比较不同培养基培养脐带间充质干细胞
比较不同培养基培养脐带间充质干细胞
目前的培养体系和培养方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培养基，但含血清培养基使临床细胞治疗受到限制，存在不安全因素。通过对脐带间充质干细胞在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）及无血清培养基StemProRMSC SFM的培养扩增，比较三种培养体系的优略。建立从减血清到无血清的培养体系，减少血清对临床细胞治疗的干扰，提高临床细胞治疗的稳定性与安全性。
标签：有血清培养基;无血清培养基;脐带间充质干细胞随着对脐带间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，脐带间充质干细胞可在体外大量培养扩增，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛的功能。同时脐带间充质干细胞还具有取材方便，无伦理学限制，免疫原性相对纯净的优势，可以为实验和临床提供足够的细胞来源。
1资料与方法
1.1一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4℃保存，6h内无菌處理。
1.2脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank’s液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton胶。将其剪碎至1mm3组织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20~25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。3~5h 后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，正向放入体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。72h后换液，一般5~7d可有间充质干细胞爬出。
1.3脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）、StemProR MSC SFM三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。
1.4 流式细胞仪表型检测取生长状态良好的P4代细胞，消化并计数，以每管1×106个细胞，分别加入10μl单克隆抗体CD73、CD34、CD45、CD105、HLA-DR、HLA-ABC及阴性对照lgG1-PE、阳性对照lgG1-FITC，室温避光孵育30min，PBS洗涤两次，室温300g，5min。PBS重悬后上流式细胞仪。
1.5 cck-8 法检测细胞活性取生长状态良好的P4代细胞，调整细胞浓度至0.2×105/ml，加入96孔板。每孔90μl放在37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内培养。7d内每日上午10:00取出96孔板用与原来孔内相同培养基100μl 换液后加入cck-8溶液，继续孵育1h。用酶标仪波长450nm测定各孔OD值。以OD值代表细胞的相对数量，绘制细胞生长曲线。
脐带间充质干细胞的
脐带间充质干细胞 脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。 目录 1概念 2优势 3分离培养 4用途 5干细胞研究 ▪期刊简介 ▪研究对象 ▪研究内容 1概念 脐带间充质干细胞是以人脐带血血清为主体的培养体系的脐带间充质干细胞培养扩增的方法：流式细胞仪检测结果显示，贴壁细胞均表达CD44、CD29，低表达CD106，不表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，也不表达HLA-DR：细胞倍增时间为30h，细胞周期分析表明，G0～G1期和+G2+M期所占比例分别为78.84%和11.16%。结论：应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。 2优势 脐带间充质干细胞（MSCs）具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低[1]，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。干细胞的培养体系主要应用含动物血清（如胎牛血清）的培养基，在此种环境下生长的干细胞，其内部结构会发生何种变化尚未可知，为避免含动物血清培养中病毒等病原体污染和异种血清所致
的过敏反应，课题组进行了以人脐带血血清为主体的培养体系体外培养扩增脐带间充质干细胞的实验研究。以探讨人脐带血血清替代动物血清用于培养临床组织工程用干细胞的可行性。同时研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、细胞周期、免疫表型等特性，旨在建立脐带间充质干细胞的富集方法，为建立脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据。[2] 3分离培养 脐带间充质干细胞的获取主要有组织块贴壁法与酶消化法，由于酶对细胞的损伤较大，且细胞得率较低，费用昂贵，因此大多数实验室采取了组织块贴壁法进行培养。 取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至1 mm3大小，加入α-MEM培养液置于37℃，5%的培养箱培养，培养液中含10% FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。脐带CO 2 组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。 脐带间充质干细胞 4用途 脐带间充质干细胞的主要用途包括： 一、能具有较强的免疫调节作用，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率；
