小鼠外周血白细胞使用说明
小鼠外周血白细胞
小鼠外周血白细胞产品说明：
为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠外周血白细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠外周血白细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
小鼠外周血白细胞注意事项：
1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
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人外周血白细胞DNA提取标准操作规程(SOP)
人外周血白细胞DNA提取标准操作规程(SOP) （血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)） 1实验原理 本法采用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)，从全血中分离白膜层，去除其中的红细胞及蛋白质，裂解白细胞释放DNA，再通过去除DNA中的杂质使其纯化，得到高纯度的DNA原液，最后使用微量紫外可见分光光度计对DNA 的浓度及纯度进行定量检测。 2实验仪器 EP管 微量移液器，10μL、50μL、200μL、1000μL 涡旋振荡器 数显恒温搅拌循环水箱 吸附柱CB3 收集管 离心机 涡旋振荡器 微量紫外可见分光光度计（Thermo NanoDrop1000） 3实验试剂 正常人混合血液，应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。 红细胞裂解液（裂解红细胞） 缓冲液GA（轻微裂解作用，为蛋白激酶K提供反应环境），若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。 蛋白激酶K（裂解蛋白质） 缓冲液GB（裂解白细胞，释放DNA），若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。 无水乙醇（沉淀DNA，去除杂质） 缓冲液GD（去除蛋白质），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。缓冲液PW（去除盐），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。 洗脱缓冲液TE（保存DNA） 4实验步骤 样品的采集与保存：用装有EDTA的塑料管采集2mL静脉血，2000rpm离心 5min，可见分层，分别为血浆层、白膜层、红细胞，将血浆吸出弃去，再通过点吸的方式将白膜层全部吸出，置于干净的EP管备用。如无法及时提取DNA，则应置于-80℃进行保存。 样品预处理：
外周血单个核细胞的分离(优质参考)
实验二十四外周血单个核细胞的分离 (Separation of mononuclear cell in peripheral blood) 免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。 【实验原理】 血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。 【主要试剂和器材】 1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。 2.5g/L台盼蓝。 3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。 4.Hank,s液。 5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。 6.水平离心机、显微镜。 【操作方法】 1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hank,s液混匀。 2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。 3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。 4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。 5. 用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。 6.加入4倍量以上的Hank,s液，充分混匀，1000r／min离心l0min。离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。 7.用含10%～20%灭活小牛血清的Hank,s液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。【结果判断】 【注意事项】 1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。 2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(18～25℃)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。
血液中的白细胞有五种
