植物功能基因组学概述

植物功能基因组学概述

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摘要：植物功能基因组学是从整体水平研究基因的功能及表达规律的科学。对植物功能基因组学的研究将助于我们对基因功能的理解和对植物性状的定性改造和利用。本文简要介绍了植物功能基因组学的概念、研究内容和研究方法。

关键词：植物；功能基因组学；ESTs；SAGE

Summarize of Plant Functional Genomics

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Abstract：Plant functional genomics studies provide a novel approach to the identification of genome-wide gene expression. It is currently being widely focused on the gene expression by transcript profiling and takes us rapidly forward in our understanding of plant biological traits. In this review, comprehensive of concepts, research contents and methodologies regarding plant functional genomics and transcript profiling are described.

Key words: Plant; functional genomics; ESTs; SAGE

1 植物功能基因组学

基因组学(Genomics)是20世纪最后10年研究最活跃的领域之一。基因组学是指对所有基因的结构和功能进行分析的一门学科, 1986年由美国科学家Thomas Roderick提出, 兴起于20世纪90年代[1]。基因组学研究分为结构基因组学( structural genomics) 和功能基因组学( functional genomics)。结构基因组学代表基因组分析的早期阶段, 以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主, 以研究基因序列为目标。功能基因组学(Functional genomics)的研究又被称为后基因组学(Post genomics)研究，它是利用结构基因组学提供的信息和产物，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向对多个基因或蛋白质同时进行系统研究。

植物功能基因组学是植物后基因时代研究的核心内容,它强调发展和应用整体的(基因

组水平或系统水平)实验方法分析基因组序列信息、阐明基因功能,其特点是采用高通量的实验方法结合大规模的数据统计计算方法进行研究。基本策略是从研究单一基因或蛋白质上升到从系统角度研究所有基因或蛋白质。在植物功能基因组学的研究中，拟南芥和水稻是两种最常用的模式植物。目前, 功能基因组学在水稻、拟南芥等模式植物中取得了较快进展, 主要原因在于这两种植物已完成全基因组测序工作[2], 获得了结构基因组数据, 且遗传背景清楚, 易于开展分子生物学研究, 已率先步入后基因组时代。

2 植物功能基因组学研究内容

2、1基因组多样性研究[1]

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生物多样性是普遍存在的自然现象, 通过研究生物多样性, 可以获得不同个体之间的遗传变异情况, 揭示不同个体存在差异的原因, 进而获得有经济价值的高产、优质、抗病、抗虫及抗逆基因等。其基本方法是在全基因组水平上完成不同个体重测序, 通过寻找序列差异, 克隆相关基因。这是一种高通量的基因克隆方法, 同时还可以进行基因间相互作用的研究, 将成为功能基因组学研究的热点。基因组多样性研究对了解生物的进化、起源和迁徙有重要作用, 能反映生物进化过程和物种传播过程中基因组内的变化、基因组与外部环境的互作, 将对整个生物学产生重要影响。

2、2基因功能研究

基因功能研究主要是通过结构基因组学提供的序列, 应用相应的实验手段和生物信息软件,系统分析基因位点, 克隆功能基因。基因功能研究主要从生化、细胞学和发育方面进行研究：生物化学功能以蛋白质合成和修饰为研究重点，如作为蛋白质激酶对特异的蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能如胞内外信号传导途径相关基因研究；发育功能包括器官形成及形态建成等系统发育相关基因研究[3]。目前，获得一段DNA序列的功能信息的最简单的方法是将该DNA序列与GenBank中公布的基因序列进行同源性比较，如利用BLASTn和BLASTx 两种软件分别进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较等。同源性比较的结果大体可以分为如下类型：与生化和生理功能均已知的基因具同源性；与生化功能已知的基因具同源性，但该基因的生理功能未知；与其他物种中生化和生理功能均未知的基因具同源性；虽与生化和生理功能均已知的基因具同源性，但对该基因功能的了解尚不深入，仍停留在表观现象上。上述同源性检索分析方法仅仅为该DNA片段的功能提供了间接的证据，对基因功能的直接证据还需要实验证明[4]。

2、3 植物基因组的表达及时空调控的研究

一个细胞的转录表达水平能精确而特异地反映其类型、发育阶段以及反应状态。功能基因组学一项重要的研究内容是反映基因在不同植株、不同时期、不同组织、不同生理状态以及体外培养的细胞中mRNA或蛋白质表达的差异等的转录水平, 进而特异性地反映基因的表达水平与抗性、组织器官形成、系统发育、光合作用等的关系，通过对基因表达的研究可望调节与抗性、品质、产量等对人类有价值基因的表达, 从而达到对生物的定向调控。