脐带间充质干细胞制备原理
脐带间充质干细胞制备原理 一、概述 脐带间充质干细胞（Wharton's jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）是一种来源于新生儿脐带的干细胞。与其他来源的干细胞相比，WJ-MSCs具有易于获取、无伦理争议、低免疫原性和多向分化潜能等优点，因此在临床应用中具有广泛的前景。本文将就WJ-MSCs制备 原理进行详细介绍。 二、脐带间充质干细胞的来源 脐带是连接胎盘和新生儿的管道，其中包含了丰富的干细胞资源。在 脐带中，除了血液造血干细胞外，还存在着一种特殊类型的干细胞——脐带间充质干细胞。这种干细胞主要存在于脐带Wharton's jelly （WJ）中，与周围组织隔离。 三、WJ-MSCs制备方法 1. 脐带获取 制备WJ-MSCs首先需要获取新生儿脐带组织。通常情况下，在新生 儿出生后不久即可进行采集。采集过程中需要注意消毒和无菌操作。 2. 分离WJ组织 将采集到的脐带组织进行分离，去除血管和外层膜等部分，得到WJ
组织。WJ组织是一种透明的胶状物质，通常呈现出白色或浅黄色。 3. 制备单细胞悬液 将WJ组织切成小块，并加入胶原酶等消化酶进行消化。消化后，用PBS等缓冲液洗涤多次，最后制备成单细胞悬液。 4. 培养和扩增 将制备好的单细胞悬液接种在干细胞培养基中，并放置于37℃、5% CO2的培养箱内进行培养和扩增。在培养过程中需要定期更换培养基，并对干细胞进行观察和评估。 5. 鉴定和纯化 经过一段时间的培养，可以通过流式细胞术等方法对干细胞进行鉴定 和纯化。通常情况下，WJ-MSCs表达CD73、CD90、CD105等特征性标志物，并且不表达CD34、CD45等血液细胞特征性标志物。 6. 冻存 经过纯化和鉴定后，WJ-MSCs可以进行冻存。在冻存过程中需要使用特殊的冻存液，并在低温下保存。 四、WJ-MSCs的应用前景 WJ-MSCs具有广泛的应用前景。目前已经有多项临床试验显示，WJ-MSCs可以用于治疗多种疾病，如心血管疾病、神经系统疾病、肝脏
人脐带间充质干细胞操作规范
人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2， 有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1# 培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带 转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液，将胶 体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有 血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中 须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25% 胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即 得到P0代脐带间充质干细胞;
脐带间充质干细胞培养方法
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.360docs.net/doc/3d19227132.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.360docs.net/doc/3d19227132.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化
脐带间充质干细胞培养的研究进展-细胞生物学论文-生物学论文
脐带间充质干细胞培养的研究进展-细胞生物学论文-生物学论文 ——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——细胞培养论文（专业范文8篇）之第六篇 摘要：目的观察脐带中含有的间充质干细胞体外分离、纯化及培养, 并用流式细胞仪监测脐带表面抗原及细胞周期, 探讨脐带间充质干细胞在组织工程及再生医学领域应用的优势。方法取正常足月新生儿脐带近胎儿端, 剔除动静脉, 取其中的间质成分, 双酶法消化, 从而得到原代细胞进行培养和纯化获得贴壁细胞, 采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面抗原表达情况。结果从脐带培养的间充质干细胞呈成纤维状细胞形态, 表达间充质干细胞相关抗原CD105、CD44、CD13、CD29, 但不表达造血细胞抗原CD34、CD45, 不表达内皮细胞抗原CD31, 与骨髓间充质干细胞表型一致。结论脐带来源的间充质干细胞可在体外培养、扩增, 具有和骨髓来源的间充质干细胞相似的生物形态和抗原表型, 为细胞治疗探索出的新的来源。 关键词：脐带,间充质干细胞,细胞培养,免疫表型,多向分化免
