酵法制备大豆多肽的理论[10、11、12]则认为:大豆蛋白质经微生物分泌的酶降解后,不仅保留了原大豆蛋白质的原有成分、营养和功能,而且具有原大豆蛋白或其组成氨基酸所没有的重要的生理机能和独特的生物学功能。比如大豆具有阻止胆固醇吸收的功能,而用生物酶对大豆蛋白质进行降解获得的大豆多肽就有比原大豆蛋白质更强的阻止胆固醇吸收的功能,不仅如此,还派生出降压,促进能量代谢,抗氧化功能等。重要的是降解成多肽后,更容易被动物消化吸收,吸收的速度、吸收的方式与吸收率比原大豆蛋白质更好。如果一定要从大豆多肽中找出到底是哪几个肽在降低胆固醇中起作用,先把它辨认,搞清楚后再分离出来,这种降低胆固醇

的大豆多肽不知需要多长时间才能研究出来,也不知什么时候才能走向市场,也许分离出来后,没有降低胆固醇的功能,因为降解本身有整体协同功能及作用,就象中药将其“有效成分”提出后,反而没有原来的功能。因此生物发酵法制备大豆多肽具有很强理论创新性。

（二）研究价值和意义

我国大豆年产量约2000万吨[13]，占世界总产量的9%，居第三位,但我国大豆种植的高产出低收益与美日等发达国家的高产出高收益甚至低产出高收益形成了鲜明的对比，因此开发利用大豆蛋白质资源己成为大势所趋。加强对大豆肽的研究与开发，并使之工业化，对有效利用我国的植物蛋白资源，具有重大的社会意义和良好的经济效益。目前我国对大豆多肽的生产研究较多，但未形成大规模工业化生产。其原因在于生产成本居高不下，使得产品因高成本低附加值而难于推向市场。常规的大豆肽生产是以大豆分离蛋白为原料，利用商业蛋白酶制剂水解大豆蛋白制得大豆肽，但酶制剂用量大且价格昂贵，这是大幅提高生产成本的主要原因。如果能筛选到一些能直接利用大豆粕中的蛋白质产大豆肽的微生物菌株，通过合适的发酵工艺，就能以廉价的大豆饼粕为原料，以筛得菌株为发酵剂，大批量低成本的生产制备大豆肽。微生物发酵法生产大豆肽的优势主要有:首先，直接利用制油工业的废料大豆饼为生产原料，不仅成本低，而且变废为宝，有利于环境保护。其次，以微生物取代纯酶制剂水解大豆蛋白制备多肽，可以节省大量昂贵的酶制剂。为克服目前我国在大豆多肽肽研究和产业化中的不足，本实验旨在建立一套生物菌株发酵法产酶水解豆粕生产大豆多肽的新工艺。

综上所述，本研究的完成和转化，实现了高活性发酵豆粕生产菌株筛选及其豆粕发酵小肽的高产率的系统化。为实现绿色无污染的豆粕发酵工业开辟了一条行之有效的科学之道！促进了我国发酵豆粕饲料的标准化、规模化生产，完善和建立豆粕发酵产品加工质量标准化体系、提高我国高活性发酵豆粕多肽制品在国际市场的竞争力。

二．研究方案

（一）研究内容

（1）分别从酱油厂的发酵液[14]，市场上销售的霉豆腐[15]中进行微生物菌种

定向选育研究。采用菌种诱变、驯化等技术方法，选育出具有优良生产发酵豆粕性状（如：分泌高活性蛋白酶、发酵豆粕饲料风味好等）及适应能力强的专用微生物菌种4株，形成自主知识产权；另有从云南大学生命科学学院转接一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis SHZ）[16]，从中国工业微生物菌种保中心购买一株米曲霉[17、18]；本实验室保藏植物乳酸杆菌[19、20]。

