第四章 离心技术

第四章 离心技术

离心机是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于该旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。离心机的种类繁多，用途各异，本章只介绍生物离心机的基本原理、方法及其在医学检验上的应用。

一、离心理论

1、离心分离的原理

将处于悬浮状态的细胞、细胞器、病

毒和生物大分子等称为―颗粒‖。每个颗粒

都有一定大小、形状、密度和质量。当离

心机转子高速旋转时这些颗粒在介质中

发生沉降或漂浮，它的沉降速度与作用在

颗粒上的力的大小和力的方向有关。颗粒

除受到离心力(F c )外，还受到颗粒在介质

中移动时的摩擦阻力(F f )、与离心力方向

相反的浮力(F B )、颗粒处于重力场之下的

重力(F g )和与重力方向相反的浮力(F b )。各

力的作用方向见图4—1。此外，颗粒还受

到周围介质小分子的作用力，当颗粒很小

时，介质分子对颗粒的作用力十分明显，要使这种小颗粒沉降，需要更大的离心力。本节只讨论比介质分子大得多的颗粒，因此介质作用力不予考虑。下面将对各个力作详细的分析。

1）离心力

离心力(F c )的大小等于离心加速度ω2R 与颗粒质量m 的乘积，即：

F c ＝mω2R (4–1)

其中ω是旋转角速度（弧度/秒）,R 是颗粒离旋转中心的距离（cm ），m 是质量（克）。

2）重力

重力(F g )是颗粒质量与重力加速度的乘积用下式表示：

F g ＝mg (4–2)

重力的方向与离心力的方向互相垂直，同离心力相比显得十分小，可以忽略不计。例如：离开旋转中心12cm 的颗粒，在N ＝1,000转/分时离心，产生的离心力比重力大134倍。因为：

F c /F g ＝mω2R/mg ＝ω2R/g ＝(2πN/60)2R/980＝(2×3.1416×1000/60)2×12/980＝134

如在超速离心机中进行离心分离，其离心力更大，重力更可以忽略不计。同时颗粒由重力而产生的浮力(F b )也可忽略不计。

3）介质的摩擦阻力

b F g F C F B

F f

介质对颗粒的摩擦阻力(F f)用Stocke阻力方程表示：

F f＝6πηr p dR/dt （4–3）

其中η是介质的粘滞系数(厘泊，cP)；r p是颗粒的半径(cm)；dR/dt是颗粒在介质中的移动速度(cm/s)，又称为沉降速度，即单位时间内颗粒沉降的距离。上述方程只适用于球形颗粒，但不少生物颗粒并非球形，有椭球形、扁球形、棒形或线形等，这使情况更复杂。对于椭球形颗粒的Stocke阻力方程应改写成为：

F f＝6πηr p(dR/dt)f/f0（4–4）

其中f0为球形摩擦系数，f为同球形等体积的扁球形或椭球形的摩擦系数。从f/f0可以得出，颗粒偏离球形程度越大，f越大，则阻力F f值也越大。

4）浮力

在重力场中，浮力的定义是指被物体所排开周围介质的重量。但在离心场的情况下，颗粒的浮力与离心力方向相反，为颗粒排开介质的质量与离心加速度之乘积。用下式表示：

F B＝P m(m/P p)ω2R＝P m/P p mω2R （4–5）

其中P p为颗粒密度(g/cm3)，P m为介质密度(g/cm3)，m/P p为介质的体积，Pm (m/P p)为颗粒排开介质的质量。

综上所述，在离心场中，作用于颗粒上的力主要有离心力F c、浮力F B和摩擦阻力F f。当离心转子从静止状态加速旋转时，原来处于悬浮状态的颗粒如果密度大于周围介质的密度，则颗粒离开轴心方向移动，即发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向移动，即发生漂浮。无论沉降或漂浮，离心力的方向与摩擦阻力和浮力方向相反；当离心力增大时，反向的两个力也增大，到最后离心力与摩擦阻力和浮力平衡，颗粒的沉降(或漂浮速度)达到某一极限速度，这时颗粒运动的加速度等于零，速度dx/dt变成恒速运动。那么

