LDH Assay 测定药物细胞毒性
LDH Assay 测定药物的细胞毒性
（Promega The CytoTox-ONE分析法）
A．试剂的准备：
1、从-20冰箱中取出底物混合物及分析缓冲液置于4度箱溶解。
2、待混合物及分析缓冲液溶解后置于37度水浴箱中平衡5分钟。
以下过程，需避光操作
3、向平衡后的底物混合物中加入11毫升分析缓冲液。轻柔混合至底物完全溶化。
4、完全混合的溶液即为Reagent试剂，用1.5ml EP管分装，EP管事先已锡纸包裹。每支EP管内分装约24孔用量，650ul
Reagent应避光保存，在-20度可保存4~6周
B. 实验设计（48孔板）：
1、每株细胞铺设24孔，三复孔设计，共8组。2组无用药组，6组用药组
2、无用药a组在LDH实验中作最大LDH释放对照组，b组作FREE对照组。
3、无用药组b在MTT实验中作FREE对照组
C. 细胞毒分析流程：
1、取出过夜培养处于对数生长期，90%满瓶的细胞，消化。
2、向消化后的细胞瓶内加入6 ml完全培养液，充分吹洗，混匀。
3、取细胞培养平皿，加入5ml完全培养液，并加入第2步中充分混匀后的细胞2~3ml。混匀。
4、设置48孔板，并铺细胞
5、每孔加入至终体积250微升
6、37度培养箱中孵育过夜（按步骤3-5铺细胞，过夜细胞可达90%密度左右，不超过95%密度）
7、给药方法：a、从-20 冰箱中取出TRAIL蛋白，于4度冰箱内溶解后，置于冰上。
b、按最大给药孔药物浓度计算全部实验孔所需药量体积，并用完全培养液稀释药物。
c、取出48孔板，更换2%FBS的完全培养液，其中2组对照孔中加入200ul，其余给药孔按计算好的给药体系分别加入不同体积的2%FBS的培养液。
d、按计算好的各用药组所需药量体系给药，总体系200ul。轻柔混匀。
例子：95C，用药浓度50ng/ml 150ng/ml 300ng/ml 450ng/ml 600ng/ml 750ng/ml
药物母液浓度100ug/ml，按750ng/ml浓度，全部给药孔总需要量：1.5405.ml。预算损耗，总计配置1.6ml，750ng/ml的药物工作液。取母液12ul，用含2%FBS培养液稀释至1.6ml。给药：c步中低浓度至高浓度孔2%FBS培养液体积为186.6ul,170ul,140ul,110ul,80ul,0ul 低浓度至高浓度分别加入工作液13.4ul;30ul;60ul;90ul;120ul;200ul.。混匀
8、用药30小时后，取出培养板。（肉眼观察肿瘤细胞死亡是否与预计相同，如果跟假设有出入，则不进行LDH测定。因可能是实验误差甚至错误造成）
9、制备最大LDH释放对照组，无用药组a内加入4微升裂解液。37度孵育5至10分钟。
10、设置96孔板，从48孔板内各孔取25ul上清液至96孔板对应孔内。
以下操作避光
11、于96孔板内加入与上清液等体积的Reagent并混合摇匀30秒。
18、37度孵育5分钟
8、加入12.5微升终止液。
9、震荡10秒，并用560nm或590nm波长检测
注意：若平板未能避光保存，则应在1小时内测定数据以避免增加的背景光。
D. 结果计算：
1、获得减去BLANK孔的数值。
2、Percent cytotoxicity = 100 x (Experimental – Culture Medium Background-free)/(Maximum LDH Release – Culture Medium Background-free)
乳酸脱氢酶细胞毒性检测
产品简介： 产品编号产品名称产品包装产品价格 C0016 100次176.00元碧云天的乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也称乳酸脱氢酶检测试剂盒(LDH Assay Kit)或乳酸脱氢酶释放检测试剂盒(LDH Release Assay Kit)，是一种基于diaphorase催化的INT显色反应，通过比色法检测细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶活性或检测其它样品中的乳酸脱氢酶活性的试剂盒。 本试剂盒可以用于常规的乳酸脱氢酶活性的检测，更常用于以LDH释放为指标的细胞毒性检测。同时，基于细胞总乳酸脱氢酶活性的检测，本试剂盒也可以用于检测细胞增殖和细胞毒性检测。 细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)。通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。LDH释放被看做细胞膜完整性的重要指标，并被广泛用于细胞毒性检测。LDH释放被认为是以前使用放射性的51Cr标记细胞，随后通过51Cr释放进行细胞膜完整性检测的安全有效的替代方法。 本试剂盒的基本原理是，在乳酸脱氢酶的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和INT (2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)催化反应生成NAD+和强生色物甲臜(formazan)，在490nm波长下产生吸收峰，从而可以通过比色来定量乳酸脱氢酶的活性。