（2）对分离菌种纯化、鉴定、保藏；各实验用菌转接斜面扩大保藏；

（3）分别进行单菌株接入豆粕中进行发酵试验；各单菌株菌生产大豆多肽的发酵条件的优化研究。

（4）几种菌株混合菌种接入豆粕中进行发酵试验；混合菌种生产大豆多肽的发酵条件的优化研究

（5）建立起实验室的豆粕发酵所产多肽的科学检测方法。

（6）进行发酵产品的动物实验研究

（7）高活性发酵豆粕生产菌株的真空冷冻干燥保藏的冷冻活性研究

（二）仪器设备

电热恒温培养箱、高效离心机、真空冷冻干燥机、灭菌锅、恒温水浴锅、组织捣碎机、超净工作台、摇床、分析天平、电子天平、电热鼓风干燥箱、厌氧罐、（三）工艺技术路线

冷冻干燥制备成菌粉

↗↓↖

菌种筛选分离→保藏菌种→菌种活化←现有菌种

↓

制备菌株种子液

↓

豆粕粉碎配料→高压灭菌→冷却( 接菌) →发酵（优化发酵条件）→初步产物（取样进行营养含量的分析定量）→干燥→成品→动物食用生长

实验

本实验主要是在高活性发酵豆粕生产菌株筛选及其最佳发酵条件方面进行研究，并对所得到的纯种菌株进行冷冻干燥制备成菌粉进行活性保存研究。

（四）实验材料及方法

1 实验材料

1.1培养基

植物乳酸杆菌固体培养基（MRS）[21]：牛肉膏10g、酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖50g、琼脂15g、磷酸氢二钾2g、醋酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、硫酸镁0.2g、Tween-80 1g、无菌水1000ml、pH6.6、121℃、30min灭菌；

植物乳酸杆菌液体培养基（MRS）[21]：牛肉膏10g、酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖50g、磷酸氢二钾2g、醋酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、硫酸镁0.2g、Tween-80 1g、无菌水1000ml、pH6.6、121℃、30min灭菌；

枯草芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂固体培养基[22]：

牛肉膏 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、自来水 1000mL、pH 7.0～7.2 、121℃30min灭菌；

枯草芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂液体培养基[22]：

牛肉膏 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、、自来水 1000mL、pH 7.0～7.2 、121℃30min灭菌；

分离菌株选择性固体培养基（初筛）[22]：

硝酸钠2g、磷酸氢二钾 1g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g 、蔗糖30g、琼脂20g、干酪素5 g、蒸馏水1000mL、pH 7.0～7.2 、121℃30min灭菌;

分离菌株选择性固体培养基（初筛）[22]：

马铃薯200、蔗糖20、琼脂18、水1000ml、干酪素5 g 、pH 自然、121℃30min灭菌；

分离菌株选择性固体培养基（复筛）[23]：豆粕200g 、琼脂 15g、干酪素5 g、水1000ml,pH自然。豆粕加水煮成汁再加琼脂和干酪素121℃30min灭菌；

1.2分离菌株菌源

南昌市朝阳酱油厂发酵酱油原液、江西省永叔府食品有限公司的腐乳王和腐乳皇豆腐卤。

1.3药品与试剂

牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、麦芽糖、葡萄糖、K2HPO4、醋酸钠、KH2PO4、柠檬酸氢二铵、硫酸镁、Tween 80、琼脂、盐、氯化钙、氢氧化钠、香柏油、二

甲苯、盐酸、氨水、碳酸钠、过氧化氢、硫酸铵、尿素、硝酸钠、乳糖、蔗糖、谷氨酸钠等

2 实验方法

2.1单菌种发酵的菌种选取

菌种的选择对发酵效果有至关重要的作用，各菌种都有其独特的生理特性，它们的作用千差万别，同样，由于不同菌种生长繁殖环境不同，不同菌株发酵的最优条件也就不同。目前常用的菌种是乳酸菌、酵母菌、曲霉菌、产朊假丝酵母和枯草芽孢杆菌等[24]。作为发酵豆粕的菌种应具有易于繁殖，并有较强的分解蛋白质、淀粉和纤维素的能力，能够有效地去除豆粕中所有的抗营养因子。既提高蛋白质的消化率，又提高其中碳水化合物的消化率。因此在购买了米曲霉和转接了枯草芽孢杆菌纯种的基础上，该实验还针对性的选取了南昌市朝阳酱油厂发酵酱油原液与江西省永叔府食品有限公司的腐乳王和腐乳皇豆腐卤进行目的筛选高活性发酵豆粕生产菌株。

