酵母菌基因组DNA的提取实验方法
酵母菌基因组DNA的提取实验方法一例
酵母菌基因组DNA的提取所需试剂：
SE缓冲液（1M山梨醇，0.1MEDTA pH7.5）；溶菌酶（50mg/ml）；20％PVP；蛋白酶K缓冲液（10mM Tris pH7.6 0.5% SDS 1mM EDTA）；
酵母菌基因组DNA的提取实验的操作过程
1、1.5ml，对数生长期细菌细胞
2、离心，12000rpm,1-2min
3、沉淀，溶于590ulSE缓冲液中混匀+10ul溶菌酶37℃,1hr
4、离心，12000rpm,8-10min
5、沉淀，溶于100μL，0.5μl蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1hr
6、加入1.2ml的CTAB/NaCL,200μl20%PVP 混匀65℃,30min等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀,
7、离心,12000rpm,4-5min
植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)
植物基因组DNA提取试剂盒 1 取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分研磨。 2 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 3 加入700 μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm（~13,400×g）离心5 min。 注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。 4 小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀。 5 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。） 6 向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7 向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8 重复操作步骤7。 9 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μL，体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置 2 min，12,000 rpm （~13,400×g）离心2 min。
基因组DNA提取方法
1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE 溶液中，置4oC保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE （50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 3 1) 细菌培养：细菌接种于5ml 液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP 管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O 也行)。3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。
酵母菌DNA的提取
酵母DNA提取方法 方法一： 石英砂法 1、5000rpm×5min 收集过夜培养的菌体（5ml左右），于200μL 裂解液(50 mmol/ L Tris-HCl pH 8.0 , 180 mmol/ LEDTA pH 8.0 , 1 % SDS , 现配)中，加入3/10 总体积石英砂在涡流混合器上振荡13min，每隔4min 将离心管取出用力甩几下，然后65℃水浴10min。 2、加入200μL 5mol/L KAc，冰浴8min； 3、12000rpm×5min 转移上清至新的离心管中； 4、加入 3 mol/L NaAc 35μl，加入异丙醇200μL混匀后冰浴8min，12000rpm×5min收集沉淀； 5、200μL TE 溶解，加入RNase10μL，65℃水浴10min； 6、加入200μL 氯仿－异戊醇（24:1）,抽提； 7、温柔地取上清150μL ，加入20μL 3 mol/L NaAc 及375μL 无水乙醇，混匀后 12000rpm×8min 收集DNA； 8、70% 乙醇洗涤沉淀，吹干后TE 溶解，-20℃保藏。 方法二： 蜗牛酶法 1. 接种于5 ml的YEPD培养基中在25℃-28℃振荡培养12-16 h。 2. 3500 rpm离心5min沉淀细胞，用1ml 的无菌水洗涤一次，再加0.5ml solution Ⅰ(1M 山梨醇，0.1M EDTA, pH=7.5)重悬。 3. 转移细胞至1.5 ml 的离心管中，加入0.1蜗牛酶(30mg/ml)溶液，37℃保温30-60min, 以获得原生质体。 4. 最大转速离心1min以沉淀细胞，用500ulsolutionⅡ(50mMTris-HCl, 20mM EDTA,pH=7.4)溶液悬浮，然后加入50μl 10% SDS, 混合65℃保温30min。 5. 加入200μl 5M 醋酸钾，放于冰上30 min。 6. 最大转速离心15min，转移上清液至新的离心管中，用等体积的异丙醇沉淀DNA。 7. 室温下放置5min，离心10min，用70%的乙醇洗涤一次，真空干燥，用50ul pH=7.4 TE溶液溶解。
珠磨法提取酵母基因组