吸光度与乳酸脱氢酶活性成线性正相关。该酶联反应原理的示意图如下： 可检测细胞培养液、细胞裂解液等样品中乳酸脱氢酶的活性。一个试剂盒可进行100次检测。 包装清单： 产品编号产品名称包装 C0016-1 LDH释放试剂 1.5ml C0016-2 乳酸溶液2ml C0016-3 酶溶液1ml×2 C0016-4 INT溶液(10X) 0.2ml C0016-5 INT稀释液2ml —说明书1份 保存条件： -20℃保存，一年有效。C0016-3需注意避免反复冻融。C0016-4需避光保存。试剂盒解冻后可以短期4℃存放，2-3天内有效。 注意事项： 冷冻会使样品中部分乳酸脱氢酶失活，4℃可放置2-3天。建议样品准备好后尽量当天完成测定。 如果检测细胞培养液中的乳酸脱氢酶，由于血清含有乳酸脱氢酶，建议血清的使用浓度不要超过1%，并最好使用热灭活血清。如果一定需要使用10%血清，在检测时一定要设置没有细胞，但加入了相同体积培养液的对照孔，以用于消除背景。 细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大，都会造成细胞释放乳酸脱氢酶增加。
细胞膜毒性检测方法概括
首先，可进行细胞的毒性检测，通过台盼蓝拒染法检测细胞存活率变化，MTT或WST法检测细胞的活力。 其次，细胞功能的正常有赖于膜结构的完整及膜特性的保持，所以通过以下方法检测某种物质对细胞膜的毒性 1.细胞膜通透性的变化： 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）广泛存在于生物细胞内，是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可泄漏至细胞外介质中。泄漏出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I 变成还原型辅酶I，通过测定NADH在340 nm处吸光度增加的速度可求得乳酸脱氢酶的活力，从而得到细胞膜是否损伤的结果。国外有通过试剂盒检测腺苷酸激酶的释放以及通过共聚焦激光扫描显微镜检测碘化丙啶的吸收量。 检测膜胆固醇采用邻苯二甲醛比色法。测定波长为510 nm，按照试剂盒说明检测。 2.可通过透射电镜观察细胞膜结构及以PI为荧光染料检测核膜完整性，现在更有利用原子力学显微镜（AFM）观察细胞的形态结构及比较细胞表面粘弹力的变化，比较药物对细胞膜作用前后的膜表面结构变化。利用AFM的力曲线得到能表明机械性能参数的粘弹力来分析比较未作用药和作用药后的细胞，一般，作用药组细胞其弹性小于未作用药细胞。 3.细胞膜表面整合素的变化：
整合素是一类广泛存在于细胞表面的糖蛋白，由α和β两个亚基以非共价键连接的异二聚体，目前发现由19种α亚基和8种β亚基以不同方式组合形成24种整合素亚型。用流式细胞仪检测细胞表面整合素(integrinpl)的表达(平均荧光强度） 4.Western blot检测细胞骨架蛋白F-actin和Tubulin-β 细胞骨架是由蛋白质纤维构成的胞内网络，相当于细胞的骨骼，支持着整个细胞，它紧贴在细胞膜下，赋予细胞一定的形状,对细胞及细胞器的运动也起着至关重要的作用。应用流式细胞仪检测细胞内F-actin和tubulin-β蛋白表达的情况（通过平均荧光强度来体现）。一般，药物作用后，使细胞内的钙离子浓度升高，引起一定的信号转导，破坏actin网络，使F-actin解聚，影响到细胞骨架结构对细胞形态的支持作用，造成细胞收缩，形态异常，细胞连接松散，易脱落，细胞生长稀疏，故在倒置荧光下观察药物作用后，细胞数目明显减少。 5.细胞膜Na+—K+—ATP酶及Ca2+—Mg2+—ATP酶活性的测定 按照试剂盒的方法进行，测定Na+—K+—ATP酶及Ca2+—Mg2+—ATP 酶活性。 6.细胞膜膜电位的变化：DIBAC4(3)为膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料,利用它可以快速检测膜电位的动态变化，且不损伤细胞。当DIBAC4(3)进入细胞内增多，荧光增强，表明细胞膜电位负值减小，出现去极化变化；反之，荧光减弱，表明细胞膜电位负值增大，出现超级化变化细胞的去极化与细胞损伤密切相关，造成大量Na+内流,K+外流，细胞内呈高钠低钾状态，细胞膜皱缩。
药物毒理学中的细胞毒性评估方法
药物毒理学中的细胞毒性评估方法药物毒理学是一门研究药物对生物体产生毒副作用的学科。在新药开发过程中，对于药物毒理学的评价具有重要意义。其中，细胞毒性的评估是药物毒理学研究中不可缺少的环节。因此，本文将介绍药物毒理学中的细胞毒性评估方法。 细胞毒性的评估方法一般分为体外细胞实验和体内实验两种。其中，体外实验是药物毒理学过程中重要的步骤，通过研究药物在人体外部对细胞的影响，能够帮助研究人员评估药物在体内的细胞毒性。体外实验中，最常用的细胞系是人类癌细胞系或小鼠细胞系，这些细胞系的繁殖能力强，生长条件稳定，可大幅缩短实验周期。 一般情况下，细胞毒性评估实验中，人类肝肾细胞常被用作研究对象，因为它们在体内发挥的生理功能和代谢作用紧密相连。其中，肝细胞的毒性评估尤为重要，因为药物通常是通过肝脏进行代谢和分解。 一、MTT法（三(4,5-二甲基噻唑-2-基) -2,5-二苯基四唑-溴化物法）