疫调节 间充质干细胞是一种起源于中胚层的成体干细胞, 其具有自我更新和多向分化能力, 近年来成为研究的热点。既往间充质干细胞主要来源于骨髓, 但随着年龄的老化, 间充质干细胞逐渐减少, 增殖分化能力减退, 取材对供者有所损伤, 限制了骨髓间充质干细胞的应用。寻找一种新的可替代来源成为迫切要解决的问题。目前, 人脐带间充质细胞已经在癌症[1]、心脏病、糖尿病[2]、神经疾病[3]等动物实验中证实有良好的治疗效果。从脐带里提取出间充质干细胞并进行体外培养、扩增、生物学鉴定, 为间充质干细胞的应用提供新的来源。 1 材料与方法 1.1 材料来源取健康足月新生儿脐带组织, 在胎儿出生
脐带间充质干细胞-是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞,具有来源丰富、免疫原性低等诸多特性
脐带间充质干细胞-是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有来源丰富、免疫原性低、移植后不需应用免疫抑制剂的情况下长期存活等诸多特性 脐带间充质干细胞-是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有来源丰富、免疫原性低、移植后不需应用免疫抑制剂的情况下长期存活等诸多特性，为其应用于临床开阔了更好的前景。 学术术语来源--- 人脐带间充质干细胞生物特性比较：胰酶冷消化和组织块法体外培养 文章亮点： 1实验创新性地采用胰酶冷消化法培养人脐带间充质干细胞，从细胞形态、生长曲线、细胞表面标记物及诱导分化能力4个方面与传统组织块法比较，为不同需求的科研工作者获得较多的脐带间充质干细胞、更完整的细胞结构及其功能以满足实验要求提供一些资料。 2结果显示组织块法培养原代细胞形态优于胰酶冷消化法，第3代细胞增殖速率显著快于胰酶冷消化法，两种方法获得的脐带间充质干细胞具有相同的表面标志，经诱导后均表达神经干细胞特征性标志物nestin，说明组织块法更适合用于培养脐带间充质干细胞。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；胰酶冷消化法；组织块法；脐带间充质干细胞；组织工程；生物学特性 主题词： 脐带；间质干细胞；细胞培养技术；细胞，培养的 摘要 背景：以往采用胰酶冷消化法培养脐带间充质干细胞的研究较少。 目的：比较两种方法体外培养人脐带间充质干细胞的生物学特性。 方法：采用胰酶冷消化法和组织块法从人脐带中分离、纯化和传代培养人脐带间充质干细胞，记录首次出现贴壁细胞时间及原代培养周期，倒置相差显微镜观察脐带间充质干细胞的形态及生长情况，制作第3代脐带间充质干细胞生长曲线，流式细胞仪分析检测第3代脐带间充质干细胞表面标志的表达，第3 代脐带间充质干细胞加入成神经诱导培养基诱导分化第3天行荧光免疫化学
小鼠脐间带充质干细胞培养方法
小鼠脐间带充质干细胞培养方法 引言 充质干细胞（me se nc h ym al st em ce ll s，M SC s）是一类具有多向分化潜能的多能干细胞，具有广泛的应用前景。在生物医学领域，小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的来源之一。本文将介绍小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，帮助研究人员更好地利用这一珍贵的细胞资源。 原料与试剂准备 1.小鼠脐带组织 2.DM EM/F12培养基 3.胎牛血清（F BS） 4.细胞培养袋 5.1×PB S缓冲液 步骤 1.小鼠脐带的处理 （1）准备一个无菌操作台，并在工作区上喷洒酒精消毒剂，手套等工具也需要经过灭菌处理。 （2）取出小鼠脐带组织，置于无菌的1×P BS缓冲液中，用剪刀剪碎细胞片段。 （3）将小鼠脐带组织片段转移到细胞培养袋中。 （4）加入适量的DME M/F12培养基，保证组织片段被完全浸润。 （5）将细胞培养袋密封，并置于37°C恒温培养箱中，进行消化和悬浮培养，时间约为4-6小时。 2.细胞的收获和培养
（1）将消化后的细胞悬液通过100μm的细胞滤网过滤，去除大颗粒 残渣。 （2）将滤液离心，去除上清液，沉淀的细胞用DM EM/F12培养基洗涤。 （3）将洗涤后的细胞沉淀用适量的D MEM/F12培养基重新悬浮。 （4）将细胞悬液转移到细胞培养瓶中，每瓶加入适量的培养基和10% 的F BS。 （5）将细胞培养瓶放置于37°C恒温培养箱中，进行培养。 （6）每2-3天更换一次培养基，保持细胞的健康生长。 3.细胞的传代与冻存 （1）当细胞达到80-90%的密度时，将培养瓶内的细胞用1×P BS缓 冲液洗涤。 （2）用胰酶对细胞进行消化，停止细胞的生长。 （3）加入适量的DME M/F12培养基，将细胞悬液转移到新的细胞培养 瓶中。 （4）将细胞培养瓶放置于恒温培养箱中继续培养。 4.脐带间充质干细胞的鉴定 （1）使用流式细胞仪对培养的小鼠脐带间充质干细胞进行免疫鉴定。 （2）选择适当的免疫标记物，如CD44，C D90，CD105和CD34等进 行细胞表面标记。 （3）根据免疫标记物的阳性率来评估细胞的纯度和有效性。 结论 小鼠脐间带充质干细胞是一种重要的研究资源，在生物医学领域具有 广泛的应用前景。本文介绍了小鼠脐间带充质干细胞的培养方法，从样品 处理、细胞的收获和培养、细胞的传代与冻存、以及细胞的鉴定等方面进 行了详细的介绍。希望这一方法能够帮助研究人员更好地利用小鼠脐间带 充质干细胞，推动生物医学的发展与进步。
脐带间充质干细胞制备原理