2.1.1菌种筛选

2.1.1.1菌种初筛平板的制备

（1）在超净台中从市场上买回的江西省永叔府食品有限公司出品的腐乳王和腐乳皇豆腐卤（以下简称腐卤）分别精确取出5g捣碎于100ml的无菌水中，震荡捣均5min备用；

（2）采用10倍梯度稀释法，选择适宜稀释度，将捣碎的腐卤液涂布在菌株选择性固体培养基初筛平板上，置于生化培养箱中30℃培养48h，挑选透明圈菌圈较大的菌落进行复筛。

（3）在超净台中从南昌市朝阳酱油厂发酵酱油原液（以下简称酱液）分别精确取出5g捣碎于100ml的无菌水中，震荡捣均5min备用；

（4）采用10倍梯度稀释法，选择适宜稀释度稀释液，将捣碎的腐卤液涂布在菌株选择性固体培养基初筛平板上，置于生化培养箱中30℃培养48h，挑选透明圈菌圈较大的菌落进行复筛。初筛应该有对比组，对比组为等量的无菌水接在初筛培养基上观察透明圈产生大小用来对比。

（5）在同等条件操作下反复进行3次以上的实验得出初筛菌株保藏用于复

筛。

2.1.1.2菌种复筛平板的制备

（1）在超净台中将初筛所保存菌种分别用接种针接种于10ml无菌水水中进行10倍梯度稀释，选择适宜稀释度，将稀释的菌液涂布在复筛选择性固体培养基初筛平板上，置于生化培养箱中30℃培养48h，挑选透明圈菌圈较大的菌落进行保存！

（2）复筛和初筛一样的有空白对比组的实验，反复试验三次以上得出目的菌株保藏。

2.2进行豆粕发酵试验

豆粕发酵试验研究内容主要包括以下四部分：

（1）以豆粕为试验原料，研究不同水分含量对豆粕发酵品质的影响，确定发酵豆粕适宜的水分含量。

（2）研究不同发酵温度、时间、pH对豆粕发酵品质的影响，以明确发酵豆粕适宜的温度、时间和pH。

（3）在前面两个试验的研究基础上，添加玉米粉和麸皮作为辅料，研究添加玉米粉和麸皮对发酵豆粕品质的影响。

（4）在前三个试验的基础上，筛选出较好的发酵组合，进一步研究不同发酵处理对豆粕小肽产生量、还原糖和微生物组成等方面的影响。

2.2.1试验材料

（1）豆粕：含水率3%[25]，去皮、黄色、无霉变、结块和异味（江西粮食交易中心提供）。

（2）豆粕发酵剂：由乳酸菌、酵母菌、米曲霉（中国工业微生物菌种保藏中心），本实验室筛选菌种组成，枯草芽孢杆菌(云南大学提供).

（3）其他。

2.2.2试验设计

物料初始水分分别为25%、30%、35%、40%、45%，同时为明确在不同温度和不同时间下，水分对豆粕发酵品质的影响，发酵温度有枯草芽孢杆菌分别为

25℃，35℃，45℃，其他菌种分别为25℃，30℃，35℃，发酵时间为0h(未发酵豆粕)、48h、72h和96h，120h每个处理组设置3个重复。初始pH为自然pH，单菌种发酵。

2.2.3发酵液的制备

根据酵母菌、本实验室筛选菌种组成，米曲霉，枯草芽孢杆菌的各自培养基的配方制备种子液各500ml，分装于三角瓶中各100ml置于摇床180r\min培养2d. 酵母菌、本实验室筛选菌种、米曲霉为30℃培养，枯草芽孢杆菌为35℃培养。