血液中的白细胞有五种，按照体积从小到大是：淋巴细胞，嗜碱性粒细胞，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞和单核细胞。 白细胞是无色有核的血细胞，在血液中一般呈球形，根据形态差异可分为颗粒和无颗粒两大类。颗粒白细胞（粒细胞）中含有特殊染色颗粒，用瑞氏染料染色可分辨出三种颗粒白细胞即中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。 中性粒细胞具有变形运动和吞噬活动的能力，是机体对抗入侵病菌，特别是急性化脓性细菌的最重要的防卫系统。当中性粒细胞数显著减少时，机体发生感染的机会明显增高。嗜酸性粒细胞具有粗大的嗜酸性颗粒，颗粒内含有过氧化物酶和酸性磷酸酶。嗜酸性粒细胞具有趋化性，能吞噬抗原抗体复合物，减轻其对机体的损害，并能对
抗组织胺等致炎因子的作用。嗜碱性粒细胞中有嗜碱性颗粒，内含组织胺、肝素与5-羟色胺等生物活性物质，在抗原－抗体反应时释放出来。在人体的正常粪便中偶尔能见到少许白细胞，所以粪便检查中白细胞的多少可以作为肠道是否有炎症的一种依据，无颗粒白细胞无细胞质颗粒，但有圆形细胞核，包括单核细胞和淋巴细胞。单核细胞是血液中最大的血细胞。目前认为它是巨噬细胞的前身，具有明显的变形运动，能吞噬、清除受伤、衰老的细胞及其碎片。单核细胞还参与免疫反应，在吞噬抗原后将所携带的抗原决定簇转交给淋巴细胞，诱导淋巴细胞的特异性免疫反应。单核细胞也是对付细胞内致病细菌和寄生虫的主要细胞防卫系统，还具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力。淋巴细胞则为具有特异性免疫功能
的细胞。T淋巴细胞主要参与细胞免疫反应而B 淋巴细胞参与体液免疫反应。 成年人白细胞数为每立方毫米5000～9000单位，其中中性粒细胞占0.50～0.70，嗜酸性粒细胞占0.005～0.05，嗜碱性粒细胞占0.005～0.01，单核细胞占0.03～0.08，淋巴细胞占0.20～0.40。幼儿血液中白细胞数高于成年人。不同生理状态（如妊娠期）会引起白细胞数量的变化。有炎症时，血中的白细胞数明显增加。各类白细胞的防御保护作用各不相同。 瑞氏染色外周血五种白细胞形态特征：细胞类型大小（μm）外形细胞核细胞质功能核形染色质着色颗粒中性杆状核粒细胞10～15 圆形弯曲呈腊肠样，两端钝圆深紫红色粗糙淡橘红色量多，细小，均匀布满胞质，浅紫红
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤离心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%～95%，细胞获得率可达80%以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。 ●人外周血单核细胞（PBMC）分离及培养 PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。 Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 ●工具／原料 全血（以10ml为例） 无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水 蔗糖溶液（FicollPague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02) RPMI 1640培养基（Invitrogen） 胎牛血清（FBS）（GIBCO） 双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO) 二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
人外周血单核细胞分离技术
人外周血单核细胞分离 1.抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血 A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min 离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10?12.5 mL 。 2.沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀 A中的细胞中加入Hank s液（不含Ca2+、Mg 2+, pH 7.2 ?7.6）体积比仍未1:1 , 混匀，制成细胞悬液。 B:无菌抗凝血与Hank s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。 另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处 将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液 分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。 管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台 单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞 沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜 3.单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的 2 / 3。