2、4 蛋白质组学研究

由于基因功能的最终体现是以其编码的蛋白质实现的, 只有极少部分是以RNA形式体现的。所以, 功能基因组学研究必然要涉及到蛋白质的表达及功能研究。蛋白质组的研究具有动态性、时空性和可调节性, 其实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析, 往往要同时处理成千上万种蛋白质。依赖于高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台, 研究技术远比基因组学复杂和困难。蛋白质组学可以为基因组学提供细胞和组织分布、定位, 基因表达产物的修饰和表达丰度等信息, 可为基因功能深入分析提供信息。

3 植物功能基因组学研究技术方法

植物功能基因组学是一个崭新的研究领域，其研究方法也日趋完善。主要包括扩增性片段长度多态性、基因表达系列分析技术、转座因子、生物芯片和生物信息学等。

3、1 扩增性片段长度多态性(AFLP)[5]

AFLP是指扩增的限制性片段长度多态性，是分子标记的一种新技术，也是1992年由荷兰Keygene公司Zabeau等发展的一种将RFLP与PCR相结合的技术。该技术兼有RFLP标记技术的可靠性和PCR技术的高效性，而且快速、灵敏、稳定，所需DNA量少，多态性检出效率高、重复性好，不管所研究的基因组有多么复杂，用该方法都可以检测出任何DNA之间的多态性。现已广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性研究、基因定位和品质鉴定等方面。

AFLP技术原理是对基因组DNA限制性酶切片段的选择性扩增，使用双链人工接头与基因

组DNA的酶切片段相连接作为扩增反应的模板，接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的接合点，根据基因组中被扩增DNA片段两端的序列设计合成相应的引物，引物 3端包含有选择碱基，其作用是延伸酶切片段区，以保证那些能与选择碱基配对的限制性片段被扩增，扩增片段通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。

3、2 表达序列标签

表达序列标签( Expressed Sequence Tags, ESTs) 是研究植物基因表达的一个有效方法。表达序列标签主要用于新基因克隆、基因组图谱绘制、基因组序列编码区的确定等，它在新基因资源中扩展最为迅速，是从cDNA克隆两端获得的短的cDNA部分序列，通过分析基因组序列能够获得基因组结构的完整信息，如基因在染色体上的排列顺序，基因间的间隔区结构，启动子的结构以及内含子的分布等[6]。公共数据库(NCBI等)中有来自19 种植物的大约160000 个植物EST[7]。ESTs 提供了一个在植物中发现基因的方法，即模式基因组和其它植物之间的一种同态现象。因此, 当一个已知功能和特征的基因从一个植物中克隆出来后, 就可以通过EST数据库去鉴定另一种植物中的具有同样特征的直向同源基因。ESTs 也可以标记多基因家族中的单个成员。但是, 这些基因的准确功能还有待于通过进一步的实验方法去验证[8] 。

3、3 SAGE技术

Velculescu等人1995年发明了基因表达系列分析技术即SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)法[9]是同时定量分析大量转录本的另一种方法。这是一种高通量且快捷有效的基因表达研究技术,可用于研究任何一种由细胞转录变化引起的生物现象,而无须对基因性质和生物系统预先有所了解,因而引起了研究人员的广泛关注[10]。利用SAGE可以在短期内得到丰富的表达信息，与直接测定cDNA克隆序列方法相比减少了大量的重复测序，从而大大节省了研究时间和费用[6]。

SAGE是以转录子(cDNA)上特定区域9-10bp的寡核苷酸序列作为标签(tag )来特异性代表该转录子。然后通过连接酶将多个标签(一般为20-60个)随机串联并克隆到载体中,建立SAGE文库。通过对双标签的序列分析,可获得基因转录的分布以及表达丰度的情况(尤其是可检测到低丰度表达的基因),从而可充分了解基因转录组的全貌[11]SAGE技术原理:(1) 以转录物内特定位置的9-10bp短核苷酸序列即SAGE标签所含信息足以代表其相应的转录物。(2) SAGE标签经随机连接、扩增并集中在一个克隆中测序,标签重复出现的次数代表该转录物的拷贝数[12]。

SAGE技术已广泛用于全面获取生物基因的表达信息,定量比较不同状态下的基因表达,寻找新基因等研究领域

3、4 反向遗传学技术

反向遗传学是在已知基因序列的基础上研究基因的生物学功能，一般通过创造功能丧失突变体并研究突变所造成的表型效应。研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因诱捕、基因激活等手段。其中基因敲除技术(又称为无义突变，null mutations)可为基因产物的功能提供直接证据，其它研究基因功能的方法如基因芯片等多数只是相关性，不能证明基因序列和基因功能之间的因果关系。目前基因功能的直接证据仍是来自对缺失相应基因的突变体进行的功能分析。基因敲除包括定点敲除、T—DNA或转座子随机插入突变。现在发现一种新的生物机制——RNAi．对于致使植物基因沉默有很高的效率，对于研究植物基因功能是一种非常有效的产生突变体的方法。