2.2.4发酵种子液的生长曲线制备

酵母菌、本实验室筛选菌种组成，米曲霉制取种子液后置180r\min、30℃摇床培养，每隔3h 取出2ml培养种子液连续取样48h试管封装置于4℃冰箱备检. 枯草芽孢杆菌为35℃,180r\min摇床培养每隔3h 取出2ml培养种子液连续取样48h试管封装置于4℃冰箱备检。

取出酵母菌、本实验室筛选菌种，米曲霉被检样品，采用10倍梯度稀释法稀释，配制相应菌种的固体平板培养基各自涂布置于生化培养箱中培养2d，观察计数各时段取出样品稀释涂布培养产生的单菌落个数，再换算成原种子液的菌数的生长曲线，实验重复3次。绘制生长曲线。标出生长对数期。以后制取取出枯草芽孢杆菌备检液，使用schaeffer-fulton染色法[26]进行染色显微镜下计数得出枯草芽孢杆菌的种子液中菌数生长情况，绘制生长曲线。标出生长对数期。

2.2.5豆粕的发酵方法

水分含量发酵豆粕配方（表一）

温度因素发酵豆粕（表二）

pH因素发酵豆粕（表三）

(一)、根据表一在超净台中进行水分含量的发酵料的接种，每个梯度水分样有15个样共计75个样。根据表二将样品分别置于各梯度的培养温度下培养，每个梯度温度下有放置3个样品培养共计75个样。

（二）、在以上的试验完成后，经过检测得出最佳的发酵水分和温度后再进行pH的调试试验，在最佳发酵温度和水分的条件下制取27个样分别调制有表三的pH 梯度，每个pH梯度有样品3个。

（三）完成以上两步后，在最佳发酵温度、水分和pH的条件下制取27个样品并有对比样品置于生化培养箱中分别24h、48h、72h、96h、120h取样检测，得出最佳的发酵时间。

（四）、经过上述两步试验，由正交试验得出每株菌最佳的发酵时间、发酵水分、发酵温度、发酵pH值。

（五）、在完成前面菌株的最佳的发酵时间、发酵水分、发酵温度、发酵pH 值的试验研究基础上，添加玉米粉和麸皮作为辅料，研究添加玉米粉和麸皮对发酵豆粕品质的影响。在原基础的豆粕为主的发酵料上，分别以质量配比为添加玉米粉和麸皮作为辅料豆粕发酵，具体配料参照表五。

（六）得出最优的发酵单菌株，最优的发酵料配方，最优的发酵生化条件，为进一步的混合菌株发酵打下基础。

2.2.6pH的测定

称取3g样品鲜样和3g风干样品分别混悬于30mL的蒸馏水中，搅拌均匀，4℃静置6h，使用滤纸过滤，再以数字式pH计测定上清液pH。

2.2.7干物质的测定

（一）发酵豆粕风干物质的制备

用已知重量的瓷盘将发酵豆粕部分鲜样放入105℃烘箱中烘10min以停止发酵，然后迅速将瓷盘移入65℃烘箱中烘8～12h（视样本含水量而定），取出放置室内空气中冷却24h，使风干样本中水分与室内湿度平衡，充分回潮后称重，再将瓷盘放入65℃烘箱中烘2h，按上述方法回潮、称重，直至两次称重之差不超过0.5g为止。

（二)采用GB/T6435-1986进行测定

2.2.8高活性单菌发酵豆粕蛋白的测定

（一）粗蛋白的测定：采用半微量凯氏定氮法：GB/T6432294，测定样品为风干

物质，以绝干物质为基础计算测定结果。

（二）蛋白溶解度（PS）的测定

取经研细（60目）后的1.5g样品于250mL烧杯中，加入75mL0.2%KOH 溶液，在磁力搅拌器中搅拌20min。再将50mL液体转至离心管中，用2700r/min速度离心10min。吸取上清液15mL，用凯氏定氮法测定其中的蛋白质含量。此含量相当于0.3g原样本中溶解的蛋白质量。计算公式：蛋白溶解度(%)=0.3g样本的粗蛋白含量/原样本的粗蛋白含量。

