微生物实验问题与答案.

微生物实验问题与答案

一、光学显微镜的操作及细菌、放线菌个体形态的观察

1、为什么油镜的放大倍数比普通物镜大？

答：油镜能减少光的折射，进而提高视野的亮度；通过提高显微镜的数值口径增加显微镜的分辨力。

2、数值口径的表达公式？

答案：N.A=n ×sin α，n为介质折射率；α为光线最大入射角的半数。

3、显微镜数值口径与分辨力的关系？

答案：分辨力是指显微镜能辨别两点之间最小距离的能力，它与光的波长成反比，与数值口径成正比。

4、油镜的使用与普通物镜有何不同？

答案：油镜必须借助于光折射率等于或接近于玻璃的试剂，如香柏油等才能使用，而普通物镜则不需要；油镜是由100×物镜与香柏油构成，而普通物镜则限于10×物镜、40×物镜等。

5、使用油镜时应特别注意什么？

答案：上下调节镜头时应使用微螺旋，否则容易损坏镜头；应使油镜始终浸泡在香柏油中，否则就不是油镜；使用完毕后，必须用搽镜纸沾取二甲苯等有机溶剂搽去残留的油迹，否则会玷污油镜。

6、什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？

答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。

7、根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察

答：细菌用油镜，真菌用高倍镜。都是先用低倍镜找到目标后，再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。

答：放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大40倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大1000倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。

二、微生物染色

1、单染色的原理是什么？

答案：主要基于微生物细胞能与各种染料进行不同程度地结合。

2、单染色过程中，为什么干燥固定？

答案：因为通过干燥可以使菌体蛋白变性，细胞质凝固，进而可以使菌体紧密地附着于载玻片表面。

3、单染色过程中，为什么水洗时水流要缓慢地从载玻片上端流下？

答案：因为如果水流直接冲洗有菌部位，容易使菌体被冲洗掉。

4、为什么载玻片要完全干燥后，才能使用油镜？

答案：因为香柏油与水不相溶，容易造成光线发生折射或散射，一方面无法构成油镜，另一方面也会降低视野的亮度。

5、革兰氏染色的原理是什么？

答案：对于G+细菌来说，当用乙醇脱色时，由于肽聚糖含量高，网孔小，再加上脂量低，所以乙醇脱色后，进一步地缩小了网孔，结晶紫-碘复合物无法脱出，第二次用番红染色时无法着色，进而呈紫色；对于G-细菌来说，当用乙醇脱色时，由于肽聚糖含量低，网孔大，再加上脂量高，所以乙醇脱色后，进一步地扩大了网孔，结晶紫-碘复合物被脱出，第二次用番红染色时着色，进而呈红色。

6、革兰氏染色时，为什么要加碘液？

答案：碘可以与结晶紫染料形成较大的复合物，从而可以阻止结晶紫向细胞外渗透；另一方面也可以增加结晶紫与细胞质的亲和力。

7、革兰氏染色时，为什么要用酒精冲洗？

答案：加酒精是为了溶解细胞壁中的脂类和脱去细胞内的有机染料。

8、革兰氏染色时，为什么不能涂片太厚？

答案：涂片太厚，容易使菌体重叠，造成假阳性。

9、革兰氏染色时，为什么说脱色（乙醇脱色）是最关键的一步？

答案：如果脱色时间较短，则容易使革兰氏阴性细菌脱色不完全，造成假阳性；如果脱色时间较长，则容易使革兰氏阳性细菌内的染料被脱出，造成假阴性。

10、革兰氏染色时，如何证明你的染色操作是正确的？

答案：将革兰氏阳性细菌—葡萄球菌与革兰氏阴性细菌--大肠杆菌制成混合涂片，经革兰氏染色后，如果葡萄球菌呈紫色，而大肠杆菌呈红色，则说明染色操作是正确的。

11、固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同？

自然死亡的菌体本身已经部分自溶，结构已经改变。固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。

12、不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？

能。在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰氏阴性菌。最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。