混匀后离心1500r/mi n 离心 10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。 注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。 再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min 离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hank s液（或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640 液3?4 mL）重新混悬细胞37 C、5% C02孵育箱中培养2?3 h 后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640
小鼠外周血白细胞使用说明
小鼠外周血白细胞 小鼠外周血白细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠外周血白细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠外周血白细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠外周血白细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠外周血白细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
白细胞
白细胞 科技名词定义 中文名称： 白细胞 英文名称： leukocyte;white blood cell;leucocyte 定义1： 淋巴细胞、多形核粒细胞和单核细胞的总称。 所属学科： 免疫学(一级学科) ；免疫系统(二级学科) ；免疫细胞(三级学科) 定义2： 血液中除红细胞和血小板外的各种血细胞。包括淋巴细胞、多形核粒细胞和单核细胞。 所属学科： 细胞生物学(一级学科) ；总论(二级学科) 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 白细胞旧称白血球。血液中的一类细胞。白细胞也通常被称为免疫细胞。人体和动物血液及组织中的无色细胞。有细胞核，能作变形运动。白细胞一般有活跃的移动能力，它们可以从血管内迁移到血管外，或从血管外组织迁移到血管内。因此，白细胞除存在于血液和淋巴中外，也广泛存在于血管、淋巴管以外的组织中。 目录[隐藏] 医学术语 白细胞的观察 白细胞的分类 白细胞的功能 白细胞减少症 白细胞临床意义 白细胞计数（WBC） 白细胞数量的提高 医学术语 白细胞的观察 白细胞的分类 白细胞的功能 白细胞减少症 白细胞临床意义 白细胞计数（WBC）
白细胞数量的提高 [编辑本段] 医学术语 【白细胞】 leucocyte 简称WBC（white blood cell） 补充介绍：（本资料为非专业资料，适合非专业人员阅读） 1单位：个/升（个/L） 2正常值范围：（单位为*10^9个/L） （1）成人为4.0到10.0 （2）新生儿为15到20 （3）6个月到2岁为11到12 （4）4到14岁为8 3临床意义： （1）增多：常见于急性细菌性感染、严重组织损伤、大出血、中毒和白血病等。 (2)减少：镇痛药、磺胺类药的服用；病毒感染；免疫系统衰弱；放化疗的影响。[编辑本段] 白细胞的观察 白细胞无色呈球形，有细胞核，体积比红细胞大，直径在7～20μm之间。正常人 白细胞计数在4000～10000个/mm3范围内，平均为7000个/mm3。血涂片中白细胞，经复合染料染色后，可根据其形态差异和细胞质内有无特有的颗粒可分为两大类五种细胞。 白细胞观察实验：慢慢移动血片，观察各种白细胞，白细胞数目虽然少，寻找较困难，但胞体大、细胞核明显，极易与红细胞区别开。 白细胞描述：数目少，胞体大，细胞核明显凸起。[1] [编辑本段]
小鼠骨髓间充质干细胞培养
小鼠骨髓间充质干细胞培养 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。 实验准备： 1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。 2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器 操作步骤 1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养 取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5?2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每两天换液1次，并观察细胞形态。待细胞长至80%-85%时传代（1传2） 2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速。 采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。 分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs 获得或失去这些表面标记物的表达。
白细胞五分类原理和散点图特征