F c＝F B＋F f（4–6）

将式4–1，4–3，4–5代入式4–6得

mω2R＝6πηr p dR/dt＋(P m/P p)mω2R （4–7）

其中球形体积V为4πr p3/3，m＝VP p＝(4πr3p/3)P p故4–7式可写成：

(4πr p3/3)(P p)(ω2R)＝6πηr p dR/dt＋(4πr3/3)(P p)(ω2R)

整理后得：

dR/dt＝4r p2 (P p－P m)/18ηω2R （4–8）

或者：

V＝dR/dt＝d2(P p－P m)18ηω2R （4–9）

上式d为颗粒直径(厘米)，对于非球形颗粒还应考虑f/f0的摩擦系数比，得：

dR/dt＝d2(P p－P m)/(18ηf/f0)ω2R （4–10）

从式4–10可见：①颗粒的沉降速度与颗粒直径的平方、颗粒与介质的密度差和离心加速度成正比，而与介质的粘滞度、颗粒偏离球形的程度成反比；②当颗粒的密度P p大于介质密度P m 颗粒发生沉降；当P p＜P m时，颗粒漂浮；当P p＝P m时，颗粒不沉不浮；③在离心加速度ω2R不

变的情况下，颗粒的沉降速度主要决定于颗粒的直径大小和颗粒的形状，而颗粒的密度所起的作用较小。

2、沉降系数

1924年，Svedberg定义沉降系数为颗粒在单位离心力场作用下的沉降速度。即：

S＝(dR/dt)/ω2R （4–11）

沉降系数的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达极限速度所经过的时间。沉降系数的单位用svedberg表示，量纲为秒，1 svednerg＝10-13秒，简称S。

将式4–10二边同除以ω2R，得到沉降系数的表示式：

S＝(dR/dt)/ω2R＝d2(P p－P m)/(18ηf/f0) （4–12）

从上式可知：在给定的介质中沉降系数的大小主要是由颗粒直径的平方和摩擦系数f/f0所决定。

3、相对离心力和离心时间

1）相对离心力(RCF)：是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地球引力的倍数。重力加速度g=980厘米/秒2。故RCF的公式如下：

RCF＝Fc/F g＝mω2R/mg＝ω2R/g

＝(2πrpm/60)2R/980＝1.118×10-5R(rpm)2

如以N代表rpm，同上式可转化为：

RCF＝1.118×10-5RN2（4–13）

其中R为离心转子的半径距离（cm），N为转速（转/分）。

一般情况下，低速离心时常以rpm来表示，超速离心则以g表示。计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转中心的距离R。由于转子的形状及设计差异，离心管的口部和底部到旋转轴中心距离差异很大。如：离心管口R＝4.8厘米，管底R＝8.0厘米，rpm＝12000

RCF口部＝1.118×10-5×(12000)2×4.8＝7737×g

RCF底部＝1.118×10-5×(12000)2×8.0＝12891×g

由此所见，作用于离心管口部和底部的离心力相差近乎一倍。这不仅说明了超速离心时用g 代替rpm的原因，也说明了R应指旋转轴中心到某被分离物质颗粒在离心管中所处位置的距离，该颗粒所受到离心力随其在管中的移动而变化。科技文献中，离心力的数据常指其平均值，即离心管中点的离心力。

为了便于进行转速和相对离心力之间的换算，Dole和Cotzias在式4–13的基础上制作了三者关系的列线计算图4–2，图示法较公式法计算方便。已知离心转子的半径、转速和相对离心力中的任意两个数值，可以求得第三个数值。在列线计算图中找到两数值对应的点位置，过两点作直线，直线与第三条列线相交，交点的数值即为所求第三者的值。