脐带间充质干细胞制备原理 导言 随着干细胞研究的不断深入，脐带间充质干细胞作为一种重要的干细胞资源，受到了广泛关注。本文将为大家介绍脐带间充质干细胞的制备原理，探讨其在生物医学领域的应用前景。 什么是脐带间充质干细胞 脐带间充质干细胞（Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）是一种存在于脐带Wharton’s jelly（韧带）中的间充质干细胞。它们具 有多能性，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。 脐带间充质干细胞的制备过程 脐带间充质干细胞的制备过程主要包括以下几个步骤： 步骤一：脐带收集和处理 1.选择健康的孕妇，并取得其同意，对脐带进行收集。 2.清洗脐带，去除表面的血液和细胞残留物。 3.将脐带剪成适当的大小，并用理化方法处理，以消除可能的微生物感染。 步骤二：组织析出 1.将处理后的脐带放入离心管中。 2.使用适当的消化酶（如胶原酶）进行组织的分解，使细胞从基质中解离出来。 3.离心管离心，获得细胞和基质的沉淀。 步骤三：细胞培养 1.用培养基悬浮细胞沉淀，并接种到培养器皿中。 2.提供适当的培养环境，如培养基、温度和湿度，以促进细胞的生长和增殖。 3.定期检查和观察细胞的形态和倍增情况。
步骤四：细胞鉴定和扩增 1.使用细胞表面标记物的抗体进行免疫细胞化学染色，以确定细胞的纯度和特 异性。 2.使用流式细胞术等技术，对细胞进行进一步的鉴定和排序。 3.如果需要，进行细胞扩增，以获取足够数量的干细胞用于后续的实验和应用。 脐带间充质干细胞的应用前景 脐带间充质干细胞具有以下几个优点，使其在生物医学领域有着广阔的应用前景： 优点一：丰富的源头 脐带是产妇和胎儿之间的纽带，获得脐带间充质干细胞不需要借助捐赠，因此更加容易获取，资源丰富。 优点二：低免疫原性 脐带间充质干细胞表面的HLA-ABC 分子表达较低，导致其具有较低的免疫原性， 在移植过程中不易被宿主免疫系统识别和攻击。 优点三：多向分化潜能 脐带间充质干细胞具有多向分化潜能，可以分化为多种细胞类型，如骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。因此可以在组织工程、再生医学和疾病治疗等方面得到广泛应用。 优点四：较少的伦理争议 相比胚胎干细胞的获取过程，脐带间充质干细胞的制备过程较为简单，且不涉及胚胎问题，因此较少引起伦理争议。 结论 脐带间充质干细胞作为一种重要的干细胞资源，其制备过程相对简单，具有丰富的源头、较低的免疫原性、多向分化潜能和较少的伦理争议等优势。因此，它在生物医学领域有着广阔的应用前景。未来的研究和探索将进一步推动脐带间充质干细胞的临床应用和转化医学的发展。
脐带沃顿胶间充质干细胞的分离培养及其诱导分化
脐带沃顿胶间充质干细胞的分离培养及其诱导分化 蒋洁;谭灿;张李洋;肖玲;张建湘 【摘要】背景:骨髓是目前间充质干细胞的丰要来源,但由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因,其应用具有一定局限性.近年来,脐带作为阈充质干细胞的新来源已经得到广泛关注.目的:探讨从人脐带沃顿胶中分离、扩增间充质干细胞的方法,鉴定其免疫表型与分化潜能.方法:种植法分离和扩增间充质干细胞:用FasGrow培养基培养,光镜观察获得的人脐带沃顿胶间充质干细胞的形态:免疫组织化学方法检测其免疫表型:Gomori钙钴碱性磷酸酶染色、von Kossa钙结节染色、四环素荧光标记鉴定其向成骨方向分化的能力及油红O染色鉴定其向成脂肪分化的能力.结果与结论:种植法容易从人脐带沃顿胶中获得间充质干细胞;原代培养后12-16 d达70%～80%融合,传代后可维持未分化状态并稳定增殖;细胞倍增时间为2 d左右,体外增殖达20代以上:表面标记分析显示:CD44、CD105、CD133、MHC-1呈阳性,CD34、CD45呈阴性;体外诱导实验表明:该细胞具有体外成脂肪、成骨和神经样细胞分化的能力. 【期刊名称】《中国组织工程研究》 【年(卷),期】2010(014)010 【总页数】5页(P1734-1738) 【关键词】脐带;沃顿胶;间充质干细胞;细胞分离;细胞培养;诱导分化 【作者】蒋洁;谭灿;张李洋;肖玲;张建湘 【作者单位】中南大学湘雅基础医学院组织学与胚胎学系,湖南省长沙市410013;怀化医学高等专科学校组织学与胚胎学教研室,湖南省怀化市,418000;中南大学湘
雅基础医学院组织学与胚胎学系,湖南省长沙市410013;中南大学生物科学与技术 学院细胞生物学系,湖南省长沙市410013;中南大学湘雅基础医学院组织学与胚胎 学系,湖南省长沙市410013;中南大学湘雅基础医学院组织学与胚胎学系,湖南省长 沙市410013;中南大学生物科学与技术学院细胞生物学系,湖南省长沙市410013【正文语种】中文 【中图分类】R394.2 0 引言 作为组织工程理想的种子细胞，间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs) 由于具有多向分化能力，在体外经适当诱导可向成骨、软骨、脂肪、神经、肌腱、肌肉、肝脏等方向分化[1-7]，因而备受关注。目前骨髓是MSCs的主要来源，但 由于取材不便、细胞数量受年龄限制等原因，其应用具有一定局限性[8-11]。近年来，研究人员发现脐带血中可能含有与骨髓类似的MSCs[12]，随后的大量研究也证实了这一结论[13-17]。与骨髓相比，脐血MSCs来源充足，病毒污染概率低，免疫源性弱，无社会、伦理和法律方面的争议。但脐血源MSCs分离效率较低， 难以在组织工程和细胞治疗中广泛应用[18]。寻求一种具有更高分离效率且兼具脐血源优势的成体多能干细胞来源已成为干细胞研究的热点问题之一。基于这一考虑，本文尝试建立从足月胎儿脐带沃顿胶(Wharton’s jelly，WJ)中分离、扩MSCs 的简易方法，通过形态学、免疫表型、体外诱导分化等鉴定其生物学特性，并与现有MSCs获取途径进行对比分析。 1 材料和方法 设计：观察性实验。 时间及地点：实验于2009-03/09在中南大学基础医学院组织学与胚胎学系完成。