利用海砂提取酵母基因组 1、挑GS115单菌落接种于50mL三角瓶6mLYPD培养基中，摇两瓶。将30℃，200r/min，培养过夜（16~18h）的酵母细胞分别吸取1.5mL菌液放在1.5mL EP 管中，共8管，12000r/min，5min，离心收集细胞； 2、用无菌水将细胞悬浮（借助10uL枪头），洗细胞，12000r/min，5min，离心；再次用无菌水洗细胞，只洗表面，去上清； 3、加入200uL（0.275g）海砂，200uL裂解液，200uL酚氯仿（25:24），将细胞悬浮（借助10uL枪头），然后涡旋震荡1min，放在冰上1min，重复四次； 4、12000r/min，5min，离心，吸取上清液（260uL），两管合一管，共4管，每管520uL，加入等体积的酚氯仿（酚265uL，氯仿255uL），颠倒混匀，去蛋白，12000r/min，5min，离心； 5、吸取上清液（500uL），加入等体积的酚氯仿（酚255uL，氯仿245uL），颠倒混匀，去蛋白，12000r/min，5min，离心； 6、吸取上清液（480uL），加入等体积的酚氯仿（酚245uL，氯仿235uL），颠倒混匀，去蛋白，12000r/min，5min，离心； 7、吸取上清液（460uL），加入2倍体积（920uL）的无水乙醇，放在—80℃，30min； 8、12000r/min，5min，离心，去上清，加入400uL体积的70%乙醇，用手弹起沉淀，洗涤，12000r/min，5min，离心，去上清，再次加入400uL体积的70%乙醇，只洗表面，去上清，将DNA自然晾干； 9、用20uL的超纯水溶解DNA，加入1uLRNaseA，37℃，消化30min； 10、取5uLDNA溶液，用1%琼脂糖凝胶跑电泳。 试剂配方： 1、1M Tris-Hcl(pH 8.0)：配50mL Tris碱：6.06g 水：50mL 用浓盐酸约2.1mL调pH至8.0, 2、0.5M EDTA(pH 8.0)：配50mL
植物基因组DNA提取
植物基因组DNA提取 一、实验目的 1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。 2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验仪器及试剂 实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。 实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。 四、实验步骤 1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。 2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。 3.加入700 l的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。 4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。
5.加入200 μl KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。 6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。 7.上清移至新离心管中，加入700 μl异丙醇，-20℃冰箱30 min。 8.10000 rpm离心5 min，弃上清，加入500 μl 70%乙醇漂洗。 9.弃液体，晾干。 10. DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。 （1）DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。 OD260/OD280 ≈ 1.8：说明较纯； OD260/OD280 > 1.8：说明可能有RNA污染； OD260/OD280 < 1.8：说明可能有蛋白质污染。 五、注意事项 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 六、结果与分析 1.植物DNA提取所用试剂的作用？ 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些？ 3.植物DNA提取后的用途有哪些？ 4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。
酵母基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)操作方法及步骤说明书
酵母基因组DNA 快速提取试剂盒 目录号：DN20 适用范围： 适用于快速提取各种酵母基因组DNA 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 保存 50次 平衡液 室温 5 ml 缓冲液YB 室温 20 ml 结合液CB 室温 11 ml 抑制物去除液IR 室温 25 ml 漂洗液WB 室温 15 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温 15 ml Lytic Enzyme -20℃ 2.5 ml 蛋白酶K 粉（可选）20mg/ml -20℃ 20mg 吸附柱AC 室温 50个 收集管（2ml ） 室温 50个 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 目录编号 包装单位 DN2001 50次 DN2031 50次（带蛋白酶K ，带Lytic Enzyme ）
1.结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴 几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。 2.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状（20mg），收到后，可短 暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解配制成20mg/ml溶液，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存，－20℃保存。 3.Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液，因此比较粘稠，请小心取用，－20℃保存。蜗 牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。 