3、4、1 诱导产生突变进行功能基因分析的技术(转座因子) 通常要获得未知基因的功能信

息，最直接的办法就是打断目的基因与其表型的联系，制造出功能缺失突变株并研究突变株的表型。随着外源序列的插入，导致内源基因表达受阻，出现突变体表现型，大规模的转座

因子突变已成为功能基因纽学研究的一种很重要的手段。植物转座因子，又叫转位因子，是存在于染色体DNA上的一段可自我复制和位移的DNA序列。转座因子的转位插入作用，使被插入的目的基因发生突变，失去活性，而转座因子的删除又可使目的基因恢复活性。因此，利用转座因子的转位插入作用可对被插入的目的基因进行基因功能的研究，这就是转座因子标签技术。转座子标签技术已成为植物基因鉴定、分离最有效的方法。

3、4、2 基因剔除基因剔除(gene knock out)是基因打靶(gene targeting)的一种方

法。鉴定基因功能最有效的方法就是利用基因剔除技术在模式生物中进行功能丧失(1oss of function)分析，即观察基因表达被阻断后在细胞和整体水平所产生的表型变化。但这一技术亦存在一些问题，如费用太高、周期较长，而且许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这些基因的功能为其他基因代偿所致。近年来有人利用组合化学的方法尝试针对蛋白质的化学剔除试剂，用来激活或失活各种蛋白质。

3、4、3 VIGS技术[13]病毒诱导基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技术是一

种RNA介导的抗病毒防御反应机制，目前在植物反向遗传学领域已经表现出巨大的潜力。VIGS 技术不仅优于传统的植物转基因技术，方法简便，高效耐用，而且具有高通量特性。在功能基因组学领域的研究中，这些优越性已经使VIGS技术成为最具吸引力的首选技术手段。目前，VIGS体系应用最成功的植物是病毒学家常用的模式植物-本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，与此同时，也在努力改良VIGS技术，使其能够在包括单子叶植物在内的其它物种中得到广泛应用

3、4 蛋白质组学研究

蛋白质组学是连接基因组学、遗传学和生理学的一门科学。蛋白质组学已成为研究物生物科学各个领域的必不可少的方法。细胞生命活动多发生在蛋白质水平而不是RNA 水平, mRNA的信息不足以阐明细胞内基因的实际功能, 基因在生物体整体水平上的功能最终由其编码的蛋白质在细胞水平上体现出来。蛋白质组是指一种基因组、一种生物或一种细胞／组织在精确控制其环境条件下，特定时刻所表达的全套蛋白质。基因组基本上是固定不变的, 而蛋白质组是动态的, 具有时空性和可调节性, 能反映出某个基因的表达时间、表达量以及蛋白质翻译后修饰。蛋白质组分析技术发展较快。例如：用于蛋白质分离的双向凝胶电泳技术(SDS-PAGE)、用于蛋白质鉴定的Edman降解法测N端序列技术、质谱技术(Mass spectrometry，MS)等。

利用蛋白组研究植物功能基因组可以得到以下三方面信息：从基因序列预测的基因产物的翻译情况; 基因产物的相对浓度；基因产物翻译后的修饰程度。这三方面的信息弥补了从核酸序列研究功能基因组的不足[14]。蛋白质组学将基因表达的数据与植物代谢的问题和植物表型的问题紧密连在一起, 这个方法既可以用于研究植物生理机制, 又可以用于研究未知功能的蛋白质。

3、5 生物信息学[3]

生物信息学是以计算机为工具，用数理及信息科学的理论和方法研究生命现象，对生物信息进行储存、检索和分析的一门新兴交叉学科。生物信息学内涵非常丰富，其核心是基因组信息学，包括基因组信息的获取、加工、储存、分配、分析和诠释。基因组信息学的关键是“读懂”基因组的核苷酸顺序，即全部基因在染色体上的确切位置，以及各DNA片段的功能；同时在发现了新基因信息之后进行蛋白质空间模拟和预测，然后依据特定蛋白质的功能进行药物设计；了解基因表达的调控机理，根据生物分子在基因调控中的作用，描述生物体生理生化反应的内在规律。