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定
脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定 概述 脐带血间充质干细胞（Wharton’s jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一类来源于脐带的干细胞。WJ-MSCs具有较强的增殖能力、多向分化潜能、免疫调 节功能等，是目前研究领域中备受关注的干细胞类型之一。 在该文档中，我们将介绍如何从脐带血样中分离出WJ-MSCs，并进行相关的细 胞培养和鉴定。 分离过程 脐带血样获取 首先需要从人体获得脐带血样。脐带血样一般可以在婴儿出生后通过脐带穿刺 等方式获取。获取脐带血样需要得到母亲的同意，并通过相关机构进行规范化处理。 分离WJ-MSCs 脐带血样获取后，需要将其中的WJ-MSCs进行分离。具体分离步骤如下： 1. 将脐带血样转移至离心管中； 2. 加入相同体积的PBS，并轻轻混合； 3. 通过低速 离心分离脐带血样中的血细胞等成分； 4. 取下沉后的WJ组织，加入胶原酶等酶类消化物进行消化，离心分离细胞； 5. 通过细胞培养等方式扩增细胞数量。 细胞培养 在分离得到WJ-MSCs之后，需要进行相关的细胞培养。具体培养步骤如下：1. 将分离得到的WJ-MSCs转移至新的培养皿中； 2. 加入含有10% FBS的DMEM低 糖培养基； 3. 定期更换培养基，并记录生长状况。 鉴定方法 确定分离的细胞为WJ-MSCs的方法很多，常用的方法如下： #### 形态学鉴 定通过显微镜观察细胞形态、吸附能力等，判断细胞是否符合WJ-MSCs的特征。 免疫学鉴定 通过使用针对WJ-MSCs标记的分子抗体（如CD73、CD90等）对细胞进行标记，并使用流式细胞仪等方法进行检测。 活力检测 通过MTT法、细胞增殖实验等，检测WJ-MSCs是否具备较强的增殖能力。
无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞
无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞 张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲 【摘要】目的用体外无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞.方法取1例 足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织块贴壁培养,使用无血清培养体系培养获得 人脐带间充质干细胞.通过形态学观察,成脂、成骨、成软骨诱导分化能力检测及流 式细胞术免疫表型检测进行鉴定.结果组织块贴壁培养6天后可见细胞从组织块边沿爬出;培养15天后,达到80％汇合,生长状况良好,细胞呈梭形,为典型的成纤维细 胞形态,极性整齐排列,集落呈涡旋状,形态较均一.传代培养的第三代细胞CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性表达,不表达CD34和CD45,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力.结论无血清培养体系组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞法成功率高,其生物学特性稳定,并能消除由未确定的病原体引起的风险. 【期刊名称】《皮肤病与性病》 【年(卷),期】2019(041)001 【总页数】3页(P4-6) 【关键词】脐带间充质干细胞;分离;贴壁培养 【作者】张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲 【作者单位】昆明医科大学基础医学院,云南昆明650500;昆明医科大学第二附属 医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二 附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101
【正文语种】中文 【中图分类】R392-33 人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells， HUC-MSCs）是从人脐带组织中分离的间充质干细胞，具有增殖能力，如：神经 元样细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞及少突胶质细胞分化的能力，由于脐带体外细胞能迅速扩增，生物性能稳定，取材比较容易并且细胞来源相对广泛，在细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的前景，已经成为治疗的一种新的种子细胞来源[1、2]。本研究旨在观察体外无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞培养方法的效果。 