MTT法是一种简单、快速和可靠的测定系统，用来评估药物对细胞中代谢活性的影响。该方法的基本原理是：细胞吸收MTT （3 - (4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基四唑），通过细胞内线粒体 的活性将其还原为其水溶性甲醛基甲基紫晶体紫色产物。产生的 这种产物沉淀在细胞形成的胞外矩阵内，从而逐渐形成紫色晶体，晶体的数量正比于活细胞的数量，从而被用来评估细胞活性。 二、清除自由基方法 自由基是许多细胞毒素产生的主因，它们可以对细胞膜、DNA、核蛋白的结构造成不可修复的损害，从而导致细胞死亡。因此， 清除细胞内自由基的方法被广泛地应用于细胞毒性评估中。目前 常用的清除自由基方法是通过给予体内或外源性抗氧化剂，如超 氧化物歧化酶，抗坏血酸，山梨醇等。这些抗氧化剂可以与自由 基发生反应，从而减少其对细胞的损害。 三、细胞凋亡检测 细胞凋亡是由于外界因素刺激所引起的程序性死亡，是药物毒 理学研究中常见的一种现象。在研究中，通过凋亡指标的检测可
用于药物筛选的细胞毒性测定方法总结
用于药物筛选的细胞毒性测定方法总结 简介 药物筛选是新药研发过程中的重要环节之一。细胞毒性测定方 法是评估药物候选的安全性和毒性的常用手段。本文档总结了常见 的用于药物筛选的细胞毒性测定方法，并对其原理和应用进行了简 要介绍。 细胞毒性测定方法 1. MTT法 MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法是一种常用的细胞毒性测定方法。该方法通过测定细 胞内还原MTT为紫色形成的甲基蓝晶体的量来评估细胞的生存率。MTT法简便、快速，适用于评估化学物质对细胞的毒性。 2. SRB法
SRB（sulforhodamine B）法也是一种常见的细胞毒性测定方法。该方法利用SRB染色与细胞蛋白质结合来评估细胞的生存率。SRB 法具有操作简便、结果稳定的特点，广泛应用于药物筛选领域。 3. LDH法 LDH（lactate dehydrogenase）法是衡量细胞膜完整性的常用方 法之一。该方法通过测定培养上清液中乳酸脱氢酶的活性来评估细 胞膜的破坏程度。LDH法对细胞毒性的灵敏度高，适用于评估药 物的细胞毒性。 4. ATP酶法 ATP酶法是通过测定细胞内ATP酶的活性来评估细胞的生存 能力的方法。该方法适用于高通量筛选，可以同时评估大量化合物 对细胞的毒性。ATP酶法操作简单、快速，是药物筛选中常用的细 胞毒性测定方法之一。 结论
细胞毒性测定方法在药物筛选中扮演着重要的角色。本文总结了常见的MTT法、SRB法、LDH法和ATP酶法，这些方法具有操作简便、结果可靠的特点，适用于评估药物候选的细胞毒性。根据具体需求和实验条件选择合适的细胞毒性测定方法，将有助于提高药物筛选的效率和准确性。
细胞毒性测试与药物毒性评价
细胞毒性测试与药物毒性评价 药物研发是一个较为复杂和耗时的过程，其中药物毒性评价是不可或缺的环节。药物毒性评价旨在评估某种药物对生物体的危害程度，确定药物的安全性和有效性，为药物注册和上市提供重要的依据。而细胞毒性测试则是毒性评价中不可或缺的一环，本文将就细胞毒性测试和药物毒性评价进行探讨。 一、细胞毒性测试的概念和原理 细胞毒性测试是一种原位代替动物试验的技术，可以在体外进行，能够评估化 合物对细胞的危害程度，通过测定化合物对细胞形态、生长、代谢和生物学效应的影响来判断其毒性程度。该方法不仅具有较高的可靠性和重现性，而且更加便捷快速。目前已有多种细胞毒性测试方法被广泛应用，如细胞形态、细胞增殖、细胞色素释放、细胞凋亡等方法。 细胞毒性测试评估药物毒性是基于药物对细胞的影响，同时考虑药物的化学成 分和生物学特性。当药物通过管路进入细胞后，会对细胞的正常生理代谢过程产生一定的抑制作用，导致生物学效应发生改变，这种变化会被细胞毒性测试方法捕捉到，从而评估化合物的毒性程度。 二、细胞毒性测试的应用价值 细胞毒性测试是一种快速、高效、准确的药物毒性评价方法。这种测试方法可 用于初步筛选毒性药物，评估药物对生物体的安全性，指导药物研发的方向，并在临床前期对药物的毒性进行评估。同时可以保障大多数药物的有效性，这也是药物注册和上市的必要条件之一。 近年来，随着生物技术和分子生物学的发展，细胞毒性测试方法不断完善和发展，并且有望成为临床前药物评估的首选方法。 三、药物毒性评价方法