血细胞仪白细胞五分类法原理和散点图特征2008-12-14来源:检验世界网浏览:5747次转发至：我要评论【字号：大中小】 核心提示：本文主要介绍全自动血细胞分析仪在白细胞五分类上的原理和散点图分布特点。此类仪器在红细胞、血红蛋白、血小板和计算参数上一般会采用类似的测定原理和计算方法，此类仪器的进展和其功能特点可参考作者撰写的其它文章。赞 北京协和医院检验科张时民检验地带网 血细胞分析技术已经进入自动化时代，而具有白细胞五分类或更多分析参数的仪器也普遍的应用于国内各级医院实验室中，为临床诊断和治疗服务。而具有18项参数带有白细胞三分群功能的血细胞分析仪也已经普及进入到基层医院和社区医疗中心，在许多大型医院中已不占主流位置，因此可以说目前在较大医院的检验科，常规血细胞分析仪已经进入全自动化和白细胞五分类的时代。 本文主要介绍全自动血细胞分析仪在白细胞五分类上的原理和散点图分布特点。此类仪器在红细胞、血红蛋白、血小板和计算参数上一般会采用类似的测定原理和计算方法，此类仪器的进展和其功能特点可参考作者撰写的其它文章（见参考文献）。具有白细胞五分类功能的血细胞分析仪器是指通过各种物理和化学技术对白细胞进行分析，以获得外周血液中白细胞的五种常见类型，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞的百分率和绝对值的测定结果，此外还应该具有对出现异常白细胞的提示或初步分类功能。 目前国内外具有开发研制白细胞五分类法仪器的主要为欧美和日本生产厂商，比较着名的欧美厂家有Beckman-Coulter；ABBOTT；Siemens（Bayer）；ABX；日本有Sysmex 和NihonKohdon。在国内已经有迈瑞（MINDRAY）公司生产几个型号的五分类血细胞分析仪器投入医疗市场。 检验地带网 一简要发展史 1974年，一种名为HEMALOGD的具有初步白细胞分类功能的白细胞分析仪问世。1982年，Technicon公司生产了H6000型血液细胞分析仪器，应该是首款具有白细胞五分类能力的仪器。同时代日本日立公司推出图像分析法的白细胞分析仪HITACHI8200型，仅仅是用于完成白细胞血片分类的仪器，没有其他血细胞计数分析能力。Technicon公司1985年开发了比较成熟的具有白细胞五分类功能的TechniconH1型血液细胞分析仪，随后升级为H2型和H3型。 COULTER公司在1987年开发研制其经典VCS技术，并推出持续具有多年影响力的、具有白细胞五分类功能的血液细胞分析仪MAXM型。 1990年前后，欧洲和日本许多厂家都陆续推出了各种类型的具有白细胞五分类功能的血细胞分析仪器。各厂家设计生产的此类血细胞分析仪，其在白细胞分类技术上原理各不相同，分析测定项目略有不同，且形式多样，结构复杂，试剂种类和成分也趋于复杂。不断改进和升级的新产品使得仪器在白细胞分类技术上更加成熟和可靠。而技术的提高也带来了仪器和消耗品（试剂）价格的增加。 检验地带网 二仪器原理和散点图特点 1体积、电导和激光散射原理 这是Beckman－Coulter公司生产的血细胞分析仪所采用的经典分析方法，他集三种物理学检测技术于一体，在细胞处于自然原始的状态下对其进行多参数分析。该方法也称为体积、电导、激光散射血细胞分析法。此技术采用在标本中首先加入红细胞溶血
人外周血白细胞分离液使用说明
人外周血白细胞分离液使用说明 货号:P8670 规格：200ml/kit 保存：18℃-25℃避光保存，有效期两年。启封后置4℃保存，有效期一周。 一、分离方法说明及图例 A．取1ml新鲜抗凝血，与全血及组织稀释液1:1混匀后小心加于1份本分离液之液面上； B.以500g（约1800转/分）离心25分钟(半径15cm水平转子)。此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色的白细胞层。第三层；为略带混浊的分离液层（富集一定量的白细胞）。第四层；为红细胞层。弃去第一层血浆层，收集第二层细胞、第三层分离液层和第四层红细胞层，放入含细胞洗涤液10ml的试管中，充分混匀后，以500g 约（1800转/分）离心30分钟。沉淀经1次洗涤后用红细胞裂解液裂解红细胞，再经3次洗涤去除红细胞内溶物和碎片后取沉淀细胞即为所需白细胞。 注：提取率约为80%。 二、红细胞裂解液使用说明 红细胞裂解液用于从血液或组织细胞样品中裂解并去除无细胞核红细胞的溶液。不适用于禽类等有细胞核红细胞的裂解。本裂解液经过无菌处理，分离的细胞可以用于后续的原代培养、
细胞融合以及核酸或蛋白的提取及各种常规的分析和检测。 使用说明： A.对于组织细胞样品： a.新鲜组织经过胶原酶或胰酶等消化处理，通过适当方法分散成细胞悬液，离心弃上清。 b.加入3-5倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。如细胞沉淀的体积为1ml，则加入3-5ml的红细胞裂解液。 c.400-500g离心5分钟，弃红色上清。4℃离心效果更佳。 d.如果发现红细胞裂解不完全，可以重复上述步骤2和步骤3一次。通常极微量的红细胞不会影响后续的一些检测。 e.洗涤1-2次：加入适量PBS、HBSS、生理盐水或无血清培养液，重悬沉淀，400-500g离心2-3分钟，弃上清。可再重复1次，共洗涤1-2次。洗涤液的用量通常应至少为细胞沉淀体积的5倍。4℃离心效果更佳。 f.根据实验需要用适当溶液重悬细胞沉淀后即可进行计数等后续实验。 注：对于常规步骤，多一步洗涤过程中的离心，但可以节省洗涤液的用量，并且洗涤效果也更好一些，同时不需要大体积的离心管。快速步骤少了一次离心，但洗涤效果略差一些，同时需要大体积的离心管。 B.对于血液样品： a.取新鲜抗凝血，400-500g离心5分钟，离心弃上清。 b.加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，裂解1-2分钟。例如细胞沉淀的体积为1ml，则加入6-10ml的红细胞裂解液。本步骤在室温或4度操作均可。注意：对于鼠的血液，裂解1-2分钟已经足够，对于人的外周血，宜延长裂解时间至4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。