生物信息学由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。结构基因组学提供了巨大

的核酸和氨基酸数据，功能基因组学的一个重要的任务就是如何充分利用数据库来研究基因功能。应用生物信息学可获取一段DNA序列的功能信息，其方法是将该DNA序列与数据库中收集的DNA序列进行同源性比较，用相关软件进行核苷酸及氨基酸序列的同源性比较。

3、6生物芯片

生物芯片来源于计算机芯片。借用了计算机芯片的集成化特点，把生物活性大分子(目前主要是核酸和蛋白质)或细胞等，密集排列固定在固相载体上，形成微型的检测器件，因此狭义的生物芯片也称微阵列芯片，主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列、蛋白质微阵列和小分子化合物微阵列。广义的生物芯片是指能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件，将微阵列技术与生物微机电技术相结合，通过微加工技术和微电子技术在固体基片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA 以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片主要特点是高通量、微型化和自动化。芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列，能够在短时间内分析大量的生物分子，使人们快速准确地获取样品中的生物信息，效率是传统检测手段的成百上千倍。生物芯片和传统仪器相比较具有体积小、重量轻、便于携带、无污染、分析过程自动化、分析速度快、所需样品和试剂少等诸多优点。

4 展望

植物基因组学研究已经进入对所有植物的基因的功能基因组快速研究的时代。研究植物功能基因组学不仅可以使我们了解基因的功能，而且更有助于我们利用这些研究结果对植物性状进行定性改造。在成熟的研究理论和技术的基础上，应进一步开发主要经济植物的基因组资源，即表观遗传学、植物基因组序列的综合比较、新模式基因组的确立和植物多样性的挖掘；推进植物系统生物学研究，即植物生长的关键过程和调控植物的结构和组织；完成将基础研究成果应用到实际生产活动中，建立国家遗传性状指南；开发数据获取和分析的研究工具；加强教育、培训和扩大服务项目和社会影响[15]。

功能基因组研究是一个多学科交叉的研究领域，物理学、化学、信息学、计算机科学等都在研究过程中发挥着重要作用。由于上述各种研究技术的其自身固有的局限性，在研究植物功能基因组的工作中研究者应综合考虑和使用各种技术，不能单一的片面的采用某一方法进行研究。随着植物基因组研究的不断深入，在完善现有研究手段的同时，还必须与一些新的基因功能研究技术相补充结合，同时加强国际间的学术交流，建立全球共享的植物基因组数据库系统，以最终阐明植物基因组的结构与功能、基因调控规律以及蛋白质结构与功能，为农业的高产、优质育种等做出重大贡献。

参考文献

[1] 任毅,黄三文．功能基因组学在蔬菜中的应用[J]．中国蔬菜，2009（2）：1-6

[2] Jun Y，Hu Songnian，Wang Ju, et aL. A draf t sequence of the rice (Oryza sativa L.ssp.indica) genome．[J].Science,2002，

295(5565):79

[3] 岳思军,郑蕊,陈宁．植物功能基因组学研究进展．生物技术通报，2005（3）：217-220

[4]李子银，陈受宜．植物的功能基因组学研究进展[J]．遗传，2000，22(1)：57

[5] 王章建，高伟，杨宝，常泓．植物功能基因组学研究方法．安徽农业科学． 2009，37(20)：9375—9376

[6] 常敬礼，郭玉双，杨德光，李丽文．植物的功能基因组学研究进展[J] ．玉米科学2008,16(2)：56—59

[7] 周晓馥，肖乃仲，白云峰，王兴智．植物功能基因组学的研究策略．中国生物工程杂志，2002（6）：13-17

[8] Quackenbush J, Liang F, Holt, et al. The TIGR gene indices: reconstruction and represent ation of expressed gene sequence. Nuc Acids Res, 2000, 28: 141- 145

[9] Velculescu VE, et al. Science,1995, 270(5235):484-487

[10] 王雪景，孙毅，徐培林，仪治本，杜建中，孙丹琼．生物技术通报．2004（1）：18-22

[11] 熊勇华,许杨. 基因表达的序列分析方法研究进展.生物工程学报,2002,18(3):377-380)。

[12] 李靖等．基因表达系列分析技术的新进展．生物工程学报，2001,17（6）：613-616)

[13]姚丹青，张微微，原丽华，蔡润等．VIGS：植物功能基因组学研究的革命．分子植物育种，20097（1）：155-161)

[14] Thiellement H, Bahrman N, Damerval C, et al. Proteomics f or genetic and physiological studies in plants.Electrophoresis,1999, 20:2013- 2026）

[15] 杜艳艳．美国国家植物基因组计划资助情况分析．中国生物工程杂志，2010，30（4）：131-134