华南农业大学研究生开题报告介绍

华南农业大学

硕士研究生学位论文开题报告

学号:2013200215

姓名:任毅

学院:生命科学学院

专业(领域):植物学

研究方向:观赏植物生物技术

导师姓名:杨跃生

攻读学位:硕士学位

2015年3月15日

论文题目三倍体紫锥菊的变异与花药培养

选题来源自选论文类型应用基础研究开题日期2014年3月涉密否

一、立题依据（包括研究目的、意义、国内外研究现状和发展趋势，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）

紫锥菊（Echinacea purpurea L.）是菊科（Asteraceae）紫锥菊属（Echinacea）的多年生草本植物，原产于美国中东部和加拿大南部（李鹏等，2007）。紫锥菊中含有多糖，咖啡酸衍生物，烷基酰胺等化合物，具有提高机体免疫力和抗炎的作用，是国际上最受重视的少数几种药用植物之一（李继仁等，2002；王弘，2001；Barrett B，2003)。

1紫锥菊基本概述

目前，国际上对紫锥菊的研究已经从多方面开展，最主要的是紫锥菊的有效成分及药理活性，而与本报告关系密切的组织培养和遗传育种等方面也有一定程度的研究。

紫锥菊中的有效成分之一是多糖及糖蛋白。对紫锥菊的水相提取进行分离和药理活性测试得到两种具有免疫活性并且相对分子质量在35,000~450,000的多糖（岑国栋等，2010）,紫锥菊所含的多糖成分能够刺激巨噬细胞杀伤肿瘤细胞，抗菌和增强机体免疫力的功能（张莹等，2001；肖培根，1996）。咖啡酸衍生物是紫锥菊中另一类重要的药理活性物质，紫锥菊地上部分及其根的乙醇提取物中含有咖啡酸类衍生物,包括菊苣酸、绿原酸、咖啡酸、紫锥菊甙等，紫锥菊咖啡酸衍生物中主要为菊苣酸。菊苣酸具有增强免疫抗炎功能,并能抑制透明质酸酶,保护胶原蛋白Ⅲ免受可导致降解的自由基的影响（吴华, 2010；张广求，2010）。

2紫锥菊的组织培养与遗传育种的研究

（1）紫锥菊的组织培养技术的建立

由于紫锥菊具有巨大的药用价值，对紫锥菊的优质，高产提出了新的要求。植物组织培养技术为解决这一问题提供了新的途径（Abbasi et al,2007）。Zobayed等让人利用两种细胞分裂素6-苄氨基腺嘌呤（BAP）和苯基噻二唑脲（TDZ）分别与生长素吲哚乙酸（IAA）结合使用，利用紫锥菊的叶柄作为外植体，分别诱导出了体细胞胚和不定芽（Zobayed et al，2003a）。Choffe等人利用吲哚-3-丁酸从紫锥菊的子叶和胚轴诱导出根器官（Choffe et al，2000）。Koroch等人用细胞分裂素BAP和生长素NAA从紫锥菊的叶片诱导出不定芽，证明以紫锥菊叶片为外植体获得无菌苗是一种可行的方法（Koroch et al，2002）。Zobayed等人利用紫锥菊叶片，子叶和根外植体诱导不定胚，在添加有细胞分裂素BAP和生长素吲哚-3-丁酸的培养基中均诱导出体细胞胚，并且14天的暗培养条件能够

有利于出胚率，体细胞胚在无激素的培养基上萌发后转入添加有生长素萘乙酸（NAA）的培养基中能够正常生根（Zobayed et al，2003b）。所以紫锥菊的胚轴，子叶，叶片，叶柄和根均能够作为外植体获得无菌苗，同时也说明紫锥菊同样能够以胚胎发生途径和器官发生途径形成不定芽。随后的研究表明，不同的基因型对激素的反应是不同的，Li等利用6个田间表型不同的紫锥菊作为原始材料，研究对不同BAP浓度的反应，结果表明，不同基因型以及不同外植体（叶片，叶柄和根）对同浓度的BAP的反应不同（Li et al，2013）。Pan等从紫锥菊叶片中游离出原生质体并将原生质体培养成为完整植株，原生质体的成功培养将为获得新的种质资源提供新的途径（Pan et al，2004）。至此，能够从细胞水平，组织水平均能能够成功诱导出紫锥菊的再生植株。