三、无菌操作（补充）

1、无菌操作过程中，为什么试管或三角烧瓶在开塞或回塞之前，口部要过火几次？

答案：这样可以烧去管口或瓶口的微生物。

2、开塞后的试管或三角烧瓶口部微生物要平放？

答案：如果口部向上或朝下，则容易通过空气对流污染培养物。

3、接种针接种前后微什么要过火焚烧？

答案：主要防止微生物培养物之间交叉污染，也防止污染操作台面。

4、. 试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。

答：高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

操作方法：加水——装料、加盖——排气——升压、保压、和降压——取料

5、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。

答：通过观察菌落特征；单个菌落再次划线分离。

6、为什么干热灭菌比湿热灭菌所需温度高时间长？

在湿热条件下，有水蒸汽的作用：

a高温水蒸汽导热比干空气要快；

b高温水蒸汽冷凝变水时有放热过程；

c高温水蒸汽能穿透细菌的细胞膜，直接进入细胞内破坏细胞；

c高温水蒸汽能水解一部分细胞结构，加速导热。

（湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的穿透力比干热大；湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2．26kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。）

8、人工培养基：人工配制的供微生物生长繁殖并积累代谢产物的一种营养基质。

9、.天然培养基：由化学成分不完全清楚的天然物质如马铃薯,麸皮等配制而成的培养基。

10、巴氏消毒：巴氏消毒是法国微生物学家巴斯德发明的一种消毒方法。是在62-63℃的条件下,保温半小时杀死微生物的营养体(主要是病原菌)的方法。

11、间歇灭菌：利用100℃的温度杀死微生物的营养体.每次1小时连续三天,中间的空隙时间让未杀死的芽胞萌发成营养体,在下一次100℃的温度下被杀死。如此反复两次可将培养基的微生物(包括芽胞)全部杀死。该方法适用于没有高压灭菌器的地方进行灭菌处理。

12、过滤除菌:利用一定孔径的滤膜阻止微生物的通过而除去溶液中或者空气中微生物的除菌方法

13、消毒:只杀死微生物的营养体(主要是病原菌),而不能杀死微生物的芽胞的除菌方法。

14、灭菌:利用物理或化学方法杀死所有微生物包括细菌的芽胞的除菌方法称为灭菌。

四、细菌的染色及活细菌的运动性观察

1、细菌的鞭毛染色的原理

答案：细菌的鞭毛较细，在普通光学显微镜下无法观察。但可以通过对鞭毛进行染色，再结合染料堆积使鞭毛加粗，从而便可以在普通光学显微镜下观察鞭毛的形态。一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景很脏，影响观察效果。

2、鞭毛染色时，应注意哪些环节？

答案：用新培养的并且转接2-3次的菌种为易，因为老化菌种的鞭毛易脱落；载玻片要干净，防止鞭毛变态；挑菌时应不带培养基；干燥后应尽快染色防止鞭毛脱落。

3、细菌运动性观察时，菌液中的细菌与灰尘颗粒的运动有什么区别？

答案：菌液中的细菌常常会由一个位置运动到另一个位置，而灰尘颗粒的运动属于布郎运动，位置基本不变。

4、一般运动性细菌的运动方式有几种？

答案：细菌运动主要包括直线、波浪或翻滚式运动。

5、如何用悬滴法观察细菌运动？

答案：悬滴法观察细菌运动。取干净的凹玻片与盖玻片个一块，并在盖玻片的四角涂少许凡士林。加一滴变形杆菌菌液于盖玻片中央，并轻轻翻转，使菌滴直对凹玻片凹陷处，轻压于凹玻片上。镜检，观察细菌的运动情况。在观察细菌运动时，应注意区分非菌颗粒与细菌细胞，前者的运动属于原地布朗运动，而后者做移位运动。