药物毒性评价所采用的方法，是依据药物分子的物理化学性质和药效学特性， 对药物对生物体的一系列反应进行评估。经过技术的整合和综合评估之后，就得出药物对生物体的毒性程度。药物毒性评价方法主要包括以下几种： （一）动物实验法：动物实验法是药物毒性评价中最常用的方法。该方法可用 于对药物进行全身毒性、局部毒性、慢性毒性等多方面的评价。但该方法需耗费大量时间和资源，并具有伦理上的问题。 （二）细胞毒性测试：细胞毒性测试是目前较为流行的毒性评价方法之一。该 方法可以在体外进行，快速、准确地评价化合物的毒性程度，且不具备传统动物试验的伦理问题。 （三）计算机辅助预测法：高通量计算机可根据大量的化合物结构和已知毒性 物质的数据库，快速预测新药的毒性，并对药物中毒概率进行统计分析，具有高效、便捷和经济的优势。 （四）体外膜通透性测试：体外膜通透性测试是评估药物对生物体的毒性的一 种有效方法，可通过评估药物分子穿过细胞膜的能力，来判断药物对生物体的可能毒性效应。 四、总结 药物毒性评价是一项重要的医学工作，直接关系到人体健康和疾病治疗。在药 物研发的过程中，细胞毒性测试是一种既可靠又经济的药物毒性评价方法，其作用不仅限于药物研制、注册和上市，同时指导医学研究领域对潜在药物毒性的评估。因此，细胞毒性测试具有广泛的应用前景，值得进一步推广和应用。
新药开发中的细胞毒理学评估
新药开发中的细胞毒理学评估前言 随着医学科技的不断发展，新药的研发越来越受到人们的关注。在新药研发的 过程中，细胞毒理学评估是十分重要的一环。本文将围绕这一话题进行探讨。 一、细胞毒理学评估简介 所谓细胞毒理学评估，就是研究化学物质、药物等对细胞的毒性效应及机制的 一种科学方法。细胞毒理学评估是新药研发的关键和基础，其主要目的是评估药物对人体健康的风险。因此，细胞毒理学评估对于新药的研制和临床应用至关重要。 二、细胞毒理学评估的内容 1、细胞生存率与增殖率 评估药物的细胞毒性首先需要观察细胞的生存率与增殖率。可以通过细胞计数、MTT法、放射性同位素掺入、荧光标记等方法来确定。 2、细胞形态与结构 观察细胞形态与结构的改变，可以判断药物对细胞器官、骨架、细胞膜等的影响。 3、DNA损伤 通过测定DNA的损伤程度，来判断药物引起的基因突变和遗传毒性。可以运 用单细胞凝胶电泳法、复旦预测分类法等方法评估。 4、细胞周期 测定细胞周期，有助于评估药物对不同细胞周期阶段细胞的毒性效应及其作用 机制。
5、细胞凋亡 细胞毒性的最终结果是细胞凋亡。因此，评估细胞凋亡的发生与变化，可以了解药物对细胞的毒性效应。 三、细胞毒理学评估的方法 1、原代细胞毒性评估 原代细胞是从动物和人体组织中分离出来的基础细胞，它们与体外培养的细胞相比，更能反映真实生态系统中的复杂性。这种评估方法可以通过多种途径进行，例如动物体内培养、3D细胞培养等。 2、细胞株毒性评估 细胞株毒性评估就是在实验室中培养人造的细胞株且对其进行毒性评估。这种方法简单、快速、方便，但是在动物和人的真实生态系统中的代表性不如原代细胞毒性评估。 3、皮肤刺激试验 皮肤刺激试验是评估某些物质对皮肤的直接损伤能力的方法。可以检测出皮肤是否发红、发痒、水肿等现象。 四、细胞毒理学评估的未来趋势 随着科技的不断进步，新药研究的方法也在不断地改善。针对目前细胞毒理学评估中的一些问题，有一些新的评估方法逐渐流行起来。 1、微流控技术 微流控技术可以利用微型流道控制细胞和药物的流动，形成小规模的动态反应环境，模拟人体更真实的体内环境。 2、人工智能
细胞毒作用名词解释
细胞毒作用 一、什么是细胞毒作用？ 细胞毒作用（cytotoxicity）是指某种物质或条件对细胞产生的有害效应，导致细胞死亡或功能丧失的现象。细胞毒作用通常是生物学研究、药物研发和毒性评价等领域的重要指标之一。 二、细胞毒作用的机制 1. 直接损伤细胞膜 某些物质可以直接破坏细胞膜的完整性，导致细胞的物质交换和细胞内稳态受到破坏。例如，某些药物或化学物质的作用使细胞膜通透性增加，导致细胞内外物质交换紊乱，细胞死亡。 2. 干扰细胞代谢和功能 细胞毒物质可以通过多种途径干扰细胞代谢和功能，引发细胞死亡。例如，化学毒物可以抑制细胞内关键酶的活性，阻碍细胞内生化途径的正常进行；某些药物可以阻断关键信号通路，干扰细胞的生长和增殖。 3. 诱导细胞凋亡 细胞凋亡是一种高度有序的程序性细胞死亡，不同于坏死。细胞毒物质可以通过不同的机制诱导细胞凋亡。例如，某些化学物质可以影响细胞内的凋亡信号通路，导致细胞凋亡；某些药物可通过抑制细胞凋亡的抑制剂来促进细胞凋亡。 三、细胞毒作用的评价方法 1. MTT法 MTT法是常用的评价细胞毒作用的方法之一。MTT（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）是一种黄色可溶性化合物，能够进入活
细胞并被活细胞中的线粒体酶还原为紫色形成的甲基化产物。细胞毒物质的作用会导致线粒体功能异常，减少MTT的还原能力，从而减少产生的紫色产物。 2. 細胞膜透性法 细胞膜透性法是通过检测细胞膜的完整性来评价细胞毒作用的方法之一。一个常用的方法是使用细胞外释放的内酰胺酶（lactate dehydrogenase，LDH）作为指标。在正常情况下，LDH存在于细胞内，当细胞膜受到破坏时，LDH会释放到培养基中。通过检测培养基中的LDH活性，可以评估细胞膜的完整性和细胞毒作用程度。 3. 流式细胞术 流式细胞术是一种高通量的细胞分析方法，可以用于评价细胞毒作用。通过特定的荧光染料标记目标细胞，结合流式细胞术仪器的多参数检测能力，可以对细胞数量、活性、凋亡状态等进行全面分析。