（2）紫锥菊的倍性育种

在对紫锥菊的离体培养，不仅是要利用叶片，叶柄，胚轴和子叶等作为外植体建立紫锥菊的快繁体系，需要更进一步利用组织培养技术为手段进行各种遗传改良。其中对紫锥菊的遗传育种的研究主要集中在多倍体的诱导方面。因为药用植物加倍后，会出现植株巨大化，抗性增加和药用活性成分增加的优良性状（何韩军等，2010）。Nilanthi等人利用二倍体紫锥菊的叶柄作为外植体，在MS培养基中利用120mg/L的秋水仙素处理7天，得到四倍体完整植株，与二倍体植株相比，在形态学上有明显的差异，四倍体植株气孔较大，次生根较多且成熟四倍体植株的花序较短（Nilanthi et al，2009）。

对紫锥菊的育种研究中利用的另一种重要的方法是花药培养技术。Zhao等首先利用二倍体紫锥菊花药培养的方式，使花药中未成熟的小孢子经过脱分化和再分化的过程形成再生植株（Zhao et al，2006）。花药培养的主要目的是进行单倍体育种和获得纯和的二倍体或者多倍体植株，缩短育种周期和提高育种效率。自从花药培养技术建立以来，经过多年的研究与发展，已经与常规的杂交育种，远缘杂交育种，诱变育种和基因工程等形成配套的育种技术（周旭红等，2007）。但是，花药培养受很多影响因子的控制。材料的基因型，花粉的发育时期，预处理，培养基成分以及培养条件都能够影响小孢子发育形成愈伤组织（张绿萍等，2007）。付迎军等探讨了花药培养诱导胚状体或者愈伤组织与材料基因型之间的关系，不同基因型的玉米，其诱导率之间的差异非常明显，总的来说杂交种的诱导率要比纯系高（付迎军等，2004）。王延玲等研究表明,矮牵牛花药培养中单核期的小孢子易产生单倍体植株,双核期易产生二倍体植株,而双核晚期易产生三倍体植株（王延玲等，2006）。庄军平等研究温度对辣椒花药愈伤组织形成的影响，结果表明在接种前将花

蕾置于4℃条件下处理3~5天有利于遇上组织的形成（庄军平等，2001）。本研究室在研究利用二倍体紫锥菊经花药培养形成单倍体的试验中，表明N6培养基对遇愈伤组织的诱导要优于MS培养基。目前，花药培养还有很多问题没有解决，例如，由于花药培养容易受各部分组织的干扰，培养产物不可能全部由花粉发育而来，致使产生不同倍性的混杂体，这给再生植株起源的确定和染色体倍性鉴定带来了麻烦。

（3）组织培养过程中体细胞克隆变异

体细胞克隆在早些时候仅仅用来描述在细胞培养和组织培养中的变异，目前而言的定义是在离体培养过程中，再生植株具有的一系列遗传学（例如倍性的改变和染色体结构的改变）和表观遗传学（例如DNA的甲基化）的改变，这种现象称为体细胞克隆变异（somaclonal variation SV）（Wang et al，2012）。一方面，在植物组织培养过程中，不可控的体细胞克隆变异可能会造成某一性状的改变，这对组织培养又提出了新的挑战，另一方面，体细胞克隆变异会造成新的性状的产生，对于农作物或者经济作物而言，又是一种新的种质资源的来源（Larkin et al,1981）。Michael等人综述了在植物组织培养过程中体细胞克隆变异的原因和检测方法，组织培养过程中变异的原因很多，例如外植体来源是嵌合体，转座子的活性，离体培养的方法，植物激素的种类和浓度，继待培养周期的长短都能导致变异。对体细胞克隆变异的检测可以利用形态学的方法，生理生化的方法，细胞学的方法和分子生物学的方法。形态学的方法比较直观，可以利用植株的高度，叶片的形态和色素的沉积等性状去判别。但是，植株的生长状态受环境因子的影响比较大，不能反应植株遗传组成的指标。生理生化的方法较形态学的方法较快和较早就能检测出变异，例如利用变异植株和正常植株对光照，植物激素的反应的差异，检测植株中代谢物的差异等。细胞学的方法可以检测DNA和RNA的含量，统计染色体数目等（Michael et al，2011）。

