细胞毒性实验步骤-3
细胞毒性实验步骤
一、样品准备
准备规则尺寸样品，平行样≥3个。
所有样品采用75%酒精杀菌消毒how？，烘干后紫外照射how long？，灭菌处理。二、浸提液制备
样品灭菌后按照1.25cm2/mL（1cm2/mL、3cm2/mL）比例加入含10%小牛血清和100U/ml 双抗（青霉素和链霉素）的DMEM，置于37℃，5%CO2培养箱内培养24h（72h）得到浸提液，0.22μm微孔滤膜除菌后备用。
三、实验分组
样品浸提液为实验组，阳性对照组为10%的DMSO（二甲基亚砜），阴性（空白）对照组为含10%小牛血清和100U/mL双抗的DMEM。实验组共3（6）个点，分别为24h（72h）浸提液各培养1、3、5天。
四、L929细胞浓度选择及细胞计数
选择生长状态良好的细胞用PBS冲洗三次，2.5g/L胰蛋白酶消化后离心，制备不同浓度的细胞悬液（1×103/mL、1×104/mL、2×104/ mL、3×104/ mL、1×105/ mL）。
细胞计数：将细胞悬液滴在细胞计数板上，盖上盖玻片（从一头压到另一头，防止气泡产生），在显微镜下计数，数计数板上四个角上四个区域所含细胞总数X，细胞浓度为X/4×104 /ml。
五、细胞形态观察和细胞毒性测定
将配好浓度的细胞悬液加入3块96孔板，3块培养板分别编号1天、3天、5天，每孔100μL（根据实验组计算好加入量，每种金属浸提液对应8-16孔细胞悬液），37℃ , 5 % CO2条件下培养24h，待细胞贴壁生长后弃去原培养液，PBS冲洗3遍后分别加入实验组24h、（72h）浸提液、阳性对照组10%的DMSO、阴性对照组含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM,，每孔100μL继续培养。1、3、5天各取一块培养板在倒置显微镜下观察细胞形态并照相。每孔加入10μL MTT后继续培养4h，小心抽出每孔内浸提液，每孔加入150 μL DMSO. 水平振荡器（脱色摇床）振荡培养板10min，570nm波长下用自动酶标检测仪上测定各孔OD值。
细胞毒性实验方案
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖) 胰酶双抗(青霉素/链霉素）DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛指甲油 6孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45μm滤膜 灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 （SiO 2 -SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时 夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化 硅（SiO 2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、SiO 2 -SS-HA、DOX， 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维 细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、 SiO 2 -SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO 2-SS-HA/DOX、SiO 2 、HA、DOX药物载 体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。 ②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口
细胞毒性实验步骤-3
细胞毒性实验步骤 一、样品准备 准备规则尺寸样品，平行样≥3个。 所有样品采用75%酒精杀菌消毒how？，烘干后紫外照射how long？，灭菌处理。二、浸提液制备 样品灭菌后按照1.25cm2/mL（1cm2/mL、3cm2/mL）比例加入含10%小牛血清和100U/ml 双抗（青霉素和链霉素）的DMEM，置于37℃，5%CO2培养箱内培养24h（72h）得到浸提液，0.22μm微孔滤膜除菌后备用。 三、实验分组 样品浸提液为实验组，阳性对照组为10%的DMSO（二甲基亚砜），阴性（空白）对照组为含10%小牛血清和100U/mL双抗的DMEM。实验组共3（6）个点，分别为24h（72h）浸提液各培养1、3、5天。 四、L929细胞浓度选择及细胞计数 选择生长状态良好的细胞用PBS冲洗三次，2.5g/L胰蛋白酶消化后离心，制备不同浓度的细胞悬液（1×103/mL、1×104/mL、2×104/ mL、3×104/ mL、1×105/ mL）。 细胞计数：将细胞悬液滴在细胞计数板上，盖上盖玻片（从一头压到另一头，防止气泡产生），在显微镜下计数，数计数板上四个角上四个区域所含细胞总数X，细胞浓度为X/4×104 /ml。 五、细胞形态观察和细胞毒性测定 将配好浓度的细胞悬液加入3块96孔板，3块培养板分别编号1天、3天、5天，每孔100μL（根据实验组计算好加入量，每种金属浸提液对应8-16孔细胞悬液），37℃ , 5 % CO2条件下培养24h，待细胞贴壁生长后弃去原培养液，PBS冲洗3遍后分别加入实验组24h、（72h）浸提液、阳性对照组10%的DMSO、阴性对照组含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM,，每孔100μL继续培养。1、3、5天各取一块培养板在倒置显微镜下观察细胞形态并照相。每孔加入10μL MTT后继续培养4h，小心抽出每孔内浸提液，每孔加入150 μL DMSO. 水平振荡器（脱色摇床）振荡培养板10min，570nm波长下用自动酶标检测仪上测定各孔OD值。
MTT法测细胞毒性