1 材料与方法 1.1 材料来源从昆明市妇幼保健院取足月（孕39周）妊娠剖宫产的健康胎儿脐带 1根，胎儿无先天性疾病，产妇无传染性疾病。 1.2 主要仪器洁净工作台（苏净SW-CJ）、CO2培养箱（Thermo 3100）、倒 置显微镜（德国LEICA公司）、超低温冰箱（中科美菱DW-HL388）、电冰箱（海尔BCD-257F）、液氮柜（MVE CRYOSYSTEM 6000）、低速离心机（SCILOGEX DM0412）、手术器械、培养皿、培养瓶、离心管、移液管、吸头等。 1.3 主要试剂N utriStem® MSC XF Basal Medium间充质干细胞无血清培养基、MSC attachment solutionMSC促贴壁试剂、Recombinant Trypsin EDTA Solution重组胰酶、青链双抗、DPBS不含钙、镁和酚红，MSC go Chondrogenic XFTM 成人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基试剂盒、成软骨 诱导分化培养基试剂盒、成脂诱导分化培养基试剂盒以上均为BI公司；PE Mouse Anti-Human CD29 Clone MAR4、CD44 Clone515、CD90 Clone
不同分离方法及培养条件对人脐带间充质干细胞生物活性的影响
不同分离方法及培养条件对人脐带间充质干细胞生物活性的影响 人脐带间充质干细胞（Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一种来源于人类脐带间充质组织的多能干细胞，具有很强的自我更新和多向分化能力。 WJ-MSCs在干细胞治疗、再生医学以及组织工程等领域具有广阔的应用前景。在临床应用中，WJ-MSCs的分离和培养条件对其生物活性可能产生影响。本文旨在探讨不同分离方法及培养条件对WJ-MSCs生物活性的影响。 一、不同分离方法对WJ-MSCs生物活性的影响 1.1 酶解法分离 酶解法是目前分离WJ-MSCs最常用的方法之一。其步骤主要包括切碎脐带样本、用胰酶或胰蛋白酶对组织进行酶解、过筛筛选WJ-MSCs。酶解法分离的优点是分离效率高，但可能对WJ-MSCs的表面标记物和细胞形态产生影响，进而影响WJ-MSCs的生物活性。 1.3 不同分离方法对WJ-MSCs生物活性的比较 一项研究对比了酶解法和机械法对WJ-MSCs生物活性的影响，结果显示机械法分离的WJ-MSCs在表面标记物的表达和多向分化能力上均优于酶解法分离的WJ-MSCs。机械法分离在临床应用中可能更有利于保持WJ-MSCs的生物活性。 2.1 不同培养基对WJ-MSCs生物活性的影响 培养基中的成分对WJ-MSCs的生物活性具有重要影响。一般来说，培养基中含有较高浓度的胎牛血清或胎牛血清替代物、生长因子和细胞因子等成分，能够更好地维持 WJ-MSCs的生物活性。 2.2 氧气浓度对WJ-MSCs生物活性的影响 WJ-MSCs在体内生存环境中处于较低氧气浓度环境下，因此较低氧气浓度对WJ-MSCs 的生物活性更有利。一项研究表明，在较低氧气浓度条件下培养的WJ-MSCs更具有自我更新和多向分化能力。 三、结论与展望 通过上述分析可以得出，不同分离方法和培养条件对WJ-MSCs的生物活性具有重要影响。在临床应用中，应优先考虑采用机械法分离WJ-MSCs，并在含有较高浓度胎牛血清或胎牛血清替代物、适宜培养基和较低氧气浓度的条件下进行培养，以保持WJ-MSCs的生物活性。对于WJ-MSCs的分离和培养条件，仍有许多问题有待解决，例如如何更好地保持WJ-MSCs的生物活性、如何提高其多向分化潜能等，这需要进一步深入研究。希望本文能为相关研究和临床应用提供一定的参考价值。
不同来源间充质干细胞条件培养基对内源性衰老细胞作用的比较
不同来源间充质干细胞条件培养基对内源性衰老细胞作用的比 较 郑桂纯;赵姝灿;黄丽贞;张晓芳;王丙云;陈胜锋;陈志胜 【摘要】背景:随着经济的发展,人们对美的追求越来越高,抗衰老研究成为当今的 研究热点.干细胞是具有自我更新能力和多向分化能力的细胞,间充质干细胞是其中 的一种.研究表明间充质干细胞能通过旁分泌作用修复损伤衰老的细胞,但对于不同 来源间充质干细胞条件培养基的抗皮肤衰老作用研究甚少.目的:比较人脂肪、羊水、胎盘、脐带来源间充质干细胞条件培养基对自然衰老皮肤成纤维细胞的抗衰老作用.方法:制备人脂肪、羊水、胎盘、脐带4种不同来源的间充质干细胞条件培养基,添加到自然衰老皮肤成纤维细胞中,采用CCK-8法检测细胞活力、β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老率、DCFH-DA探针检测活性氧含量以及qPCR检测p16、 p53、COL1、KLOTHO基因表达量.结果与结论:①4种间充质干细胞条件培养基 均能提高皮肤成纤维细胞的活力,其中脂肪间充质干细胞条件培养基的效果最好,β-半乳糖苷酶染色率最低;②4种间充质干细胞条件培养基均能降低活性氧含量,脂肪 和羊水来源间充质干细胞条件培养基组的活性氧含量最低;③p16和p53在胎盘和脐带间充质干细胞条件培养基组的表达均高于对照组,在羊水来源间充质干细胞条 件培养基组的表达较低,脂肪间充质干细胞条件培养基组p16表达显著低于对照组,但p53的表达较高;④COL1基因表达除羊水间充质干细胞条件培养基组外,其他3 组均显著高于对照组,KLOTHO基因表达除胎盘间充质干细胞条件培养基组外,其他3组均显著高于对照组,且脂肪间充质干细胞条件培养基组的表达最高;⑤结果显示,4种不同来源间充质干细胞条件培养基能在一定程度上延缓细胞衰老,但作用效 果存在差异,其作用机制还有待进一步研究.