小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化方法(详细版)
小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化实验前准备： 超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、75cm2细胞培养皿、2mL注射器、无菌40μm尼龙过滤器、细胞吸管、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、红细胞裂解液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、M-CSF因子、细胞计数版、倒置显微镜等。 操作步骤： （1）C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒，固定小鼠。 （2）无菌条件下分离并取下小鼠的股骨和胫骨，小心不要打破骨头。然后放入事先含有75%酒精的75cm2的细胞培养皿中。 （3）移入生物安全柜中，进一步分离去除骨周围组织，然后将其移入含有1×PBS的另一细胞培养皿中清洗，最后再将其转移另一 75cm2细胞培养皿（含有1%双抗的DMEM的细胞培养基）中等待下一步处理。（4）用眼科组织剪去除股骨和胫骨的骨两端，然后含有2ml DMEM 细胞培养基的注射器从骨的一个断端冲洗骨髓细胞到10ml无菌离心管中，重复 3 次。 （5）1500r/min，离心 8min，弃上清液。 （6）加入5ml红细胞裂解液，吸管反复吹打，然后静置 3min。（7）1500r/min，离心 8min，弃上清液。 （8）加入5ml DMEM 细胞培养基重悬细胞，然后用40μm尼龙过滤器过滤细胞。
（9）1500r/min，离心 8min，弃上清液，重复 3 次。 （10）a 加入含有 20%FBS/ DMEM 的细胞培养液重悬细胞，到该步骤提取完毕。b 加入含有 20ng/ml的 M-CSF 的 20%FBS/ DMEM 细胞培养液重悬细胞，诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞。细胞计数，调整细胞浓度至1×106／mL。接种75cm2细胞培养皿中。 （11）放于37℃、5％二氧化碳饱培养箱中培养，待后续实验研究。
白细胞计数和白细胞分类
实用标准文案 白细胞计数和白细胞分类 显微镜下计数一定体积内将全血用稀酸溶液稀释一定倍数并破坏红细胞后充入血细胞计数池内，原理一) ( 的白细胞数，经换算求出每升血液内的白细胞数。 显微镜计数法)方法 (二 参考值(三) 白细胞计数 109/L ×成人 4~10 109/L ×新生儿 15~20 白细胞分类 1%~5% 中性杆状核粒细胞 50%~70% 中性分叶核粒细胞 0.5%~5% 嗜酸性粒细胞 0%~1% 嗜碱性粒细胞 20%~40% 淋巴细胞 3%~8% 单核细胞 临床意义(四) ，因此它的数由于中性粒细胞在白细胞中所占百分率最高 (50%~70%)1.中性粒细胞增多、减少的临床意义值增减是影响白细胞总数的关键。 (1)中性粒细胞增多 ，分娩时疼痛和产伤可使其 109/L15×个月以上白细胞增多可达①生理性增多见于胎儿、新生儿，妊娠5 剧烈运动、严寒、暴热等刺激也可见白细胞增多。2症于产后周左右恢复正常;10进一步增高，如无合并 系边缘池内的白细胞过多地进入循环池所致，以上一过性白细胞增多在去除影响因素后不久则可恢复正常，而持续时间较长的白细胞增多则与贮备池加快释放等有关。精彩文档． 实用标准文案 ②病理性增多 反应性增多A. 最常见于急性化脓菌感染，如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等。其白细胞总数的增高视感染范围、严重程中度轻度感染时白细胞总数可正常，分类时可见中性粒细胞百分率增高;.度及机体反应性如何而有所不同并出现个/L并可伴轻度核象左移；重度感染时白细胞明显增高常>20×109感染时白细胞多>l0×109个/L明显的核象左移。感染过于严重如感染中毒性休克或机体反应性较差时白细胞可不增高反而减低但伴有严重的核象左移。 严重的组织损伤如严重的烧伤、机械性损伤、较大手术后、心肌梗塞等均可见白细胞增高，并可借此来区别心梗与心绞痛。 ，×109/L)破裂或宫外孕破裂所致大出血，此时白细胞可迅速增高，达20大量血细胞破坏内脏(如肝、脾且可出现于血红蛋白降低之前。 尿毒症等也代谢性中毒如糖尿病酮症酸中毒、急性中毒见于急性化学药物中毒如安眠药、有机磷等中毒；增多。(中性粒细胞)常见白细胞
人体白细胞的种类和功能精编版
人体白细胞的种类和功能 人体内白细胞为无色有核细胞，在血液中呈球形，它能以变形运动穿过毛细血管壁，进入结缔组织。正常5000—10000/mm3。 一、种类及特点 根据细胞质和细胞核的染色特点，可把白细胞分为两大类： 有颗粒白细胞：嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞 无颗粒白细胞：淋巴细胞，单核细胞 正常时各种白细胞数目保持一定比例，称为白细胞分类计数，正常情况下数目如下： 疾病状况下，白细胞总数和分类计数都可发生改变。 二、白细胞的功能 ①中性粒细胞白细胞: 吞噬和消化侵入微生物和机体本身的各种坏死细 胞,包括衰老和受损红细胞.是机体防御功能重要组成部分。细胞内溶酶体丰富，并做变形运动。 中性粒细胞可通过变形运动渗出毛细血管壁进入组织液,在组织液内游走(趋化性)。如果白细胞的的溶酶体释放的酶量过多，不仅能杀死和溶解细菌，本身也将致死，死亡的白细胞连同细菌分解物一起成为浓液组成部分。 ②嗜酸性粒细胞：能限制嗜碱性粒细胞和肥大细胞中的活性物质的合成和释放；当机体患某些过敏性疾病时，嗜酸性粒细胞数量增多，有人认为她和机体的过敏性反应有关。 ③嗜碱性粒细胞：含有多种生物活性物质，与肥大细胞相似，细胞颗粒中能合成组织胺和过敏性慢作用物质。