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二、研究内容和目标（说明课题的具体研究内容，研究目标和效果，以及拟解决的关键科学问题。此部分为重点阐述内容）

（一）本课题研究的具体内容

1三倍体不定芽再生植株的遗传稳定性研究

本课题组在之前的研究中，利用紫锥菊二倍体和四倍体杂交获得一颗三倍体无菌植株，将三倍体无菌苗的根，茎，叶分别作为外植体诱导不定芽再生，生根。然后将三倍体组培苗种到温室花盆里，后期观察到4个株系开花时间和花序的长度存在差异。所以将4个株系做以下试验：

（1）三倍体栽培性状变异株系的组织培养反应的差异研究

i研究对BA浓度的反应。利用这4个株系作为初始研究材料，将叶片做为外植体，分别观察在不同的BA浓度的培养基中是否会有差异。

ii研究对DA-6的反应。本研究室在之前的研究中，DA-6能够明显改善紫锥菊不定芽的生根状况。所以，本次研究取探讨4个株系的不定芽对DA-6的反应。

通过统计4个株系在添加有不同BA浓度的培养基中的不定芽再生率和研究不定芽在添加有不同DA-6浓度的培养基中的生根状态，从而能够从生理方面初步判定三倍体克隆苗在无性扩繁的过程中是否发生体细胞克隆变异。

（2）三倍体栽培性状变异株系在组织培养中的染色体数目稳定性研究

研究4个株系的染色体数目变化情况。利用根尖压片的方法统计4个株系的染色体数目变化情况。

在组织培养过程中，培养环境对于植物组织而言是一个胁迫，可能会导致染色体的结构和数目，基因的突变等。本次实验通过统计4个株系的再生植株的根尖染色体数目，探讨三倍体紫锥菊在无性扩繁的过程中染色体数目的稳定性。

（3）三倍体栽培性状变异株系的药用成分含量比较

当紫锥菊的物候期进入果熟期时，利用HPLC分别测定4个株系的二年生植株的地下部分和地上部分的菊苣酸的含量。

通过利用HPLC测定4个株系的二年生植株的地上部分和地下部分的菊苣酸的含量，比较株系之间药用成分的积累是否有差异。

2三倍体紫锥菊的花药培养研究

（1）探究不同预处理条件对三倍体花药培养过程中愈伤组织形成的影响。预处理条

件对花药培养过程中愈伤组织的形成或者小孢子发育有重要作用，通过实验，探究预处理条件与愈伤组织诱导率之间的关系。

本次研究利用不同预处理方法处理三倍体紫锥菊的花序，探讨不同预处理方法对花药培养愈伤组织的形成（小孢子的发育情况）的影响。以及期望能够获得一个能够诱导三倍体花药形成愈伤组织或者小孢子发育的较优的预处理条件。

（2）诱导愈伤组织形成不定芽。探究激素的种类和浓度，基本培养基的类型等培养条件对诱导不定芽的影响。

在三倍体紫锥菊花药培养的预试验过程中，三倍体花药培养形成愈伤组织的不定芽诱导率较低，甚至部分愈伤组织在培养过程中就会自发死亡。通过试验，希望能够提高愈伤组织的不定芽再生率。

（3）将得到的不定芽生根，通过根尖压片鉴定植株的倍性。

三倍体花药培养的最终目的是获得非整倍体植株。三倍体中花粉母细胞的减数分裂紊乱，从而形成的小孢子中染色体不均衡，部分小孢子在花药培养的过程中可能会发育成为一株完整植株。而从三倍体花药诱导出的植株还需要做倍性的鉴定，因为在花药培养的过程中，花药壁，花丝残留部分等都有可能发育形成愈伤组织，通过这些组织诱导的再生植株依然是三倍体植株。然而三倍体紫锥菊花药培养的最终目的是希望能够获得非整倍体植株，通过染色体压片，统计根尖分生区细胞的染色体数目，寻找非整倍体植株。