4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 该试剂盒采用DNA吸附柱和独有的溶液系统，适合于从多种来源的酵母培养物中快速简单地提取基因组DNA。约3ml处于指数生长期的酵母培养液一般一次抽提可纯化出10-15μg的高质量的基因组DNA。纯化DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。酵母细胞经lytic Enzyme处理去除细胞壁后，独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。 产品特点： 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附 量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 3.快速，简捷，单个样品裂解后操作一般可在30分钟内完成。
基因组DNA提取步骤
基因组DNA提取步骤 1.从无水乙醇中取出少许组织（约50mg）加入干净灭菌的EP管中， 剪碎； 2.加入400ul 1％的SDS，8ul（20mg/ml）的蛋白酶K，充分浸润， 入55℃摇床（100转/分），期间振荡助溶至澄清（5-6h）； 3.取出消化液，加入6mol/L的NaCl300ul，氯仿200ul，轻柔正反 颠倒，使其充分乳化，4℃13000转/分离心30min； 4.取出上清（约400ul），加入等体积氯仿抽提一次，轻柔颠倒后， 4℃13000转/分离心10min； 5.上清加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一 般无影响，可省略该步骤）。 6.取上清加入等体积异丙醇，轻柔混匀后-20℃沉淀10min； 7.4℃13000转/分离心15min，弃上清； 8.用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上 清； 9.冰冻无水乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心4min）弃上 清，自然晾干或烘干，DDW溶解，30-50ul。 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，
基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 从植物组织提取基因组DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和 1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、RnaseA母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转
酵母基因组DNA提取试剂盒操作方法及步骤说明书
试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存50次100次200次 酵母裂解液室温15 ml 30 ml 60 ml 蛋白沉淀液室温 5 ml 10 ml 20 ml DNA溶解液室温 5 ml 5 ml 10 ml 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 1.环境温度低时酵母裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃ 水浴加热几分钟，轻轻旋摇，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 2.蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不 能完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 本试剂盒用于快速的从酵母中提取基因组DNA。在针对酵母细胞特点配制的酵母裂解液作用下，酵母细胞被裂解释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。 产品特点： 1.不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂。 2.快速，简捷，整个过程可在1个小时内完成。
3.结果稳定，产量高（比离心柱型的产量高一倍以上），OD260/OD280典型的比值 达1.7～1.9，长度可达50Kb-150kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应以及文库构建。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 1.吸取1.5ml 酵母培养物到一个1.5ml离心管；12,000rpm离心2分钟，尽可能弃 上清，必要时候可以用枪吸去。 2.高速涡旋振荡，打散重悬酵母细胞团。 3.加入300μl酵母裂解液，涡旋振荡混匀，或者用1毫升的枪头反复吹打混匀。 酵母细胞的重悬分散对下一步裂解非常重要，必须充分分散重悬。 4.将裂解物放置在70℃水浴15-30分钟。 如果产量低，可以适当提高水浴温度和延长水浴时间，中间可以涡旋振荡混匀几次帮助裂解。 5.冰上至少5分钟使回复到室温。 6.在回复到室温的裂解物内加入100μl蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振 荡混匀20秒。混匀后可能见到一些小的蛋白团块。冰浴5分钟。 7.13,000rpm离心5-10分钟。这时应该可以见到管底蛋白沉淀，也可能见到一些蛋 白沉淀漂浮在液体表面。 8.小心缓慢吸取上清到一个新的1.5ml离心管中，不要吸到沉淀。 吸取上清时，注意不要吸到管底的和漂浮在液体表面的蛋白沉淀。如果不小心将蛋白沉淀转入新的离心管中，可再次离心2分钟后取上清。 9.加入等体积的室温异丙醇（约400μl），颠倒30次混匀或者直到出现絮状DNA沉 淀（或者白色浑浊沉淀）。
动物基因组DNA的提取