（三）小肽测定方法：酸溶蛋白含量(三氯乙酸法)- 减去游离态氨基氮含量。

2.2.9 高活性菌种的真空冷冻干燥保藏

在实验室自主筛选高活性菌株在经过实验室生理生化的初步鉴定和发酵监测的优良效果可以初步断定是一株高产蛋白酶的米曲霉。在实验室现有设备喝技术储备上对其进行真空冷冻干燥制成菌粉。

（一）冻干保护剂

蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糊精、山梨醇、甘露醇、甘油、淀粉、海藻糖、谷氨酸钠、谷氨酸钠为食品级,含量为99%。

由于无机盐能与双糖分子间形成可逆的交联网状物质，从而减少大型冰晶的形成,并且在保藏过程中应加入适量的抗氧化剂Vc，以提高菌种存活率[20]。

（二）冻干保护剂单因素实验

选择性能测定到的一株最佳菌株进行单因素冻干保护剂筛选试验研究。

通过菌种活化→扩大培养→发酵罐富集培养→离心收集菌体→加保护剂→分装→预冻→真空冷冻干燥→冻干粉，测定菌种存活率。

（三）正交实验优化冻干保护剂

通过上面的单因素实验，选出保护能力较好的几种（一般为4种）冻干保护剂和Vc量做正交实验，最终确定保护剂配方。

（四）真空冷冻干燥条件的研究

离心条件、离心前发酵液的pH值、共晶点、共熔点、含水率都是米曲霉在冻干前需要测定的参数。

Ⅰ、米曲霉的共晶点和共熔点的测定：将上述离心所得的菌泥，用选择优化试验所确定的复配冷冻保护剂制成浓度为10～15％（W/V）悬液、菌体悬浮液。此时的悬浮液为混合液，将各悬浮液装盘，并控制装盘厚度不超过10mm，然后

将盛有悬浮液的托盘置于冷冻箱内，逐步降温，观察电阻表电阻突变至无穷大，此刻产品的温度为共晶点温度，然后给产品缓慢升温，其电阻明显变小时的温度为共熔点温度。

Ⅱ、含水量的测定：直接干燥法(GB14769-93)，经过做平行实验并取其测定平均值，测得该冻干前中的水分平均含量。

Ⅲ、离心条件：将培养液装入离心管，放入离心机中，按离心条件分别为4000r/min×30min常温，4000r/min×30min 4℃，8000r/min×15min 常温，8000r/min×15min 4℃离心，离心后测菌体的得率和存活率，对查阅资料所得规律进行验证，并确定试验将选用的离心条件。

Ⅳ、离心前发酵液的pH值测定：离心前发酵液的pH值分别定为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，并分别按上述试验所确定离心条件离心收集菌体，将离心所得到的菌泥均分别进入后面的冻干试验，通过测定冻干后的存活率和活性，选择适合的pH值。

（五）预冷冻条件的研究

根据共熔点测定研究试验所确定的共熔点，将预冻温度确定在共熔点温度以下5～10℃为宜[27、28]。在该阶段同时要使得冷凝器提前开始工作，确保在进入冻干阶段之前，使得冷凝器处于－50℃，真空度达到10～20Pa 。

（六）真空冷冻干燥的速度测定

冷冻速度是真空冷冻干燥的关键因素，且最佳冷冻速度因微生物细胞种类不同相差极大，其主要取决于细胞表面积与体积之比、水分渗透率是否跟得上降温速率和膜的渗透率。当冷冻速度低于最适速度时，细胞内溶液与细胞外溶液的浓度差将对细胞造成损害；当冷冻速度高于最适速度时，细胞内的冰晶也会损伤细胞，降低细胞的成活率[29]。据报道酵母菌合适的冷冻速度为3℃～10℃/min，乳酸菌的合适冷冻速度为3℃～5℃/min[30]。米曲霉的合适冷冻速度为3℃～7℃/min[31].