（二）拟解决的科学问题

（1）植物组织培养过程中，植株的再生通常会经历脱分化和再分化的过程，首先脱分化形成愈伤组织或者体细胞胚，然后经过愈伤组织再分化出不定芽，最后形成完整植株或者直接经体细胞胚萌发形成完整植株。在脱分化的过程中，通常会发生染色体数目和结构的改变，基因（碱基）水平的变异等。在本次研究中，所利用的材料是从一颗三倍体种子萌发而来，后经多次的无性扩繁得到的无菌苗，所以如果是发生某种变异（染色体水平或者分子水平的变异）只可能是在无性繁殖的过程中发生的，或者说是被诱导的。通过本次实验能够从生理生化方面去证明三倍体再生过程中是否能够保持其遗传稳定性。

（2）在三倍体的离体培养过程中，受到培养光照，激素等各种理化因子的影响。光照对植物的细胞，组织和器官水平的培养均有影响，在离体培养过程中，光对愈伤组织的形成可以促进，也可以抑制，主要取决于光的波长和辐照强度。在紫锥菊的离体培养过程中，光照对诱导不定芽有明显的影响，预先暗培养一段时间可以明显提高不定芽和体细胞

胚额再生率，目前认为可能是暗培养可能改变外植体内源激素的水平，或者使外植体对外援激素的反应更加敏感。在植物组织培养过程中，不定芽的再生往往取决于细胞分裂素和生长素的比例，当此比列较高时有利于不定芽的再生。在紫锥菊的培养过程中，使用较多的激素种类为BA和NAA，两者不同的浓度比例对不同外植体（根，叶片，叶柄，子叶和胚轴）不定芽的影响都会不同。而不同的激素种类配合使用可以诱导紫锥菊通过不同的发生途径，当BA和IBA结合使用时，有利于体细胞胚的发生。

（3）花药培养是利用花药作为外植体进行培养。在在其的研究中发现，只有在发育到特定时期的小孢子对离体刺激才最敏感，大多数的研究证明，单核期的小孢子容易取得成功，在紫锥菊的二倍体的花药培养过程中亦是如此。为了得到良好效果，在花药接种前都要经过一定得预处理，这些预处理包括黑暗处理，光质处理，高渗处理，药物处理以及温度处理等。

关于小孢子胚胎发育的机制，目前的研究还不够充分，较早的观点有“花粉二型性”与“饥饿”假说。花粉二型性是指同一花药中存在两类不同的花粉，一类为正常花粉，它们细胞质浓，染色较深，发育较一致，另一类为异常花粉，它们的细胞质较淡，染色较浅，发育落后。在花药培养中，后一类花粉具有花粉胚的能力。另一假说为“饥饿”假说，即某种物质的亏损。饥饿被看作是胚胎发生启动的重要条件。根据已有的研究成果，可以将小孢子胚胎发生机制综合为“胁迫转换假说”，即小孢子存在配子专一性的基因，同时还存在启动孢子体发育的胚胎专一性基因，对小孢子进行相应的胁迫处理，可以抑制配子专一性基因的表达，而激发胚胎专一性基因的表达，使小孢子转向孢子体发育。研究表明，对小孢子进行一定的预处理和改进培养基的培养方法，都可以使小孢子由配子体发育途径向孢子体发育途径转换。这样的处理条件包括对植株进行饥饿，短日照和低温处理，对切取得花序，花蕾和花药进行冷激，热激或化学处理。

三倍体花粉母细胞的产物中遗传物质是极其混乱的，但是当一个配子中拥有能够维持其基本生命活动所需的全部遗传物质使，配子是可能存活的。当对三倍体植株，花序或者花蕾给予适当的预处理和合适的培养条件，就有可能诱导三倍体花药中小孢子从配子体发育途径向孢子体发育途径转换。