组织胺：使小动脉和毛细血管扩张，并使毛细血管和微静脉通透性增加，与人过敏反应有关。 过敏性慢作用物质：可使血管通透性增加，并使平滑肌收缩，特别是使支气管和细支气管的平滑肌收缩，从而引起哮喘。总括起来嗜碱性粒细胞所释放的活性物质可引起哮喘，寻麻疹，食物过敏等各种反应，同时又引起嗜碱性粒细胞聚集这一局部。 ④淋巴细胞：具有免疫功能 T细胞：骨髓中生成的淋巴系干细胞在胸腺中发育成熟，参与细胞免疫。血液中80-90% 淋巴细胞属于T淋巴细胞。 B细胞：造血干细胞在骨髓中分裂分化成B细胞，多集中在淋巴结等淋巴器官中。参与体液免疫—抗体免疫。 ⑤单核细胞：从血管进入组织后，便分化成巨噬细胞，吞噬细菌和病毒等 三、白细胞测定临床意义 （一）白细胞增加：外周血液中白细胞数超过10×109/L称为白细胞增多症。白细胞增多可以是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞增多。临床常见为淋巴细胞增多症。 1、中性粒细胞增多症 生理性：如饭后和剧烈运动后；冷水浴后及极度恐惧和疼痛后等、妇女经期及妊娠等。 病理性： （1）急性感染：某些细菌（葡萄球菌、肺炎球菌等）病毒（水痘病毒、狂犬病毒）引起的感染； （2）非感染性炎症，如急性风湿热、少年型类风湿关节炎等 （3）组织坏死：严重外伤、手术创伤、烧伤等。 （4）急性失血及贫血 （5）急性中毒：如化学毒物及药物中毒、尿毒症等。 （6）粒细胞异常增生：急性粒细胞白血病，骨髓增生性疾病 （7）其他：如脾脏切除后。 2、嗜酸性粒细胞增多症 外周血中嗜酸性粒细胞绝对值超过0.45×109/L,称为嗜酸性粒细胞增多症. 嗜酸性粒细胞增多常与许多疾病有关，特别是寄生虫感染和过敏性疾病。 ３、白血病 是骨髓和其他造血组织中原始和幼稚细胞异常增生的一种恶性疾病。临床表 现贫血、出血、感染及白血病细胞侵润机体各组织、器官所产生的相应表现。 ⑴病因： 病毒：人类T细胞白血病，已肯定是由人T细胞病毒-Ⅰ引起的 放射性核素：其致白血病的作用是肯定的，其作用与照射剂量的大 小和部位有关 化学因素：（如烷化剂、细胞毒药物）及化学毒物（苯）可诱发 遗传因素：家族性白血病约占7%。 其他血液病：骨髓增生性疾病、淋巴瘤等最终可发展为急性白血病。 ⑵分类： 按病程缓急及白细胞分化程度可分为 急性白血病：起病急，自然病程约半年以内。骨髓中以原始和早期幼稚细 胞增生为主，正常造血受到抑制的恶性疾病。成人以急性粒细胞白血病多见，儿童以急性淋巴细胞较多见。临床表现主要为贫血、出血、继发感染发热及白血病细胞侵润
人外周血白细胞分离液试剂盒
人外周血白细胞分离液试剂盒 规格：200mL/kit 保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 试剂盒组成： 各种动物外周血白细胞分离液 200mL 细胞洗涤液 200mL 红细胞裂解液100mL 操作步骤： 1.取新鲜抗凝全血（EDTA 、枸橼酸钠或肝素抗凝均可）或者去纤维蛋白血液。 2.在离心管中加入适量分离液（血液体积小于5mL 时，加入5mL 分离液；大于等于5mL ，加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管 吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差 异，将形成明显的分层界面。如果样品较多，加样的时间较长，在 离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。） 3.室温，水平转子500~1000g ，离心20~30min （血液的体积越大所 需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转 速最大不超过1200g ）。 4.离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层；血浆与分离 液之间是淋巴细胞层；分离液中为粒细胞层（个体差异或者是分离 条件不同，粒细胞层可能分离不明显）；最下层为红细胞层。 5.小心的吸取淋巴细胞层及分离液层细胞到15mL 洁净的离心管 中，10mL PBS 或细胞洗涤液洗涤细胞。250g ，离心10min （如有红 细胞混杂则加入适量红细胞裂解液） 6.弃上清，5mL 的PBS 或细胞清洗液重悬细胞，250g ，离心10min 。 7.重复步骤6 8.弃上清，细胞重悬备用。注意事项： A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。。 B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。 C.血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2h 以内），为保持淋巴细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。 D.血液样本不需稀释，直接进行分离即可。 E.稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca 、Mg 离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，分离示意图 血浆层红细胞层淋巴细胞粒细胞分离液层