(七) 冷冻干燥后活性复水试验，最后确定保存。

2.2.10 多菌种混合发酵豆粕

利用实验室单菌种发酵豆粕的保藏菌株对豆粕进行多元混菌发酵，通过正交试验对温度、接种量、通气量和料水比进行优化，研究多元混菌发酵对豆粕中小肽含量的影响。

Ⅰ、分别从保存的各菌种斜面接1环到各菌种增殖培养基。植物乳酸菌(RS

以下简称)接种到MRS液体培养基，35℃，静置培养48 h，枯草芽孢杆菌(KC)孢杆菌(LY)接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基，分别在3O℃、180 r／min振荡培养和30℃静置培养48 h，酵母菌(JM)接种到LB液体培养基，35℃，静置培养48 h。

从上述扩大培养好的菌液中，以2﹪的接种量分别接到各菌的发酵种子培养液中(培养基成分同各菌增殖培养基)，培养时间根据单菌时测的的各菌的对数期的时间为限，制成发酵种子液。

Ⅱ、混合菌种发酵试验设计

ⅰ、菌株组合，根据单菌发酵效果制定混合菌种组合发酵。

ⅱ、混合发酵条件优化

称取一定量的豆粕装入500 mL三角瓶中，调整其含水率，原料豆粕蒸熟，培养基的pH为自然，发酵时间固定为96h，通过多组多因素、多水平的正交试验对起始温度、接种量、通气量、料水比等发酵条件进行优化。

ⅲ、混合发酵条件优化的正交试验分析

主要采用极差分析法进行分析，不同的菌种组合其混菌发酵的较优水平也不相同，混合发酵时菌株间也可能存在着相互竞争，发酵后对小肽含量影响可能表现在发酵温度，菌种接种量等等。

Ⅳ、对发酵料进行接种发酵培养。

Ⅴ、发酵完毕得取出干燥检测得出数据。

2.2.11 发酵豆粕的动物食用试验

实验重复三次以上：

Ⅰ、选取10头同品种的10公斤猪仔对其定量喂食发酵好豆粕，喂食一个月得出增重量。

Ⅱ、选取10头同品种的10公斤猪仔对其定量喂食豆粕原料，喂食一个月得出增重量。该组作为比组。

Ⅲ、选取10头同品种的10公斤猪仔对其定量喂食鱼骨粉，喂食一个月得出增重量。该组作为对比组。

三、研究的可行性及可能遇到的困难

（一）研究的可行性

本研究主持者自入校来一直从事微生物发酵的研究工作，具有丰富的理论知识，同时在工作中积累了丰富的科研经验，并摸索出一套行之有效的研究方法，目前实验室的设备基本可以保证本实验的进行，加上新增加先进的真空冷冻干燥机，因此本课题研究具备了基本的软硬件。

（二）可能遇到的困难

可能遇到的困难有：具有分泌高活性蛋白酶的菌株的筛选，豆粕发酵生产小肽的研究早已成为国内外早已成为热点，要想在原有的研究成果基础上发酵得出含量更高的小肽，必须寻找到更高发酵活性的新型菌株和开发出更加效率的发酵工艺方法；解决发酵菌种的真空冷冻后保藏菌种的活性问题。

解决方法与措施：多查阅国内外相关资料，走创新之路，找到行之有效的措施，尽量利用原有设备、仪器，同时，通过实验中的不断积累，减小偶然误差，做到对实验的无菌操作。

四、预期成果

本课题预期在完成之时，本课题创新点在于发酵用菌基本是实验室自主筛选高活性菌种，开发出一套符合实际工业操作，低投入，高产出豆粕小肽饲料的高科技生产工艺；另一个创新点在对筛选菌株的真空冷冻干燥时的活性保护的研究，可能开发出一种新型高效的菌种冷冻保护剂配方。

本课题预期在完成之时，在国内核心期刊上发表论文2-3篇。

五、经费预算

资料检索、复印、相片制作、论文版面费：0.3万元；

试剂药品、玻璃仪器样等：0.5万元；

原料及小型实验设备：2万元；

其它不可预见费用：0.3万元；

总计：3.1万元

六、研究计划及时间安排

七、参考文献:

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