MTT法测细胞毒性 试剂 MTT溶液四甲基偶氮唑盐（MTT）溶于PH7.2的磷酸盐缓冲液中，浓度为5mg/ml，除菌后2ml分装，于4℃避光保存。 含10%SDS的0.01M HCl SDS 10g 浓HCl（36%）86.2 ul 定容至100ml，过滤除菌 方法 1.将SP2/0细胞计数，调节细胞数至105/ml，制备10ml细胞悬液，加入96孔 板，100ul/孔，即细胞数104/孔。空白孔不加细胞悬液。 ,37℃条件下培养24小时。 2.5%CO 2 3.每孔加入用含5%血清的DMEM 10倍系列稀释的毒素100ul。阴性对照孔不 加毒素。 ,37℃条件下培养72小时。 4.5%CO 2 5.吸除药液120 ul, 每孔加入新鲜配制的MTT溶液20ul,即终浓度为1mg/ml， 37℃条件下培养4小时。 6.吸去上清50 ul，每孔加入150 ul含10%SDS的0.01M HCl溶液，震荡30 分钟。 7.酶标仪上测定A570。 8.计算细胞死亡率： 细胞死亡率（%）=（1-实验组A570/对照组A570）×100% 注意 1．细胞数范围：（0.5~2）×104。 2．MTT终浓度为0.5~2.5mg/ml，但一般浓度在0.5~1mg/ml就可以获得满意的结果。 3．加入MTT后，37℃条件下培养4~6小时。 4．设置空白与对照 空白孔：——+——+MTT+有机溶剂 对照孔：细胞+——+MTT+有机溶剂 5．DMSO易结冰（其溶点为18~20℃），室温偏低的条件下影响甲肷的溶解，使检测的光吸收值降低，且有机溶剂溶解的时间不能过长，如10分钟就可以获得结果。用SDS作溶剂可使所测光吸收值数日不变。
细胞毒性实验
细胞毒性实验 细胞毒性实验是评价化学物质对细胞生长的毒性的一种常用方法。该实验通常运用化 学物质的浓度或暴露时间，评估细胞的代谢活性、细胞增殖或细胞死亡等指标来判断其毒 性程度。 该实验可以通过直接在细胞培养物中加入一定浓度的化学物质，或将化学物质预处理 后再加入培养物中等方式进行。不同的实验方法，评价的指标也有所区别，例如：MTT法、WST法、细胞计数法、流式细胞术等，均可用于评价细胞毒性。 MTT法是一种基于细胞色素体代谢的细胞毒性评估方法。该方法主要基于细胞色素氧 化酶还原MTT后产生的紫色产物的数量作为评估指标。实验中通常将化学物质加入至细胞 培养物中，培养一定时间后，加入MTT试剂，并通过光学密度检测方法测定样品OD值。在实验过程中，所测得的OD值通常可以反映出样品中细胞活力和细胞增殖的变化情况。当化学物质的浓度或暴露时间超过一定阈值时，MTT实验结果将显示出细胞毒性效应。 细胞计数法是一种直接测定细胞数量的方法。该方法主要基于通过细胞计数仪或显微 镜直接计数样品中的细胞数量来评估毒性。在实验中，一般需要先将细胞培养物制成单细 胞悬液，再通过细胞计数仪或显微镜等工具直接观察计数。该方法的优点是操作简单，结 果直接。但是，由于人为操作的不确定性，对实验人员的技能水平要求较高。 流式细胞术是一种结合光学和电子学技术的先进工具，可同时评估多种参数的细胞毒 性评估方法。该方法主要基于细胞表面和内部成分的特异性标记，通过激光扫描和电子检 测等检测方式来捕捉和分析细胞不同部位标记物的强度和分布情况。通过分析不同实验组 的流式细胞术数据及其之间的差异，可以评价化学物质的毒性效应。 总之，细胞毒性实验是一种常用的毒性/生物活性测试方法，是评价化学物质对细胞 的毒性作用非常重要的实验方法之一。相对于动物体内实验，细胞毒性实验具有快速、简单、可重复性高、成本低等优点，并且具有高度预测性，往往可以作为快速筛选化学物质 毒性的重要工具。但是，需要注意的是，细胞毒性实验仅能反映化学物质对细胞的毒性作用，不能完全代表其在整个生物体系中的毒性效应。因此，在实际应用中，还需要结合其 他方法和指标进行综合评价。
细胞毒性试验mtt方法-中英文
用0.25%胰蛋白酶消化单层培养的细胞（293T细胞、MDCK细胞、Vero 细胞、CEF细胞），用DMEM培养基或MEM培养基（10%胎牛血清，1%双抗）制成单细胞悬液，以每孔104个细胞接种于96孔板，每孔加入200ul培养基。将培养板放到CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下培养24h，在细胞板孔内分别加入polyMAG/DNA复合物（0.5ul/0.25ug, 0.25ul/0.25ug, 0.25ul/0.5ug），Lipofectamine 2000/DNA复合物（0.5ul+0.2ug），质粒DNA（0.5ug），每个处理设三个复孔。继续培养24h后，每孔加入20ul的MTT(5mg/ml)，37℃培养4h，终止培养，吸去孔内上清液；每孔加入150ul DMSO，摇床上振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪上测定490nm各孔光吸收值，以不加细胞只加培养液的空白对照孔调零（其他实验步骤一致），以未经处理的空白细胞作为对照（三个复孔）。根据公式计算细胞存活率，细胞存活率(%)=[OD490(样品)/OD490（对照)]x100。 The toxicity of nanoparticles was evaluated by MTT (3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) test. PK15 cells were planked in a 96 well plate with a concentration of 104 cells/well and cultured in 37℃5%CO2for 24 h. Then PK15 cells were treated with nanoparticlesat different concentrations(1:1, 1:2, 1:4), PEI, superfectand lipofectamine especially.PK15 cells untreated were used as control. After incubationfor 6 h,the medium was removed. PK15 cells were cultured in 37℃5%CO2 for 24 h, and were cultured for another 4 h inMTT(0.5%)containing DMEM, then the medium was carefully removed. 150ul/well dimethyl sulfoxide was added and oscillated gentlyto make crystal dissolved. The absorbance at 490 nm was measuredusing a microplate reader. The cell viability was expressed asa percentage of OD490(sample)/OD490(control).