常见细胞系
细胞株名称ATCC 编号细胞来源细胞种类生长状态使用培养基 293 CRL-1573 人胎肾贴壁、上皮样MEM/NEAA,10%FBS 2215 无人肝癌贴壁、上皮样DMEM,15%FBS 127TAg CRL-2817 小鼠多能胚胎干细胞胚胎型DMEM, 10% FBS 293/CHE-Fc CRL-2368 人肾上皮细胞、贴壁DMEM,10%FBS 3T3-L1 CL-173 小鼠胚胎成纤维成纤维DMEM,10%FBS 3T6 CCL-96 小鼠胚胎成纤维细胞、贴壁DMEM,10%FBS A431 CRL-1555 人表皮细胞癌上皮细胞、贴壁DMEM,10%FBS A549 CCL-185 人肺癌贴壁、上皮样F12,10%FBS A9 CRL-6319 小鼠结缔组织成纤维细胞、贴壁DMEM,10% FBS+ AR42J CRL-1492 大鼠胰腺肿瘤贴壁、上皮样Ham'sF-12K, 20%FBS AtT-20 CCL-89 小鼠垂体肿瘤上皮细胞、贴壁F-10, 15% HS和2.5% FBS B95-8 CRL-2311 绒猴EB病毒感染的白血病细胞成淋样RPMI-1640, 10% FBS BALB/3T3 CCL-163 小鼠胚胎成纤维细胞、贴壁DMEM, 10% FBS bel7402 无人肝癌贴壁、上皮样RPMI-1640,15%FBS BeWo CCL-98 人绒毛癌上皮细胞、贴壁F-12K, 15%F12 BHK-21 CCL-10 仓鼠肾成纤维细胞、贴壁MEM/NEAA, 10% FBS BHL-100 无人乳房上皮细胞、贴壁McCoy'5A, 10% FBS BRL 3A CRL-1442 大鼠肝上皮细胞、贴壁MEM/NEAA, 10% FBS BT CRL-1390 牛鼻甲骨细胞成纤维细胞、贴壁DMEM, 10% FBS Caco-2 HTB-37 人结肠腺癌上皮细胞、贴壁MEM/NEAA, 10% FBS Chang 无人肝脏上皮细胞、贴壁BME, 10% FCS
血细胞仪白细胞五分类法原理和散点图特征
北京协和医院检验科张时民 血细胞分析技术已经进入自动化时代，而具有白细胞五分类或更多分析参数的仪器也普遍的应用于国内各级医院实验室中，为临床诊断和治疗服务。而具有18项参数带有白细胞三分群功能的血细胞分析仪也已经普及进入到基层医院和社区医疗中心，在许多大型医院中已不占主流位置，因此可以说目前在较大医院的检验科，常规血细胞分析仪已经进入全自动化和白细胞五分类的时代。 本文主要介绍全自动血细胞分析仪在白细胞五分类上的原理和散点图分布特点。此类仪器在红细胞、血红蛋白、血小板和计算参数上一般会采用类似的测定原理和计算方法，此类仪器的进展和其功能特点可参考作者撰写的其它文章（见参考文献）。具有白细胞五分类功能的血细胞分析仪器是指通过各种物理和化学技术对白细胞进行分析，以获得外周血液中白细胞的五种常见类型，嗜中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞的百分率和绝对值的测定结果，此外还应该具有对出现异常白细胞的提示或初步分类功能。目前国内外具有开发研制白细胞五分类法仪器的主要为欧美和日本生产厂商，比较著名的欧美厂家有Beckman-Coulter；ABBOTT；Siemens（Bayer）；ABX；日本有Sysmex和Nihon Kohdon。在国内已经有迈瑞（MINDRAY）公司生产几个型号的五分类血细胞分析仪器投入医疗市场。 一简要发展史 1974年，一种名为HEMALOG D的具有初步白细胞分类功能的白细胞分析仪问世。 1982年，Technicon公司生产了H6000型血液细胞分析仪器，应该是首款具有白细胞五分类能力的仪器。同时代日本日立公司推出图像分析法的白细胞分析仪HITACHI 8200型，仅仅是用于完成白细胞血片分类的仪器，没有其他血细胞计数分析能力。 Technicon 公司1985 年开发了比较成熟的具有白细胞五分类功能的Technicon H1 型血液细胞分析仪，随后升级为H2型和H3型。 COULTER公司在1987 年开发研制其经典VCS技术，并推出持续具有多年影响力的、具有白细胞五分类功能的血液细胞分析仪MAXM 型。 1990年前后，欧洲和日本许多厂家都陆续推出了各种类型的具有白细胞五分类功能的血细胞分析仪器。各厂家设计生产的此类血细胞分析仪，其在白细胞分类技术上原理各不相同，分析测定项目略有不同，且形式多样，结构复杂，试剂种类和成分也趋于复杂。不断改进和升级的新产品使得仪器在白细胞分类技术上更加成熟和可靠。而技术的提高也带来了仪器和消耗品（试剂）价格的增加。 二仪器原理和散点图特点 1 体积、电导和激光散射原理 这是Beckman－Coulter公司生产的血细胞分析仪所采用的经典分析方法，他集三种物
外周血细胞形态检验
外周血细胞形态检验 1.外周血涂片检查步骤： （1）肉眼观察：涂片面膜大小、厚薄是否适中，染色好坏。（2）低倍镜观察全貌： ①涂片及染色好坏； ②了解白细胞数（可大体校对WBC直接计数是否正确）； ③了解白细胞大致分布及其各阶段大致比例，特别要注意由于涂片过力，把WBC及成熟粒细胞大多推于片尾部位，造成分类比值误差。片尾有无异常细胞。 ④选择具有代表性的细胞镜检区域。 （3）油镜观察：进行WBC分类计数，观察细胞形态、比例、有无巨大或异常细胞。 ①血涂片对WBC总数准确性估计：从低倍及油镜中估计WBC数及其分布。医|学教育网搜集整理一般区分WBC数几个等级（油镜视野中WBC密度、分散无重叠）。参见WBC形态诊断技巧节段。 ②白细胞分类计数：血中主要两大比例的中性成熟粒细胞与淋巴细胞及其他小比例细胞是否属正常范围及形态有 无异常。