6、芽孢染色的原理是什么？用单染色可以看到芽孢吗？

答案：由于芽孢壁厚，不易着色，所以须采用着色力强的染色剂，并需加热，以便提高芽孢壁的透性，使染料易于进入菌体。用单染色可以将看到芽孢，但是无色的。

7、芽孢染色加热时，为什么染料不能沸腾？

答案：因为染料沸腾后，容易时菌体从载玻片上脱落。

8、荚膜染色时，为什么荚膜不易着色？

答案：荚膜主要成分是多糖，很难着色，同时水洗时多糖易溶于水，因而只能采用衬托的方法将背景与菌体染色，而衬托出白色而透明的荚膜。

9、荚膜染色时，为什么不允许加热？

答案：荚膜很薄，加热容易变形。

10、如何观察细菌荚膜？

答案：采用衬托法进行。取干净的普通载玻片，并在载玻片的一端滴加蒸馏水，将巨大芽孢杆菌轻沾于水滴中。加少许墨汁于菌滴中，加盖玻片，轻轻挤压，除去多余的液体。镜检，可以观察到菌体周围的白色荚膜。

11、细菌与酵母菌的菌落有何区别

答：细菌菌落光滑，易于基质脱离；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚且酵母菌的菌落较湿润12、能否用血球计数板在油镜下进行计数？为什么？

答：不能。计数时滴在血球计数板上的是菌悬液，相当于在镜头和计数板直接加了一层水。

13. 菌种保藏中，石蜡油的作用是什么？

答：作用是密封。防止空气进入，降低菌种的生理活性。

14. 经常使用的细菌菌株，使用哪种保藏方法比较好？

答：用甘油冷冻保藏方法保存，在液体培养基中加入百分子十五的甘油，然后低温冷冻（-7度）左右。

五、酵母菌形态观察及死活细胞鉴别

1、吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同对酵母菌死细胞数量有何影响?是分析其原因。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。

美蓝浓度高了，代谢不太活跃的活细胞也会被染色，从而使观察到的死细胞较多，活细胞较

少；反之，则代谢微弱的细胞也能还原美蓝，不被染色，从而使观察到的死细胞较少，活细胞较多。

2、显微镜下细菌放线菌酵母菌和霉菌的主要区别是什么？

放线菌与细菌需要在油镜下才能观察清楚，而霉菌和酵母菌在低倍镜下即可看到。

细菌：为细而短的单细胞微生物（个体微小），主要形态有：球、杆、螺旋状等。（部分杆菌还可形成芽孢）

放线菌：存在分枝丝状体和菌丝体，革兰氏阳性菌，有孢子丝和孢子（球形、椭圆形、杆状、柱状）。

酵母菌：单细胞，菌体呈圆球、卵形或椭圆形，少数呈柠檬形、尖形等。菌体比细菌大几倍到几十倍，部分处于出芽繁殖过程中菌体还可观察到芽体，大多数菌体上还有芽痕。

霉菌：菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍到几十倍，在低倍镜下即可看到，并还可看到孢子囊梗、囊轴、孢子囊、包囊孢子等。

3、测定细胞数目的方法有直接计数法（如血球计数板计数计数）和间接计数法（如平板菌落计数法）

显微镜计数的优点是直观、快速、操作简单，缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和，且难以对活动性强的活菌进行计数。

其中血细胞计数板较厚，不能使用油镜，常用于个体相对较大的酵母细胞，霉菌孢子等计数。

4、稀释平板计数法

将一定量的样品经十倍稀释后,用平板培养最后三个稀释度的样品稀释液。待菌落长出后,计数出某一稀释度的菌落数后再乘以稀释倍数,即为样品中的含菌数。

5、显微直接计数

利用血球计数板或细菌计数板在显微镜下测计出每小格的微生物细胞数量后,再换算出单位体积中微生物细胞总数的测数方法。

六、环境因子对微生物生长的影响

1、pH对微生物生长作用的原理是什么？细菌、真菌和放线菌所需要的最佳pH为多少？

答案：pH对微生物生长作用的原理是：使蛋白质和核酸等大分子物质的电荷发生变化影响微生物活性；影响细胞膜表面电荷，进而影响微生物对营养物质的吸收；改变环境中营养物质的可给性及有毒物质的毒性。细菌要求pH为7.0-7.2，真菌pH自然，放线菌pH为7.2-7.4。