例如，使用荧光素染色剂可以区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，通过计算不同细胞群的比例，可以评价细胞毒作用的程度。 四、应用领域 1. 药物开发 细胞毒作用是评价药物毒性和疗效的重要参数。在药物开发过程中，需要评估药物对人体细胞的影响，判断药物是否具有潜在的细胞毒性作用。通过细胞毒性实验，可以筛选出具有良好抗肿瘤活性且毒副反应较低的候选化合物。 2. 环境毒性评估 细胞毒作用也可以用于评估环境中某些物质的毒性。例如，某些化学物质对水生生物细胞的毒性作用可以通过细胞毒性实验来评估，以判断它们对环境的潜在影响。 3. 自身免疫疾病研究 细胞毒作用也在自身免疫疾病研究中发挥重要作用。例如，在研究自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮时，可以通过评估细胞毒物质对免疫细胞的作用来了解疾病的发病机制，并寻找新的治疗方法。
细胞生物学中的药物筛选与评价方法研究
细胞生物学中的药物筛选与评价方法 研究 细胞生物学是研究细胞结构、功能和生物过程的学科，而 药物筛选与评价方法是指在细胞水平上对药物进行筛选和评价的方法。这些方法在药物研发和临床应用中起着至关重要的作用。本文将介绍几种常用的细胞生物学中的药物筛选与评价方法。 1. 细胞存活率测定法 细胞存活率测定法是一种常用的药物筛选与评价方法。该 方法通过评估细胞在药物处理后的存活率来判断药物对细胞的毒性和抗细胞增殖活性。常见的细胞存活率测定方法包括MTT、CCK-8、LDH释放等。 MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法是通过测定细胞内活性代谢产物的形成来评估细 胞存活率的。MTT是一种黄色草酮类化合物，可以被活细胞 内的NAD(P)H依赖的还原酶酶活（如线粒体呼吸链复合物） 还原为紫色的结晶物。通过把MTT溶液添加到细胞培养板中，
待细胞生长一段时间后，通过加入一定的溶解剂来溶解结晶物，最后用分光光度计测定溶液的吸光度来评估细胞存活率。 CCK-8（cell counting kit-8）法是一种类似于MTT法的细 胞存活率测定方法。CCK-8是MTT法的改进版，它具有更高 的灵敏度和更好的线性关系。该方法也是通过测定细胞内的活性代谢产物（如细胞色素c）来评估细胞存活率的。 LDH（lactate dehydrogenase）释放法是一种衡量细胞毒性 的常用方法。LDH是存在于细胞质中的酶，只有在细胞膜破 裂释放到培养液中时才会被检测到。通过测量培养液中的 LDH含量，可以评估细胞膜完整性的损害程度和细胞的存活率。 2. 细胞凋亡检测法 细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，与多种疾病的发生 和药物治疗效果密切相关。因此，在药物筛选与评价中，细胞凋亡的检测方法也是不可或缺的。常见的细胞凋亡检测方法包括TUNEL、Annexin V-FITC/PI、DNA Ladder等。 TUNEL（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）法是一种用于检测DNA断裂的细胞凋亡检测方法。在细胞发生凋亡时，DNA链断裂，TUNEL法通过使用特
ldh法原理
ldh法原理 LDH法（Lactate Dehydrogenase Assay）是一种常用的生物化学分析方法，用于测定体液或体内组织中的乳酸脱氢酶（LDH）活性。本文将从LDH的作用原理、实验步骤和应用领域等方面进行介绍。 一、LDH的作用原理 乳酸脱氢酶是一种重要的酶类，在细胞内起着关键的生物催化作用。它能够催化乳酸与辅酶NAD+之间的氧化还原反应，将乳酸氧化为丙酮酸，并同时还原NAD+为NADH。这个反应是一个可逆反应，乳酸脱氢酶的活性反映了这个反应向前或向后进行的程度。 二、LDH的实验步骤 1. 样本制备：将待测样本通过离心等方式，得到清澈的上清液。若有沉淀，则需避免将沉淀物一同吸取。 2. 反应体制：将样本与含有乳酸和辅酶NAD+的反应液混合。反应液中含有缓冲剂，以维持适宜的pH值。同时，还会加入一种LDH 抑制剂，以避免其他非特异性酶的干扰。 3. 反应温度：反应一般在37℃下进行，以模拟体内环境。 4. 反应时间：通常反应时间为5-10分钟。 5. 读取光密度：使用分光光度计，在340nm处测定反应体系中的NADH的吸光度。 6. 结果计算：将吸光度值代入公式，计算出样本中LDH的活性。
三、LDH的应用领域 1. 临床诊断：LDH是一种常见的临床指标，用于辅助判断心肌梗死、肝炎、肾脏疾病等疾病的程度和预后。 2. 肿瘤标志物：某些肿瘤细胞释放的LDH含量较高，因此可以通过测定血清中的LDH水平来评估肿瘤的活动性和治疗效果。 3. 药物研发：LDH活性与细胞的新陈代谢水平密切相关，因此可以作为药物的靶点评估药效。 4. 食品安全：LDH活性的变化可以反映食品的新鲜度和质量，被用于食品加工和保存过程中的质量控制。 LDH法是一种用于测定体液或组织中乳酸脱氢酶活性的常用方法。其原理是通过测定乳酸脱氢酶催化乳酸与辅酶NAD+之间的反应来评估乳酸代谢水平。LDH法在临床诊断、肿瘤标志物、药物研发和食品安全等领域有着广泛的应用前景。通过对LDH的测定，我们可以更好地了解生物体内的代谢状态，为疾病的诊断和治疗提供重要的参考依据。