细胞毒性实验报告
细胞毒性实验报告 细胞毒性实验报告 细胞毒性实验是一种常见的科学实验方法，用于评估化合物对细胞的毒性作用。本实验旨在研究不同浓度的化学物质对细胞的影响，并探讨其可能的毒性机制。实验材料与方法： 1. 细胞系：本实验选择了人类肺癌细胞系A549作为研究对象。这是一种常用 的细胞系，具有较高的增殖活性和易于培养的特点。 2. 化学物质：选择了化学品A、B和C作为实验物质，分别为已知对细胞具有 不同程度毒性的化合物。 3. 细胞培养：将A549细胞系培养在含有适宜营养物质和生长因子的培养基中，保持在37摄氏度、5%二氧化碳的恒温培养箱中。 4. 细胞处理：将A549细胞分成不同组，每组细胞分别加入不同浓度的化学物 质A、B和C，同时设置一个对照组，不加入任何化学物质。 5. 细胞存活率检测：使用MTT法检测细胞的存活率。MTT是一种黄色的化学试剂，它能够被活细胞内的线粒体酶还原为紫色的产物。通过测量产物的光密度，可以反映细胞的存活率。 实验结果与讨论： 经过一定时间的培养和处理后，我们观察到不同浓度的化学物质对A549细胞 的影响。通过MTT法测定细胞存活率，我们得到了以下结果： 在化学物质A的处理下，细胞存活率呈现浓度依赖性的下降趋势。随着化学物 质A浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。这表明化学物质A对A549细胞具有 明显的毒性作用。进一步的研究发现，化学物质A可能通过抑制细胞的DNA
合成和蛋白质合成来导致细胞死亡。 与化学物质A相比，化学物质B对A549细胞的毒性作用较弱。在较低浓度下，细胞存活率相对较高，但随着浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。这可能是因 为化学物质B对细胞的毒性作用与其浓度成正相关。进一步的研究发现，化学 物质B可能通过干扰细胞的氧化还原平衡和细胞膜的完整性来导致细胞死亡。 化学物质C对A549细胞的毒性作用相对较弱。在较低浓度下，细胞存活率接 近对照组水平，但随着浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。进一步的研究发现，化学物质C可能通过干扰细胞的代谢过程和细胞凋亡通路来导致细胞死亡。 综合以上实验结果，我们可以得出结论：化学物质A具有较强的细胞毒性作用，化学物质B具有中等的细胞毒性作用，而化学物质C具有较弱的细胞毒性作用。这些毒性作用可能是通过不同的机制实现的，如抑制DNA合成、干扰氧化还原平衡和细胞膜完整性等。 细胞毒性实验在药物研发和毒性评估中具有重要的应用价值。通过评估化合物 对细胞的毒性作用，可以为药物筛选和安全性评估提供重要依据。此外，细胞 毒性实验还可以帮助我们深入了解化合物的毒性机制，为相关疾病的治疗提供 理论依据。 总结： 细胞毒性实验是一种常见的科学实验方法，通过评估化合物对细胞的毒性作用，可以为药物研发和毒性评估提供重要依据。本实验通过研究化学物质A、B和C 对A549细胞的影响，揭示了不同化合物的毒性作用和可能的毒性机制。细胞 毒性实验在未来的研究和应用中将发挥重要的作用，为人类健康和药物安全做 出贡献。
细胞毒性试验总结
细胞毒性试验总结 （一）实验前应明确的问题 1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。 4.培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。 5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。 6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。 7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 8.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。
细胞毒性实验
4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。 5.终止培养，小心吸去孔内培养液。 6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜） 悬浮细胞： 1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 l?g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100?(储存液100 1640）。 2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。 3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值） 4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。 （三）MTT的配制 MTT一般最好现用现配，过滤后4oC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉. 配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。 PBS配方:Nacl 8g，Kcl ，Na2HPO4 ，KH2PO4 ，调ph 7.4，定容1L。 （四）关于细胞的接种(铺板)