2、重金属对微生物影响的机理是什么？

答案：使菌体变性或与-SH基结合，导致微生物酶失活。

3、氯化钠等盐类对微生物的影响机理？

答案：通过调节微生物细胞的渗透压影响微生物。

七、培养基的配制、消毒、灭菌与土壤微生物分离

1、培养基配制原则是什么？

答案：目的明确；根据微生物的营养需要；注意各种营养物质的浓度配比；要控制具体pH、渗透压、水活度和氧化还原电位；经济。

2、培养基配制应注意什么？

答案：称取药品蛋白胨时要迅速，防止吸潮；培养基融化时要不断搅拌以防烧焦；针对不同的培养基要调节适当的pH；培养基灭菌时应按高压蒸汽灭菌锅的操作过程进行，以免危险发生。灭菌后培养基要及时处理，防止凝固或污染。

3、为什么培养微生物时，平板培养基要倒置？

答案：第一培养基倒置可以防止冷凝水落到培养基表面，使菌落分散开；第二可以防止空气对流，污染培养基。

4、为什么高压蒸汽灭菌效果好？

答案：因为在湿热情况下，湿热的穿透力强，菌体吸收水分使蛋白质容易凝固，而且当蒸汽与菌体接触后冷凝成水时可以放出热量，进而提高锅内的温度。

5、如何使用高压蒸汽灭菌锅？

答案：首先检查灭菌锅内的水是否没过电阻丝，然后放上装有物品的内桶。注意物品不要过多。将盖子上的通气管插入内桶壁上的管槽内，盖上盖子，用对角的方式旋紧螺扣，接通电源，开始灭菌。当压力指针达到0.05KPa时打开放气阀放气，反复放气三次以便排除锅内的冷空气。放气结束后，使指针升到压力为0.1KPa，并通过人为控制电源的开闭，在0.1KPa 压力下维持20-30min。灭菌结束后，通过冷却使锅内的压力下降到0.05，打开压力阀放气，待压力为0时，对角旋开螺扣，取出物品即可。

6、分离土壤微生物时，细菌、酵母、真菌和放线菌的培养基分别是什么？

答案：细菌：营养琼脂培养基PH 7.0-8.0

放线菌：高氏一号培养基PH 7.5-8.5

酵母菌：麦芽汁培养基PH 3.8-6.0 YPDA培养基

霉菌：马铃薯培养基PH 4.0-5.8

7、做空白对照实验的目的?

答：目的是检验培养基是否受到污染，验证无菌操作。

8、半固体穿刺法

将待检细菌穿刺接种在半固体试管培养基中,若细菌仅沿穿刺线生长,说明细菌不运动。若细菌沿穿刺线向周围扩散生长,说明细菌有运动性。

9、为什么分装于三角瓶中的培养基装量不能过多？

答：①分装量太多，三角瓶内培养极易沾染瓶口及棉塞而造成污染；②分装量太多不利于震荡摇匀；③分装量太多会使培养基灭菌不彻底。

10、选择培养基:根据使用的目的,控制培养基的组成成分,使之有利于某种微生物的生长而限制其它微生物的生长,从而能从自然界混杂的群体中分离出某一种单一的微生物。如无氮培养基用来分离土壤中的自生固氮菌。