nk细胞检测方法
nk细胞检测方法 NK细胞检测方法 引言： 自然杀伤细胞（Natural Killer cell，NK cell）是一类重要的免疫细胞，具有杀伤肿瘤细胞和感染细胞的能力。NK细胞检测方法是一种重要的检测手段，可以帮助医生评估患者免疫功能，及时发现异常情况并采取有效的治疗措施。本文将详细介绍NK细胞检测的常用方法及其原理。 一、流式细胞术 流式细胞术（Flow cytometry）是一种常用的NK细胞检测方法。它通过单细胞悬浮液中细胞表面或细胞内的特定标记物进行定量分析和定性鉴定。在NK细胞检测中，可以将特定的抗体与细胞表面的CD56和CD16等标记结合，然后通过流式细胞术进行检测和分析。利用流式细胞仪可以精确计算NK细胞的数量，并评估其功能状态。 二、酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的免疫学检测方法，也可以用于NK细胞检测。ELISA方法可以通过特异性抗体与待测样品中的NK细胞结合，然后通过酶标记二抗的作用，产生荧光或颜色反应，从而定量测定
NK细胞的含量。ELISA方法具有灵敏度高、操作简便等优点，被广泛应用于NK细胞的检测与研究。 三、实时荧光定量PCR 实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）是一种高灵敏度、高特异性的核酸检测方法，也可以用于NK细胞的检测。通过选择特异性引物和探针，可以在样品中扩增和定量检测NK细胞特定基因的表达水平。实时荧光定量PCR方法具有高灵敏度、高准确性和高通量的特点，被广泛用于NK细胞的鉴定和研究。 四、细胞毒性测定 细胞毒性测定是一种常用的NK细胞功能检测方法。该方法通过将待测NK细胞与靶细胞共同培养，观察和测定NK细胞对靶细胞的杀伤作用。常用的细胞毒性测定包括荧光素钠酸盐释放试验（Lactate Dehydrogenase Release Assay，LDH）和Cr^51释放试验。细胞毒性测定方法可以直接评估NK细胞的活性和功能状态，对于评估患者的免疫功能非常有价值。 五、免疫组织化学 免疫组织化学是一种通过检测组织切片中免疫标记物的表达来评估NK细胞的检测方法。该方法通过特异性抗体与组织切片中的NK细胞标记物结合，然后通过荧光染色或酶标记技术进行显色或荧光检
药物系统毒性预测的方法研究
药物系统毒性预测的方法研究随着新药的不断研发和更新，药物的毒副作用也日益受到人们的关注。因此，在药物研发的过程中，如何准确地预测药物的毒性成为了一个重要的问题。 药物的毒性预测一般可以分为两个方面，即体内毒性和体外毒性。体内毒性指的是药物在人体内的体内作用以及对人体正常组织、器官的毒性作用；体外毒性则指的是药物在体外或细胞模型中的毒性作用。针对这两个方向，现有的药物毒性预测方法也分别有所不同。 一、体外毒性预测方法 1.计算机模拟法 计算机模拟法是目前应用较为广泛的体外毒性预测方法之一。它通过建立基于药物结构的定量毒性关系模型，计算药物分子的结构、物化性质等多种信息，以预测药物的毒性。其中，QSAR 模型、机器学习模型、基于网络的模型等是目前较为常见的计算机模拟法。
2.药物抗原性预测法 药物抗原性预测法是通过一定的计算机算法和数据规约，预测药物是否具有过敏原性。目前，针对于药物抗原性预测的算法主要有药物分子的结构相似性算法、分子对接算法、光谱学方法、分子机器算法等。 二、体内毒性预测方法 1.细胞毒性预测方法 细胞毒性预测方法是通过用细胞体外生化或细胞毒性实验来预测药物的毒性。目前，常用的细胞毒性预测方法主要包括细胞减数分裂、单细胞凋亡、细胞增殖抑制等。 2.细胞信号通路分析法 细胞信号通路分析法是以细胞信号通路为中心的药物毒性预测方法。该方法研究药物和细胞之间的作用机制，检测药物对多种
信号通路的影响，并从中寻找关键的作用通路，以预测该药物的毒性。 三、药物系统毒性预测的发展前景 在经过多年的研究后，现有的药物毒性预测方法已经得到了广泛应用，但也面临着一些挑战。例如，定量毒性关系模型常常需要大量的结构数据和实验数据来支撑，数据的缺失及质量不佳会直接影响到预测准确度。而且现有的大多数细胞毒性测定方法都是单一的生物学特征测定，很难全面准确的预测药物的毒性。 因此，未来药物毒性预测的研究将更多的探讨药物和生物体之间的作用机制，并提高预测方法的准确度。同时也将开发更多新的数据分析技术来从大量数据中提取有效信息。
细胞毒性和药物安全性评价