动物基因组DNA的提取 [实验原理] 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。 通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器 1.台式离心机 2.玻璃匀浆器 3．高压灭菌锅 4．恒温水浴 (二)材料 1．1.5mL微量离心管 2．微量取样器和吸头 3．无菌过滤器(一次性) 4．10 mL注射器 5．鼠肝 6．三羟甲基氨基甲烷(Tris) 7.十二烷基硫酸钠(SDS) 8．乙二胺四乙酸(EDTA)
9．蛋白酶K 10．RNA酶 11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物 (三)试剂 1、1.5 mol／L NaCl 2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.0 3．0.5 mol／L EDTA pH8.0 4．3 mol／L NaAc pH5.2 以上均高压灭菌。 5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制) 6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0) 7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS 8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存 9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0) 10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比) 11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比) 12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液
(一)细菌基因组DNA的提取
（一）细菌基因组DNA的提取 1.试剂 1）CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80mL H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100mL。2）其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶K (20mg/mL或粉剂)，5mol/L NaCl。 2.操作步骤： 1）100mL 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2）加9.5mL TE悬浮沉淀, 并加0.5 mL 10% SDS, 50 μL 20mg/mL(或1mg干粉)蛋白酶K, 混匀, 37℃保温1小时。 3）加1.5mL 5mol/L NaCl, 混匀。 4）加1.5mL CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。 5）用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。6）用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7）加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 8）用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1mL TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 （二）细胞基因组DNA的提取 Each sample + TNES buffer 500 μL +proteinase K 25 μL → 55 °C, 750 rpm, 2hr →+150 μL 6M NaCl, vortex → spin 5 min, Max, romm temperature (RT) →isolate supernatant + 600 μL cold ethanol (95%), vortex → spin 5 min, Max, RT→ precipitation + 75% ethanol, RT, Vortex → spin 5 min, Max, RT →precipitation+50 μL TE buffer (10× stock solution), keep in 4 °C. （三）Chelex法抽提DNA 1.用无菌棉签取双侧颊粘膜拭子，室温下自然干燥过夜，在无菌容器中保存。 2.取1.5mL试管，加双蒸去离子水1mL，将对应的颊粘膜棉签拭子插入试管内，浸泡20 分钟,其间用力搅动棉签，再将棉签用眼科镊挤干取出 3.12000rpm离心5分钟，弃上清 4.加5% chelex-100 200μL、蛋白酶K 5μL，置50℃水浴中30分钟，再置沸水浴中10分钟， 灭活蛋白酶K，冰浴3分钟，使DNA复性 5.取出后12000rpm离心5分钟，取上清液移至另一管中，-20℃保存备用
酵母基因组DNA提取试剂盒使用说明
酵母基因组DNA提取试剂盒使用说明 货号:D1900 规格:50T/100T 保存:室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。 试剂盒内容：50T100T RNase A1m11ml×2 蛋白酶1m11ml×2 酵母破壁酶 1.25m1 2.5m1 β-巯基乙醇300ul600ul 山梨醇Buffer25m150m1 溶液A10ml20ml 溶液B10ml20ml 漂洗液15m115ml×2 洗脱液10ml20ml 吸附柱50个100个 收集管50个100个 说明书1份1份 产品简介: 本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取酵母基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，能够高效专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，