三、研究方案设计及可行性分析（包括：研究方法，技术路线，理论分析、计算、实验方法和步骤及其可行性）

1研究方法

（1）利用组织培养技术扩繁三倍体紫锥菊，保留材料。种植三倍体材料和形态学观察。

（2）利用根尖压片的方法，统计根尖分生区细胞的染色体数目和三倍体花药培养再生植株的倍性鉴定。

（3）利用HPLC 测定紫锥菊植株中菊苣酸或绿原酸的含量。

（4）三倍体紫锥菊的花药培养技术。

2技术路线（注：蓝线以下为本次研究的主要内容）

获得二年生紫锥菊花序

利用二倍体和同源四倍体杂交获

得三倍体植株

HPLC 测定二年生紫锥菊菊苣酸和绿原酸的含量

4个表型不同的株系（花序的差异）继续克隆，保种

植株倍性鉴定

研究不定芽对DA-6的反应根尖染色体统计

诱导不定芽生根从愈伤组织诱导不定

芽

研究不同的预处理条件与愈伤组织形成的关系

不定芽再生研究不同株系对BA

浓度的反应栽培三倍体紫锥菊，形态

学观察

三倍体植株的克隆，扩繁

3理论分析

在离体培养过程中，再生植株具有的一系列遗传学（例如倍性的改变和染色体结构的改变）和表观遗传学（DNA的甲基化）的改变，这种现象称为体细胞克隆变异（somaclonal variation,SV）。

从遗传学角度讲，体细胞克隆变异的原因有两个，一是细胞分裂过程中发生异常，包括染色体数目的改变（产生整倍体细胞和非整倍体细胞）和染色体结构的改变（染色体的倒位，易位，缺失和重复），一般认为，在植物离体培养过程中，细胞有丝分裂时异染色质的复制滞后从而导致染色体的断裂，造成染色体数目和结构上变异。二是DNA分子中某一段特殊序列发生改变，这种类型的体细胞克隆变异可以利用一些分子生物学的方法（RFLP,RAPD,AFLP,ISSR和SSR）去检测。

植物组织培养能够激活在再生植株中的转座子。然而，当转座子插入到内含子或者启动子中时，一般不会有表型的变化，而当转座子插入到某一个基因中时，就会出现表型的变化。而转座子的活性却和DNA的甲基化改变有关。在许多植物的组织培养过程中，某一特殊位点的DNA甲基化水平或者整个基因组的甲基化水平都会发生改变。

对体细胞克隆变异的检测可以利用形态学的方法，生理生化的方法，细胞学的方法和分子生物学的方法。形态学的方法比较直观，可以利用植株的高度，叶片的形态和色素的沉积等性状去判别。但是，植株的生长状态受环境因子的影响比较大，不能反应植株遗传组成的指标。生理生化的方法较形态学的方法较快和较早就能检测出变异，例如利用变异植株和正常植株对光照，植物激素的反应的差异，检测植株中代谢物的差异等。细胞学的方法可以检测DNA和RNA的含量，统计染色体数目等。

在本次研究中，将三倍体扩繁，栽培与温室中，发现4个株系的一年生植株的开花时间以及花序高度上存在明显差异，所以进一步利用生理生化的方法验证是否发生变异。

减数分裂的正常进行是物种能在自然条件下保持及繁衍的基础。在自然界中同源多倍体由于染色体倍数的增加导致减数分裂过程异常，在减速分裂后期I染色体不能产生均衡分离，导致配子中染色体数目是不尽相同的。

同源三倍体有三个染色体组。但在减数分裂过程中任何区段内只有2条染色体能够联会而将第3条排斥在外，三条染色体有有两种联会方式：一是三条染色体均参与联会形成

三价体，但在任何区段内只有两条能够联会，减数分裂后期I只能以2/1的方式分离，即同源组中有两条染色体分向一级，另一条分向另一级。二是只有两条染色体参与联会，另一条不参与联会，在减数分裂后期I就可能以2/1方式分离，也有可能单价体消失在细胞质中，二价体均衡地分向两级。不管是哪一种情况，都会造成三倍体减数分裂产物中染色体组分不均衡。

在紫锥菊的同源三倍体中，有11个同源组，每一个同源组都有可能是上述两种分离模式，所以三倍体紫锥菊减数分裂产物中染色体数目是高度紊乱的。

在本次试验中，利用三倍体紫锥菊进行花药培养，期望能够得到非整倍体植株，为紫锥菊的非整倍体育种提供一条新途径。虽然三倍体花粉母细胞的产物中遗传物质是极其混乱的，但是当一个配子中拥有能够维持其基本生命活动所需的全部遗传物质使，配子是可能存活的。当对三倍体植株，花序或者花蕾给予适当的预处理和合适的培养条件，就有可能诱导三倍体花药中小孢子从配子体发育途径向孢子体发育途径转换。然而某些胁迫条件可能抑制花药中正常的三倍体细胞的脱分化，而有利于配子向孢子体发育。从而能够从三倍体紫锥菊的花药培养中诱导出非整倍体紫锥菊。