③注意片尾端有无巨大或出现不成熟或异常细胞（如中晚幼粒、中晚幼红细胞、异常淋巴细胞、吞噬细胞、肿瘤细胞等）。 ④红细胞形态（群体、个体）、排列（重叠、缗钱状）。 ⑤血小板数量、形态及聚集性。⑥寄生虫。 ●注意事项 1．血膜呈舌状，头、体、尾分明 2.空气中晃动，尽快干燥；37℃恒温箱中促干 3．涂片的厚薄、长度与血滴大小（10~20μl）与血片质量4．1h内染色或在1h内甲醇固定 5.正确清洁玻片 6．抗凝血或毛细血管血涂片；EDTA能阻止PLT聚集 7．抗凝血液4h内涂片，先在低倍镜下浏览全片，了解染色好坏和细胞分布情况，观察有无异常细胞。选择涂片体尾交界处染色良好的区域，在油镜下计数100个白细胞，按其形态特征进行分类计数。求出各类细胞所占百分数。 8.分类时应从血膜体尾交界处边缘向中央依次上下呈城垛 状迂回移动，计数使不能重复和遗漏。
人外周血单个核细胞分离液说明书
分离后分离前 水平离心血浆层单个核细胞层分离液层 红细胞层人外周血单个核细胞分离液说明书 货号：P9010/P9011 规格：200mL 产品简介： 本产品是一种用于分离人外周血单个核细胞的无菌、低内毒素水平的密度梯度分离液。外周血中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090g/mL左右，淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090g/mL，血小板为1.030~1.035g/mL。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 产品指标： 密度 1.077±0.001g/mL 渗透压 290~350mOsm/kg H2O 无菌 0.1μm 滤膜过滤保存条件： 本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。 操作步骤： 1.取新鲜抗凝全血（EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝 均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血 及组织稀释液或者PBS稀释全血。 2.在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体 积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL， 加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过 离心管的三分之二，否则会影响分离效果）， 将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意
保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。） 3.室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳 的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g）。 4.离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白 膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。 5.小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞。250g，离心 10min。 6.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。 7.重复步骤6 8.弃上清，细胞重悬备用。 注意事项： A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物 污染。 B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较 低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。 C.血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2h以内），为保持单个核细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。 D.稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致血细胞凝集，大大降 低细胞得率及纯度。 E.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。 F.血液样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳 的分离条件。 G.吸取过多的单个核细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增 加；吸取过多的血浆层可能会导致单个核细胞中血浆蛋白及血小板污染。