细胞毒性和药物安全性评价 是新药研发过程中非常重要的环节。药物的毒性评价是指通过 公认的试验方法对药物的毒性进行评估，以确保新药的临床应用 是安全的。而细胞毒性评价在新药研发早期主要是用于筛选药物 候选化合物，同时还能在对候选药物进行安全性评价时发挥重要 作用。 细胞毒性是指药物对细胞产生的有害影响。在药物研发过程中，细胞毒性评价主要通过体外细胞毒性试验来完成。这些试验具有 高通量、低成本、对大量化合物快速筛选等优点。细胞毒性试验 种类繁多，包括MTT、LDH、SRB、ATP检测、细胞凋亡等试验 方法。这些试验可以对药物对细胞的影响进行定量分析，而且可 以检测出药物在细胞层面中的作用机制，如产生DNA损伤、干扰 凋亡通路等。因此细胞毒性评价不仅可以筛选出有潜力的药物候 选化合物，而且还能帮助开发人员更好地理解新药的作用机理。 药物安全性评价与细胞毒性评价有着紧密的联系。药物安全性 评价主要是针对开发中药物的毒性水平和应用范围进行评估。在 临床应用前，必须检测药物对各类动物模型的中毒作用，并确定 药物的最大耐受剂量（MTD）。针对某些特殊人群（如老年人、 儿童、孕妇等），还需要进行药物在这些人群中的安全性评价。
药物安全性评价方法繁多，如急性、亚急性和慢性毒性、生殖毒性、致癌性、遗传毒性等一系列体外、体内试验方法。此外，对于新药的生物毒性（如免疫毒性、免疫原性等），也需要通过体外和体内实验进行评估。 药物毒性评价和细胞毒性评价都是药物研发过程中不可或缺的环节。而且，药物的安全性和毒性评价与药物的临床疗效密切相关。药物开发人员需要在对药物的安全性和毒性进行全面评估的同时，注重确保药物的疗效。在评估药物毒性和安全性时，需要有科学、详尽、可靠的评价体系和一系列法规与标准的支持。同时，研究人员要时刻关注药物研发过程中不断涌现的新情况，及时应对和解决问题，确保药物的安全性和有效性。 综上所述，是药物研发过程中必不可少的环节。药物开发人员需要综合考虑药物的毒性和安全性信息，以获得更好的药物临床efficacy。药物研发的进展使我们现在能够使用更安全、更有效的药物，以缓解疾病所带来的痛苦和不便，提高生活质量。
LDH Assay 测定药物细胞毒性
LDH Assay 测定药物的细胞毒性 （Promega The CytoTox-ONE分析法） A．试剂的准备： 1、从-20冰箱中取出底物混合物及分析缓冲液置于4度箱溶解。 2、待混合物及分析缓冲液溶解后置于37度水浴箱中平衡5分钟。 以下过程，需避光操作 3、向平衡后的底物混合物中加入11毫升分析缓冲液。轻柔混合至底物完全溶化。 4、完全混合的溶液即为Reagent试剂，用1.5ml EP管分装，EP管事先已锡纸包裹。每支EP管内分装约24孔用量，650ul Reagent应避光保存，在-20度可保存4~6周 B. 实验设计（48孔板）： 1、每株细胞铺设24孔，三复孔设计，共8组。2组无用药组，6组用药组 2、无用药a组在LDH实验中作最大LDH释放对照组，b组作FREE对照组。 3、无用药组b在MTT实验中作FREE对照组 C. 细胞毒分析流程： 1、取出过夜培养处于对数生长期，90%满瓶的细胞，消化。 2、向消化后的细胞瓶内加入6 ml完全培养液，充分吹洗，混匀。 3、取细胞培养平皿，加入5ml完全培养液，并加入第2步中充分混匀后的细胞2~3ml。混匀。 4、设置48孔板，并铺细胞 5、每孔加入至终体积250微升 6、37度培养箱中孵育过夜（按步骤3-5铺细胞，过夜细胞可达90%密度左右，不超过95%密度） 7、给药方法：a、从-20 冰箱中取出TRAIL蛋白，于4度冰箱内溶解后，置于冰上。 b、按最大给药孔药物浓度计算全部实验孔所需药量体积，并用完全培养液稀释药物。 c、取出48孔板，更换2%FBS的完全培养液，其中2组对照孔中加入200ul，其余给药孔按计算好的给药体系分别加入不同体积的2%FBS的培养液。 d、按计算好的各用药组所需药量体系给药，总体系200ul。轻柔混匀。 例子：95C，用药浓度50ng/ml 150ng/ml 300ng/ml 450ng/ml 600ng/ml 750ng/ml 药物母液浓度100ug/ml，按750ng/ml浓度，全部给药孔总需要量：1.5405.ml。预算损耗，总计配置1.6ml，750ng/ml的药物工作液。取母液12ul，用含2%FBS培养液稀释至1.6ml。给药：c步中低浓度至高浓度孔2%FBS培养液体积为186.6ul,170ul,140ul,110ul,80ul,0ul 低浓度至高浓度分别加入工作液13.4ul;30ul;60ul;90ul;120ul;200ul.。混匀 8、用药30小时后，取出培养板。（肉眼观察肿瘤细胞死亡是否与预计相同，如果跟假设有出入，则不进行LDH测定。因可能是实验误差甚至错误造成） 9、制备最大LDH释放对照组，无用药组a内加入4微升裂解液。37度孵育5至10分钟。 10、设置96孔板，从48孔板内各孔取25ul上清液至96孔板对应孔内。
生物学在药物安全性评估中的应用
生物学在药物安全性评估中的应用药物安全性评估是一项非常重要的工作，它对新药的上市以及现有 药物的使用提供了关键性的参考依据。而在药物安全性评估中，生物 学的应用发挥着至关重要的作用。本文将探讨生物学在药物安全性评 估中的应用，并重点介绍动物实验、细胞毒性测试和基因毒性评价三 个方面。 一、动物实验 动物实验是药物安全性评估中最常用的方法之一。通过在动物身上 进行实验，可以评估药物的毒性和副作用，为人类使用提供参考。常 见的动物实验包括急性毒性试验、亚慢性毒性试验和生殖毒性试验等。 急性毒性试验主要评估药物对动物的短期毒性作用，通常使用小鼠、大鼠或兔子等常见实验动物进行，观察其死亡率、临床症状、体重变 化等指标，以确定药物的安全剂量范围。 亚慢性毒性试验则通过长期（通常为90天）给予动物不同剂量的 药物，观察其对器官、组织和生理功能的影响。这种试验可以更全面 地评估药物的安全性，并检测出潜在的亚慢性毒副作用。 生殖毒性试验主要关注药物对生殖系统和胚胎发育的影响，可以评 估药物的生殖毒性和致畸性。常见的指标包括动情期、受孕率、胚胎 发育异常等。 二、细胞毒性测试