细胞毒性实验
细胞毒性实验 简介 细胞毒性实验是一种常用的生物学实验方法，用于评估物质对生物体的细胞毒性。通过测量物质对细胞的影响，可以判断其是否对细胞产生有害作用。细胞毒性实验常被应用于药物研发、化学品评估以及毒性测试等领域，旨在确保物质的安全性和对生物体的可接受性。 实验步骤 1. 细胞培养 在进行细胞毒性实验之前，首先需要培养细胞。选择适当的细胞系，如人类肺癌细胞株A549，将其放入细胞培养皿中，并添加培养基（常用的培养基包括DMEM、RPMI 1640等）。将细胞培养在恒温恒湿的培养箱中，通常培养温度为37°C，CO2含量为5%。 2. 细胞处理 将待测试物质加入培养基中，与细胞一同培养。通常会设置不同浓度的待测物质组，以便研究其剂量依赖性毒性效应。同时，还需设置一个阴性对照组（仅含培养基）和阳性对照组（含有已知毒性的物质，如阿霉素）。
3. 细胞存活率检测 根据细胞系的不同，可以选择合适的方法检测细胞的存活率。常用的方法包括MTT法、SRB法和细胞计数法等。 - MTT法 MTT法是一种测定细胞代谢活性的方法。MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻吩基)-2,5-二苯基-2H-四唑）是一种黄色溶液，可以被活细胞中的代谢酶还原为紫色的形式。使用MTT溶液处理细胞后，将细胞溶胀后的产物溶解，通过分光光度计测量溶液的吸光度，间接反映细胞存活率。 - SRB法 SRB法是通过测量细胞中蛋白质含量来评估细胞数量的一种方法。在SRB实验中，细胞在培养皿中固定后，使用SRB染色剂染色。待染色剂固定后，通过溶解并测量其吸光度，可以间接反映细胞存活率。 - 细胞计数法 细胞计数法是直接计数细胞数量来评估细胞存活率的方法。将细胞用适当的缓冲溶液（如PBS）稀释后，使用血细胞计数器或显微镜进行细胞计数。通过对细胞数量的统计，可以计算出细胞存活率。 4. 数据分析 将实验得到的数据进行统计和分析。使用适当的统计方法，比如t检验或方差分析，来判断待测物质对细胞的毒性作用是否存在显著差异。同时，还可以画出存活率曲线或柱状图等来直观地展示不同浓度下的细胞存活率。
细胞增殖毒性实验步骤CCK8
细胞增殖—毒性实验步骤 1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖—毒性实验步骤： 实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640)、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin—EDTA）、胎牛血清(FBS）、双抗］,所有的试剂、仪器放入生物安全柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。 1）倒去培养瓶内的培养液； 2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次； 3)加入胰酶500ul/0。5ml 2~10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）; 4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜； 6)将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中,低速离心800rpm 3分钟,倒去上清液；7）加入含10%FBS细胞培养液1~2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液; 8）吸取20ul细胞悬液(10ul细胞悬液+10ul台盼兰液:给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板,进行细胞计数； CCK-8实验： 9）在96孔板中，给每孔加100μL(约7000个)的细胞悬液,将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5％CO2），使细胞贴壁； 10)向培养板中加入10μL不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物； 11）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时(例如：6、12、24或48小时）（药物起作用); 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 12）向每孔加入10μL（约10%）CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）; 13）将培养板在培养箱内孵育1～4小时（半小时测一次OD值）; 14）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 15）若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者 1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下24小时内测定,吸光度不会发生变化。
细胞毒性试验总结