4实验方法和步骤，计算

（1）培养基的配制按实验室常规方法。

（2）实验步骤按技术路线进行。

（3）实验数据采用SPSS进行分析。实验处理各项目平均数后列出的误差项为各平均数的标准误；图表采用Microsoft Excel制作。

5可行性分析

本次研究主要有两个内容，一是三倍体紫锥菊的花药培养，二是三倍体紫锥菊的克隆苗的体细胞克隆变异。所涉及的实验内容的可行性分析如下：

（1）本次于是你就已经获得三倍体克隆苗，并且已经在温室里面有栽培，并在形态学上观察到一定的差异变化。

（2）本研究室长期从事紫锥菊的无性繁殖，非整倍体育种的研究，所以能够熟练地掌握紫锥菊的组织培养技术

（3）本研究室已经利用HPLC测定过菊苣酸和绿原酸的含量，所以能够保证本次实验正常进行

（4）本研究室从事过二倍体紫锥菊花药培养的研究，获得单倍体，并在2006年进行

报道，所以能为三倍体花药培养的研究提供必要的参考和经验。

四本研究课题的特色与新颖之处

有关体细胞克隆变异的研究报道已经有很多，但是在紫锥菊上还未曾有报道，本次研究希望能从形态学和生理生化两个方面初步判定三倍体紫锥菊的无性克隆苗是否发生了变异，能为将来的研究提供参考。

关于获得非整倍体紫锥菊的途径可以有多条，例如四倍体花药培养，杂交育种等。本次研究希望能从三倍体的花药培养中获得非整倍体植株，为紫锥菊的非整倍体的育种提供一条新的途径。

五、研究基础与工作条件（1.与本项目相关的研究工作积累基础2.包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决途径）

1工作基础（与本项目相关的研究工作积累）

目前已经得到三倍体植株较多的无菌苗，并移栽到室外种植。本研究室从事过二倍体紫锥菊花药培养的研究并获得单倍体，可以为本次研究提供参考。

本研究室已经利用HPLC的方法测定紫锥菊中的药用成分菊苣酸和绿原酸的含量，具体方法，步骤都已经掌握。

导师杨跃生研究员长期从事植物细胞工程和育种方面的科研工作，可以给予本实验较好的专业指导和充足的经费支持。

2工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决途径）

所在实验室拥有开展本论文工作所需要的多数仪器设备，包括植物组培设备，细胞学观察设备，药用植物有效成分提取设备，实验试材栽培的大棚温室和露地试验田。

学位论文工作计划

时间研究内容预期效果

2014.1-2014.3三倍体紫锥菊的扩繁

能够得到大量的克隆植株

2014.3-2014.4

三倍体紫锥菊的炼苗、

移栽

种植大约25株三倍体

紫锥菊实验材料

2014.4-2014.9

施肥，管理种植的紫锥

菊实验材料以及相关文献查

阅

能够得到长势良好的植株

2014.9-2015.3实验预实验

能够初步获得部分实验数据

2015.3-2015.9

4个株系对BA浓度，

DA-6的反应实验

能够积累实验数据

2015.7-2016.2

三倍体花药培养以及再

生植株的倍性鉴定

能够得到再生植株

2015.11-2015.12

HPLC测定菊苣酸和绿原

酸含量

得到4个株系菊苣酸和

绿原酸的含量

2016.1-2016.6

完成论文的撰写，顺利

毕业

顺利毕业

导师意见（是否同意继续攻读硕士学位）

导师（签名）：

日期：年月日

开题报告指导小组意见：（重点对选题的新颖性与可行性作出简要评价）

小组成员（签名）：

日期：年月日

学科意见：

1.选题与导师研究方向符合度符合()一般()不符合()

2.选题的新颖性强()一般()不明显()

3.研究的可行性可行()一般()不可行()

4.研究的工作量充足()一般()不足()

5.总体评价优()良()中()差()

学科专家签名：

学院（盖章）：

日期：年月日