质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组DNA可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。 操作步骤: 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、取酵母细胞(不超过5×107ce l1s)，12000rpm离心1min.，尽量吸除上清。 2、酵母细胞壁的破除：向酵母菌体中加入470ul山梨醇Buffer。充分悬浮菌休，加入25ul酵母破壁酶和5ulβ-巯基乙醇，充分混匀。30℃处理1-2h.，期间可颠倒离心管混匀数次。 3、12000rpm离心lmin，弃上清，收集沉淀。 4、向沉淀中加入200ul溶液A，充分悬浮沉淀，向悬浮液中加入20ul(10mg/ml)的RNase A，充分颠倒混匀，室温放置10min。 5、加入20ul(10mg/ml)的蛋白酶K，充分颠倒混匀。65℃水浴消化15-30min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。 6、加入200ul溶液B，再加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，室温放置2min。 7、12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 8、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 9、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心l min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
酵母基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)
酵母基因组DNA提取试剂盒（离心柱型） GK1091 50 Preps GK1092 100 Preps GK1093 20 Preps 一.试剂盒组成 Components GK1091 50 Preps GK1092 100 Preps GK1093 20 Preps gDNA Recovery Column 2.0-ml Collection Tube LysisY buffer Digestion Solution(a) Wash Solution(b) PB Solution Ext Solution Elution Buffer(c) TE(pH8.0) Boiled RNase A Proteinase K(d) Lyticase(e) Buffer CBS 50 50 10 ml 20 ml 12 ml 20 ml 20 ml 10 ml 15 ml 240 ul 250 ul 250 ul 15ml 100 100 20 ml 40 ml 24 ml 40 ml 40 ml 20 ml 25 ml 480 ul 500 ul 500 ul 30ml 20 20 10 ml 8 ml 12 ml 8 ml 8 ml 10 ml 15 ml 120 ul 100 ul 100 ul 6ml protocol 1 1 1 (a)Digestion Solution低温时可能出现沉淀，请于55℃适当加温溶解后使用，不会影响实验结果。 (b) 首次使用前，必须在Wash Solution瓶中加入4倍体积的无水乙醇，充分混匀后使用。每次使用后将瓶 盖盖紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。如果发现Wash Solution由于运输或保管不当造成体积严重不准，请用量筒定容后再加入4倍体积的无水乙醇。 (c)Elution Buffer为2.5 mM Tris-HCl, pH8.5，请4℃保存。TE (pH8.0) 或者水（pH>7.0）均可以使用，但是 DNA的洗脱效率通常要低20%左右。 (d)Proteinase K分装冻存，不得将Proteinase K直接加到Digestion Solution中，以免酶失活。 (e)请于-20℃分装保存Lyticase，减少反复冻融的次数，以免酶失活。 二．产品简介 酵母细胞有一层坚硬的细胞壁，妨碍了研究人员从酵母细胞中快速有效地分离提取基因组DNA。本试剂盒提供可以高效酶解酵母细胞壁的Lyticase和能够特异结合DNA的离心吸附柱，用于提取酵母细胞中的基因组DNA。同时本产品对经典的SDS裂解液进行了改良，并使用PB Solution与Ext Solution处理细胞裂解液，再经过能高效、专一吸附DNA的离心柱吸附后，可最大限度去除杂质蛋白以及脂类物质。 三．主要用途 从酵母等真菌中小规模抽提基因组DNA。 四．主要特点 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，重复性好。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 3.快速，简捷，单个样品操作一般可在2小时内完成。 4.多次柱漂洗确保提取酵母基因组的高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达50Kb～ 100kb，可直接用于PCR， Southern-blot和各种酶切反应。 五．需自备试剂 无水乙醇
酵母核糖核酸的提取及测定