11、加富培养基:在基本培养基中加入血清,动植物组织液或者其它生长因子而配制出来的营养特别丰富的培养基。

12、鉴别培养基:根据微生物的代谢特点,通过指示剂的显色反应,用以鉴别不同微生物的培养

八、细菌的生理生化反应

1、你如何解释淀粉酶是胞外酶？

答案：淀粉酶是胞外酶可以通过观察固体培养基表面的淀粉降解圈或透明圈的大小来解释。

2、糖发酵过程中如何证明有气体产生？

答案：在糖发酵过程中，有些微生物可以利用糖产生有机酸并产生气体，我们可以在发酵管中加入得汉氏小管，如果产气，小管内就会有气泡存在。

3、吲哚实验的原理是什么？

答案：吲哚实验的原理是：某些微生物可以分泌色氨酸酶，该酶将蛋白质中的色氨酸分解为吲哚和丙酮酸，吲哚可以与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚，进而证明色氨酸的分解。

4、甲基红实验的原理是什么？

答案：甲基红在pH中性时呈现橘黄色，而在酸性条件下则为红色，所以当葡萄糖被分解产生有机酸时，可以甲基红在酸性条件下则为红色。

5、伏-普实验的原理是什么？

答案：伏-普实验的原理是：该实验是用来检验某些细菌利用葡萄糖时可产生中性末端产物，如丙酮酸，丙酮酸进行缩合、脱羧生产乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被氧气氧化成二乙酰。二乙酰可以与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。

6、硫化氢实验原理是什么？

答案：硫化氢实验原理是：某些肠道细菌可以分解含硫有机物，并形成硫化氢，该气体与醋酸铅反应形成黑色的硫化铅沉淀。

34. 大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管？

答：因为乳糖胆盐发酵管中的成分有溴甲酚紫，中性时呈蓝紫色，酸性时呈黄色，如果颜色不变（呈蓝紫色），说明无产酸的大肠菌群；如果颜色变黄色，说明可能出现能分解乳糖产酸的大肠菌群；胆盐可以抑制其它细菌生长繁殖；看杜氏小管中是否有气体，判断是否为分解乳糖产酸产气的大肠菌群。

九、营养缺陷型的筛选与鉴定

1、紫外诱变的机理是什么？

答案：紫外诱变的机理是紫外线引起胸腺嘧啶二聚体，从而导致DNA结构改变，进而引起机体突变或死亡。

2、紫外线诱变后，为什么不能马上见光？

答案？由于紫外线诱变后，如果马上给以可见光照射，则菌体中会产生光复活酶，进而对突变进行修复。

3、什么是营养缺陷型？

答案：营养缺陷型是指用物理或化学诱变使其基因发生突变从而丧失某种生长因子的合成能力，必须在基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的突变型菌株，与之相对的是野生型菌株。

4、淘汰野生型的原理是什么？

答案：淘汰野生型也叫营养缺陷型的浓缩，由于抗生素（如青霉素等）可以抑制细菌细胞壁的形成，所以野生型在基本培养基中生长过程中，被杀死，而营养缺陷型则不能在在基本培养基中生长，但仍然存活，所以当再次转接到完全培养基中时，便可淘汰野生型。

5、筛选营养缺陷型时，为什么要不停搅拌？

答案：这样可以使微生物细胞均匀地接受紫外线辐射，提高突变率。

十、菌种的保藏

1、菌种保藏的原理是什么？

答案：采取不同手段使微生物的代谢活性处于最低状态。

2、菌种保藏的意义？

答案：菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。

3、斜面和液体石蜡保存菌种法所需的温度为多少？

答案：斜面和液体石蜡保存菌种法所需的温度均为零上4℃

4、斜面保存菌种法利弊？

答案：前者在斜面培养基表面接种培养后，储存在零上4℃冰箱中，简单、方便，不需要特殊设备等，但由于微生物与空气接触，所以保存时间短、需要定期接种传代，易污染，菌种特性易改变

5、液体石蜡保存菌种法利弊？

答案：该方法也具有简便实用，不需要经常移种。但保存时需直立放置，占用空间较大，不便携带。