不同培养方法对人脐带间充质干细胞的影响
不同培养方法对人脐带间充质干细胞的影响 刘奉;蒋祥林;刘明明 【期刊名称】《中国组织工程研究》 【年(卷),期】2016(020)028 【摘要】背景：脐带干细胞培养主要来源于足月儿,常用培养方法包括组织贴块法、胰酶消化法,但是对于不同培养方法对脐带间充质干细胞的分离结果尚存在较大的 争议。目的：观察不同培养方法对脐带间充质干细胞的影响。方法：取30例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织贴壁法和胶原酶-胰酶消化法进行培养,制备细胞悬液,获得人脐带间充质干细胞进行分离培养,在流式细胞仪上测定细胞生长情况。 结果与结论：（1）细胞融合情况：脐带经过组织贴壁法原代培养5 d后,细胞开始从脐带组织分离,呈现梭形,培养10 d后细胞融合达到80%,脐带经胶原酶-胰酶消 化法培养5 d后,可见少量形态各异的贴壁细胞分布,纤维样细胞培养2周后培养融合才达到80%;（2）细胞生长情况：两种不同培养方法分离出的脐带间充质干细 胞生长情况差异无显著性意义（P〉0.05）;（3）细胞鉴定结果：两种培养方法培 养的细胞CD13,CD29,CD44及CD105标志物表达均为阳性。（4）结果说明： 人脐带间充质干细胞采用组织贴壁原代培养法培养成功率高,优于胶原酶-胰酶消化法培养。 【总页数】6页(P4136-4141) 【作者】刘奉;蒋祥林;刘明明 【作者单位】[1]重庆三峡医药高等专科学校,重庆市404020;[2]重庆医科大学基础医学院,重庆市400016
【正文语种】中文 【中图分类】R394.2 【相关文献】 1.不同培养方法对人脐带间充质干细胞的影响 [J], 刘奉;蒋祥林;刘明明 2.不同低氧浓度对人脐带间充质干细胞向神经细胞分化的影响 [J], 罗芸;马俊;钱前;张富婷;王晓辉 3.不同低氧浓度对人脐带间充质干细胞向神经细胞分化的影响 [J], 罗芸; 马俊; 钱前; 张富婷; 王晓辉 4.不同分离方法及培养条件对人脐带间充质干细胞生物活性的影响 [J], 徐斌; 刘毅 5.不同胎牛血清浓度培养的人脐带间充质干细胞的条件培养基对角膜上皮细胞损伤修复的影响 [J], 潘华婴;赵成海;魏文斌 因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买
不同培养基培养脐血间充质干细胞的比较
不同培养基培养脐血间充质干细胞的比较作者：王丽娟 来源：《赤峰学院学报·自然科学版》 2011年第7期 王丽娟 （赤峰学院医学院，内蒙古赤峰 024000） 摘要：比较不同密度下DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基培养脐血间充质干细胞的效果,发现应用IMDM培养基以2.0×106个细胞/ml的密度接种在培养瓶底可以完全铺层,而且加入碱性成纤维细胞因子可以显著加快脐血间充质干细胞的贴壁、伸展和铺层的速度. 关键词：脐血间充质干细胞；培养基；生长过程 中图分类号：R329 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2011）07-0037-02 实验证明间充质干细胞（MSC）存在于身体的很多部位，骨髓和脐血是间充质干细胞的最主要来源.体外分离培养骨髓间充质干细胞已被广泛应用于各研究领域，而对人脐血中的MSC的研究尚处于起步阶段.在培养方面还没有统一的方法,培养的方案也各不相同.本试验分别应用DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基对脐血单个核细胞进行培养，比较不同细胞密度下各种培养基培养脐血MSC的效果，并对培养出的脐血MSC的生长过程进行了研究. 1 材料和方法 1.1 脐血 新鲜脐血由赤峰学院附属医院提供.在征得产妇同意后，无菌条件下采集新生儿脐血，用肝素抗凝. 1.2 脐血MSC的分离和培养 取血后12h内,用Ficoll-Hypaque分离液分离单个核细(MNC),并用PBS培养液洗涤3次,然后分别用含20%的胎牛血清(杭州四季青)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的IMDM 完全培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的DMEM-LG培养基、含10%的胎牛血清和 20μg/L的bFGF的DMEM-HG培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的α-MEM培养基调整细胞密度，每种培养基各自调整的密度分别为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0×106/ml,种植于培养瓶中,然后于5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养. 2 结果 2.1 不同培养条件对脐血间充质干细胞的贴壁、生长的影响 在使用同一批号血清的情况下，几种培养基培养脐血间充质干细胞的情况如下：DMEM-LG 培养基和DMEM－HG培养基有大量的细胞贴壁，但贴壁的细胞形状多样，有圆形、椭圆形、多角形等不规则形状，生长缓慢，随着培养天数的增加，贴壁的细胞都脱落下来.α-MEM培养基仅有少量的细胞贴壁，且贴壁的细胞是圆形或椭圆形，扁平的，几乎无生长，随着培养天数的增加，也都脱落下来.IMDM培养基培养出的细胞呈纤维状，形成克隆，并逐渐扩张.