（一）实验前应明确的问题 1。选择适当的细胞接种浓度.一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞.但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系.否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛.根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛.切记!否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间. 3. 时间点的设定.在不同时间点的测定OD值,输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显). 4。培养时间.200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果，我们是在48h换液的。 5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。 6。理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整. 7.实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔.调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 8.避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值.由于试验本底增加，会试验敏感性.因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行.在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 (二）实验步骤 贴壁细胞： 1.收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000—10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。 2。5%CO2,37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般
细胞毒性实验方案【可编辑范本】
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料: DＭＥM（高糖)胰酶双抗（青霉素/链霉素)DAPI MTT（5m ｇ/ｍＬ) DＭSＯ PBS 4％多聚甲醛指甲油6孔培养板 9６孔培养板超薄载玻片培养瓶(25ｍL）一包0。４5μｍ滤膜 灭菌: 50mＬ,1０mL,5mL离心管两种枪头 2．实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅(SiＯ2 －ＳＳ－HＡ/DOX)，在高谷胱甘肽条件下,二硫键断裂，透明质酸脱离,同时夹心二氧化硅中药物得以释放.本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化硅 （SiO 2—SS-HA／DOX）的细胞毒性。实验组为SｉO 2 -ＳS—HA/DＯX、SｉO ２ —SS －HA、DOX，空白对照组为纯细胞，分别采用HeｐＧ2人肝癌细胞为肿瘤细胞模 型和L９2９成纤维细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiＯ ２ —SS-ＨA/ＤOX、S ｉＯ 2 —ＳS—HA、DOX,空白对照组为纯细胞。培养基中含有1０% （v／v) FBＳ 和１% (w/ｖ) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的ＳiO 2 —ＳＳ—HA/DOＸ、 ＳiＯ 2 、HA、DOX药物载体培养基溶液。 （１）。以HｅpＧ2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置:双抗 1％血清１2% ＤMEＭ87% 具体操作步骤: 细胞的复活: ①将冻存于液氮中的细胞取出,迅速放入37℃温水中,使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5ｍL无血清培养基,1000rmp,5ｍｉn离心去上清，再加5mL有血清培养基,转移至培养瓶中。（每次转移时,将之前的离心管洗涤,并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。) ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代: 将0．25%的胰酶分装至小离心管中,每个管中2mＬ,冻存于-２0℃,每次使用一管,避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧,喷7５%的酒精放入超净台． ②将培养液倒入废液缸,残留培养基用吸管吸干净，操作完成后,培养瓶口用
细胞毒性试验总结
（一）实验前应明确的问题 1. 选择适当的细胞接种浓度.一般情况下,96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞.但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 2。药物浓度的设定.一定要多看文献,参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）. 4. 培养时间.200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止,影响结果,我们是在48h换液的。5。 MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。 6。理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。 7。实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 8。避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值.由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液. (二）实验步骤 贴壁细胞： 1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至1000—10000孔,（边缘孔用无菌PBS填充）。 2. 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。