细胞毒性测试是药物安全性评估中的另一个重要环节。通过在细胞 水平上评估药物对细胞的毒性和损伤情况，可以预测其对人体的潜在 危害。常用的细胞毒性测试方法包括MTT法、LDH释放试验和细胞增殖抑制试验等。 MTT法是一种常见的细胞毒性测试方法，通过测量细胞内还原 MTT为紫色产物的能力来评估细胞活力。药物对细胞生长的影响可以 通过测量紫色产物的光学密度来判断，从而评估药物的毒性程度。 LDH释放试验评估药物对细胞膜完整性的影响。当细胞膜受损时，细胞内的LDH会释放到培养基中。通过测量培养基中的LDH含量， 可以判断细胞膜的完整性和细胞毒性。 细胞增殖抑制试验主要用于评估药物对细胞增殖的抑制作用，可以 通过测量细胞数目、活力或DNA含量等指标来评估药物的毒性。这种 测试方法尤其适用于抗肿瘤药物的评价。 三、基因毒性评价 基因毒性评价是用于评估药物对基因组的突变和DNA损伤能力的 方法。这种评价可以帮助判断药物是否会对遗传物质产生损害，并对 药物的潜在致突变作用进行初步评估。常见的基因毒性评价方法包括 细菌试验、小鼠淋巴细胞试验和哺乳动物骨髓微核试验等。 细菌试验主要通过观察细菌对药物的诱变作用，来预测药物对 DNA的突变性。细菌试验一般使用梭菌属（如沙门氏菌、变形杆菌等）作为试验菌，通过观察突变菌落的形成来评估药物的基因毒性。
LDH法的原理及应用
LDH法的原理及应用 1. 原理 LDH（Lactate dehydrogenase）法是一种用于测定体液中乳酸含量的常用方法。乳酸是生物体在无氧代谢过程中产生的一种代谢产物，其浓度的升高常常与某些病理状态相关，因此测定乳酸浓度可以帮助医生评估病人的代谢情况和疾病严重程度。 LDH法的原理基于乳酸在存在乳酸脱氢酶（LDH）的催化下与还原型辅酶Ⅱ（NADH）发生氧化还原反应，生成丙酮酸和NAD+。该反应可通过测定NAD+的减少量或NADH的增加量来间接测定乳酸的浓度。具体步骤如下： 1.取一定体积的待测液样加入反应溶液中，其中包括乳酸脱氢酶、 NADH和缓冲剂。 2.反应开始后，乳酸脱氢酶催化乳酸与NADH反应，生成丙酮酸和 NAD^+。 3.NADH的减少量可以通过光密度的变化来测定。乳酸浓度与NADH 减少量成正比。 4.通过比对标准曲线，可以确定待测液样中乳酸的浓度。 2. 应用 LDH法广泛应用于临床医学、药物研究和生物学等领域。下面列举了该方法在不同领域的应用： 2.1 临床医学 LDH法在临床医学中用于测定血液、尿液和其他体液中乳酸的浓度。这对于评估病人的代谢情况、疾病状态和疾病严重程度非常重要。 LDH法在以下疾病的诊断和监测中有广泛应用： •心肌梗塞：乳酸浓度的升高与心肌梗塞相关。 •肝脏疾病：乳酸浓度的增加可能与肝功能受损有关。 •肾脏疾病：乳酸浓度的变化可以反映肾脏功能的改变。 2.2 药物研究 LDH法可用于药物研究中对药物对细胞代谢的影响进行评估。通过测定细胞中乳酸的浓度变化，可以了解药物对细胞氧化代谢的影响。
该方法可以帮助研究人员了解药物的治疗效果和毒副作用，进而指导药物的研发和应用。 2.3 生物学研究 LDH法在生物学研究中也有一定的应用。乳酸浓度的变化可以反映细胞的能量代谢状态。通过测定乳酸浓度的变化，可以了解细胞在不同生理和病理条件下的代谢状态。 在细胞培养和细胞凋亡研究中，LDH法可用于评估细胞的损伤程度和细胞死亡情况。 3. 总结 LDH法是一种测定体液中乳酸浓度的常用方法。其原理基于乳酸脱氢酶催化乳酸与NADH发生氧化还原反应，通过测定NADH的减少量间接测定乳酸浓度。 该方法在临床医学、药物研究和生物学研究领域有广泛应用，可以帮助医生评估病人的代谢情况和疾病严重程度，指导药物的研发和应用，并了解细胞的能量代谢状态和损伤程度。 通过采用LDH法，我们可以更好地了解乳酸的生成与消耗过程，进而帮助提高人类健康水平和推进科学研究的发展。
细胞活性测定
细胞活性测定方法 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。 代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。 正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。 用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高。 常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。 1．MTT法 MTT：化学名：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。