酵母核糖核酸的提取及测定 一、实验背景及目的 核糖核酸(RNA)和它的降解物核苷酸、核苷及其衍生物在生物化学、医药、食品添加剂、农业等领域有着广泛的应用。比如能够促进作物的生长，在水稻、小麦、柑橘及多种蔬菜生产中应用，取得了明显的增产效果。像鸟苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)还是强力助鲜剂，胞苷酸(CMP)和尿苷酸(UMP)可作为生产治疗癌症、肝炎及冠心病等药物的原料。而利用微生物资源提取氨基酸、核苷酸等生物小分子，具有成本低、非化学合成、无毒、无害的特点。[1] 随着啤酒等发酵行业的快速发展，产生了相应的大量发酵副产物，如何利用这些副产物，既做到不污染环境，还能产生良好的经济效益，一直是研究的热点。而啤酒废酵母中RNA 含量达6%~8%，是生产RNA的较好原料，此外，抽提后的菌体蛋白质(占干菌体的50%)还具有很高的利用价值。所以利用啤酒废酵母生产RNA形成了非常有益的产业链。[2] 本实验目的就是学习从酵母中提取RNA的方法并掌握其测定手段。 二、实验原理 微生物是工.业上大量生产核酸的原料，其中以酵母最为理想，酵母核酸中主要是RMA (2.67~10.0%)，DNA很少(0.03~0.516%)，菌体容易收集，RMA也易于分离。RMA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去，再根据RNA等电点在pH2. 0~2.5的特点，将体系pH调至其等电点，使之沉淀，进行离心收集。 提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。稀碱法利用碱使细菌细胞壁水解，使RNA释放出来，浓盐法是在加热条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来，RNA 钠盐易溶于水，在含盐的菌体溶液中，RVA有较高的溶解度。二者均通过控制温度使蛋白质变性沉淀，通过离心将RNA及蛋白质和酵母菌体分离，进而在等电点沉淀RNA，从而达到提取目的。本实验采用浓盐法(10% NaCl),是食品医药卫生领域制备RNA 制剂的经典方案。[1][3] 核酸不论是DNA还是RNA,都是由核普酸组成的多聚核苷酸化合物，而核甘酸是由戊糖、碱基和磷酸构成，三个组份是以等分子比例存在。所以测定核酸的含员，只需测定组成核苷酸的任一成份，如磷、糖或碱基，便可相应计算山核酸的含量。 目前测定核酸含量的方法主要有: 1、定磷法，测量RNA和DNA:无机消化法。(蛋白质含量测定:凯氏定氮法) 2、戊糖测定法，测RNA: 苔黑酚法 3、脱氧戊糖测定法，测DNA:二苯胺法 4、紫外吸收法测定RNA和IDNA:碱基平面的共轭双键在紫外区具特异光吸收 后三种都是设计利用的比色法。 本实验采用紫外吸收法来测定并计算所获制品RNA的含量，再计算收率。 三、实验材料，仪器和试剂 1.材料:干酵母片粉 2.仪器:低温冷冻离心机（Eppendorf 5804R离心机）、恒温烘箱（202-2AB型，天津市泰斯特仪器有限公司）、电子天平（FA1004 上皿电子天平，上海精科）、紫外分光光度计（WFZ UV-2000型，尤尼柯仪器有限公司）、小台秤。(记录厂家及型号); pH计(本次实验:精密试纸pH0.5-5.0,精密试纸pH5.0-9.0) 主要器皿:移液器、研钵、三角瓶、容量瓶、烧杯 3.试剂: 10%NaCl、6MHCl、 95%乙醇(分析纯)、3~5%的氨水、RNA沉淀剂。 RNA沉淀剂：取0.5克钼酸铵，加水193ml，加7mL 70%过氯酸，总体积200ml. (70%过氯酸即高氯酸，原液浓度即是70%)。
真核生物基因组DNA的提取和含量测定
实验报告 课程名称： 生物化学实验 实验名称： 真核生物基因组DNA 的提取和含量测定 指导老师： 同组学生： 廖杰 成绩：__________________ 真核生物基因组DNA 的提取和含量测定 【实验原理】 制备具有生物活性的大分子核酸，必需采取温和的制备条件，避免过酸、过碱 的反应环境和剧烈的搅拌，防止核酸酶的作用，并要求在低温下进行操作 。 一、 真核生物基因组DNA 的提取 本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法破碎组织细胞。 DNP 在0.14mol/L NaCl 中不溶解,而RNP 可溶解。 用无菌水溶解沉淀，加入蛋白酶消化液（含有蛋白酶K 和SDS ）。 １温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA 的完整性， ２可以变性Dnase ， ３还可以去除部分的蛋白。 ４使核蛋白体从DNA 上解离。 然后加RNase 以去除RNA ，再用苯酚:氯仿抽提法反复抽提提取DNA 苯酚:氯仿抽提法： 酚、氯仿是有机溶剂，能有效地使蛋白质变性。纯酚在与水混合时处于下层。然而有机相和水相会难于分开。 专业： 药学 姓名： 阿卜杜合力力 学号： 3100105256 日期： 2012.5.10 地点： 生化实验室 装 订 线
若使用酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重较大(1.47)，可在很大程度上解决这个问题，促进两相的分离。 异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。 变性蛋白一般集中在两相之间的界面层，而脂类则有效地分配在有机相中，核酸则被留于上层水相。 该法其具有操作条件比较温和，能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性，可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。 但其操作步骤较为繁琐，去除蛋白质需要反复进行多次。 砷盐、氟化物、柠檬酸、EDTA等可抑制DNase的活性；皂土等可抑制RNase 的活性。 收集上清液后用乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液溶解DNA，并用紫外吸收法测定DNA的含量及纯度。 二、紫外吸收法测定基因组DNA的含量及纯度 1．紫外分光光度法测定核酸含量： 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，吸光度A值为1相当于大约50μg /ml双链DNA。 2．紫外分光光度法测定DNA纯度： 由于DNA在260nm处有最大的吸收峰，而蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，DNA纯品的算A260/ A280为1.8（1.7~1.9），故根据算A260/ A280的值可以估计DNA的纯度。 若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。
酵母基因组DNA大量提取试剂盒使用说明