脐带间充质干细胞制备操作规程
1. 制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段。去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml。充分剪碎后平■分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中。静置培养7天。第8天根据生长情况，进行换液、传代。 2. 换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液。用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，丁培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基。 3. 传代：每瓶加0.25%胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液（2% FBS+a-MEM10ml,吸出细胞悬:液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml 生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中。1200rpm,离心6min,弃上活。合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬:，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数。根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1~2X 14/ml，置37 C、5%CO2培养箱中培养。 4. 收获：每瓶加入3ml 0.25%胰酶，37C消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中。1200转/min离心6min,弃上活，细胞沉淀用16ml生理盐水悬:浮，混匀取1ml 做计数和流式检测。加生理盐水至40ml，取500H 1上活做内蠹素检测， 1200rpm，离心6min。弃上活，离心沉淀用2.5ml FBS悬浮，再缓慢加入2.5ml 冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml。冻存细胞数应控制在2~5X 10/ml 范围内。利用程序降温盒放置-80C医用冰箱中过夜后转至液氮罐。
体外培养的脐血间充质干细胞的生物学特性及影响因素
体外培养的脐血间充质干细胞的生物学特性及影响因素 作者：王正辉等 来源：《中国美容医学》2012年第15期 脐血间充质干细胞是一类从脐带血中分离和培养的成体干细胞，具有高度自我更新和多向分化的潜能。脐血间充质干细胞的这些特性，吸引了众多国内外学者的目光，目前，脐血间充质干细胞移植的临床治疗取得了一定进展。本文就脐血间充质干细胞的采集分离、纯化及生物学特性及研究前景作一简要综述。 脐带血是指胎儿娩出，脐带结扎，残留在脐带和胎盘靠近胎儿段内的血液。脐带血中含有两种干细胞：造血干细胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）和间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）。脐带血造血干细胞异体移植后发生免疫排斥反应的可能性极低[1]，它已应用于临床治疗，主要用于治疗造血系统疾病（白血病、恶性淋巴瘤、骨髓瘤）、糖尿病、肝脏疾病等。间充质干细胞具有高度的自我更新和多向分化的潜能，这些特性近年来引起了国内外众多研究者的广泛关注。Lee等[2]将冷藏0.1～5年的脐血单个核细胞培养3～5周，获得贴壁的细胞呈现成纤维细胞样形态，并具有间充质细胞的免疫表型，表明可以长期冻存保存脐血间充质干细胞。2000年，Erices[3]首次报道脐血中含有间充质干细胞，其形态和免疫学表型和骨髓间充质干细胞相似。Karen [4]认为脐血间充质干细胞分离成功的关键在于：①从脐血中采集分离时间不超过15h；②脐血的量不少于33ml；③单个核细胞量不少于1×108个。但脐血间充质干细胞分离成功率低[5-6]，甚至有些学者认为脐血中没有间充质干细胞[7-9]。且随着胎龄的增加，脐血间充质干细胞的数量、生长活性及分离培养的成功率逐渐下降。 1 影响脐血间充质干细胞分离培养成功的因素 1.1 脐血的采集量：个体差异较大，与产妇分娩的方式、采集者操作水平等因素有关，脐血采集量越大、分离的成功率越高。 1.2采集到分离的时间：要求24h内完成分离接种，时间越短分离培养的成功率越高。 1.3 分离方法及培养条件的优化：目前脐血间充质干细胞的分离，完全套用骨髓间充质干细胞的分离方法，这可能是导致脐血间充质干细胞分离成功率低的重要原因之一。国内外众多学者对脐血间充质干细胞培养条件进行优化，但由于条件的限制，尚无统一的评价标准，难以进行比较。 1.4首次接种密度：接种密度过大，细胞接触抑制，生存空间不足，培养基中的营养成分消耗过快；密度过低无法形成细胞生长所需的环境或者原代细胞发生老化。