酵母基因组DNA大量提取试剂盒使用说明 货号：D1910 规格：10T 保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。 试剂盒内容：D1910-10T保存 RNase A1m1×5-20℃ 蛋白酶K1ml×5-20℃ 酵母破壁酶 1.25m1×5-20℃ β-巯基乙醇 1.5m12-8℃ 山梨醇Buffer125m1RT 溶液YA50ml RT 溶液YB50ml RT 漂洗液15ml×2RT 洗脱液20m1RT 吸附柱10个RT 收集管20个RT 说明书1份 产品简介： 酵母基因组DNA大量提取试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取酵母基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料，能够高效专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组DNA可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。
操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、在离心管中收集酵母细胞20-40ml(不超过109ce l1s)，10000rpm离心1min，尽量吸除上清。 2、酵母细胞壁的破除：向酵母菌体中加入9ml山梨醇Buffer。充分悬浮菌体，加入600ul 酵母破壁酶和100ulβ-巯基乙醇，充分混匀。30℃处理1-2h，期间可颠倒离心管混匀数次。 3、10000rpm离心lmin，弃上清，收集沉淀。 4、向沉淀中加入5ml溶液YA，充分悬浮沉淀，向悬浮液中加入500ul的RNase A(10mg/ml)，充分颠倒混匀，室温放置10min。 5、加入500ul的蛋白酶K(10mg/ml)，充分颠倒混匀。65℃水浴消化30-60min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。 6、加入5ml溶液YB，再加入5ml无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，室温放置2min。 7、10000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 8、向吸附柱中加入7ml漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。10000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 9、向吸附柱中加入7ml漂洗液，10000rpm离心l min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 10、10000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。 11、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加1-2ml经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，10000rpm离心l min。 12、离心所得洗脱液再加入吸附柱中，10000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。注意事项：
基因组DNA提取方法
基因组DNA提取方法 HOM buffer：80mM EDTA，100mM Tris-HCl，0.5％SDS，pH8.0 称取29.8g EDTA2Na-2H2O，溶于700ml双蒸水中，加入12.1g Tris base（分 子量：121.1），加入5g SDS，用NaOH调节pH至8.0，定容至1000ml，高压灭 菌，室温保存。 Proteinase K（蛋白酶K）：15 mg/ml(10-15mg/ml的浓度都可以) 已有蛋白酶K 浓度：10mg/ml，每次使用15-20微升 温度为室温，离心时也是室温离心 1. 加入500微升的HOM buffer和10－15微升的蛋白酶K，在55℃消化至少3小时。每隔1小时摇动一次。 2. 加500微升氯化钠（4.5M），300微升氯仿，混20分钟。 3. 在13000 rpm下离心10分钟。 4. 转移上清液到一个新管里（大概有850微升左右的样子）。 5. 加595微升无水异丙醇(pure isopropanol)（0.7倍体积），混20分钟。 6. 在13000 rpm下离心10分钟，倒掉上清。 7. 加0.5毫升75％的乙醇，并消化5分钟（提的时候因为我同时在做酶切，烘箱温度酶要求37℃，所以消化了大概二十多分钟，温度高一些的话时间可以短一些），在13000 rpm 下离心20分钟，倒掉上清。 8. 凉干，加50－100μL的TE buffer或者双蒸水溶解，第二天检测。 上面是我们实验室的改进方法，效果不错。原方法中:混的时候只用了10分钟，第三步的离心是10000 rpm，第七步的乙醇是70％的浓度。 用酚抽提后，按步骤9-10重沉淀DNA： 9. 加0.1倍体积3mol/L NaAc（pH5.2）及2倍体积无水乙醇，颠倒混合沉淀DNA，室温下静置10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。 10.用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20℃保存。 11.如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清；如要除去其中的RNA，可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30分钟。 熊小飞的经验：凝胶检测结果如果是点样孔那里特别亮，且跑出来的带有拖影（比较亮且长），说明你提的DNA中蛋白质杂质比较多，这种DNA一般不适合用来做微卫星和PCR。 放置几天后，其中的RNA、蛋白质会降解一部分，也有可能可以拿来用。其实 你只要把这种DNA用PCR回收试剂盒来处理一下，效果就非常的好，试剂盒中的 TE和EB都可以用灭菌水代替，最后洗脱DNA的EB要用50-60度的灭菌水（你只要