2）沉降时间(t)：在某一个介质中使一种球形颗粒从液体的弯月面沉降到离心管底部所需要的离心时间。沉降时间与沉降速度成反比。

t＝18η/[ω2d2(P p－P m)]ln(R max/R min) （4—14）

Rmax和Rmin分别代表转轴中心至离心管底部和液面的距离。

转子半径相对离心力转速

图4–2 离心机转数与离心力的列线图

如果已知某种颗粒的沉降系数(S)，则可估计其沉降时间(t)

t＝1/S［(lnR max－1nR min)/ω2］（4—15）

离心时间是由实验要求所决定，为了避免不稳定颗粒的凝聚、挤压损伤或变性失活，并使扩散所导致的区带加宽现象减弱，在保证分离的前提下，应尽可能缩短离心时间。相反，分离某些沉降较快的大颗粒时，为了达到预期的分离效果，往往使用粘度较大的梯度，以阻止颗粒的过度沉降，并延长离心时间。

4、离心机的分类

目前在生物医学领域内常用的离心机种类繁多，按其离心转子能达到最高转速分类有：低速离心机(在6,000rpm以下)、高速离心机(在25,000rpm以下)和超速离心机(在30,000rpm以上)。目前商售大型超高速离心机最高转速达100,000rpm，相对离心力803000×g。在超速离心机中，根据用途不同，又可分为制备型超速离心机、分析型超速离心机及制备分析两用型超速离心机。近年制备型与分析型界限在逐步消失，出现制备分析两用机，通过更换转子和装上光学附件进行分析工作。用制备型的区带转子或水平转子，运用密度技术可测定颗粒沉降系数、病毒或核酸的浮力密度，部分代替了分析型超速离心机功能。

表4—1 三种不同级别的制备离心机的比较类型普通离心机高速离心机超速离心机

最大转速(rpm) 6,000 25,000 30,000以上

最大RCF(g) 6,000 89,000 可达510,000以上

分离形式差速离心差速离心密度梯度区带分离或差速沉降分离

离心管平衡

允许误差

0.25克0.1克0.1克

转子角式和外摆式转子角式，外摆式转子等角式，外摆式，区带转子等

仪器结构、性能和特点速度控制不严格，

多数室温下操作

有致冷装置，有较准确速度

和温度控制系统

有真空和冷却系统，精确的温度

和速度控制、监测系统，保证转

子正常运转的传动和制动装置。

应用收集易沉降的大颗

粒(如RBC，酵母细

胞等)

收集微生物、细胞碎片、大

细胞、硫酸铵沉淀物和免疫

沉淀物等。但不能有效沉淀

病毒、小细胞器(如核糖体)、

蛋白质等大分子

主要分离细胞器，病毒，核酸蛋

白质，多糖等甚至能分开分子量

相近的同位素标记物15N—DNA

和未标记的DNA

二、离心分离的种类

根据离心原理，可设计出各种离心方法，归纳起来有二大类(表4–2)。分析型超速离心方法在这里我们不予讨论。

表4–2离心分离法的分类

离心方法差速离心

密度梯度区带离心

速度区带离心等密度离心

颗粒沉降系数相差大(1~n个数量

级)

相差较少(2％或更少)。或分

子量相差3倍的蛋白质

离心特点短时间、多次采用不

同速度和离心时间

进行分段离心

①沉降速度主要依赖于颗粒

的形状和大小 ②离心时间

较短，颗粒沉降速度不可能

为零，若时间过长，分离开

的区带有可能在管底重新靠

扰 ③颗粒密度不等于周围

介质密度

①沉降平衡主要依赖于颗

粒的密度 ②离心时间较

长，一般大于15h，平衡时

沉降速度为零，形成稳定的

区带 ③沉降平衡时，颗粒

密度一定等于周围介质的

密度

适用范围分子量(或大小)相差

大，不稳定，易变性、

易受梯度介质损伤

的颗粒。常用于从组

织匀浆中分离细胞

器及分离病毒

大小不同而密度相似，受差

速离心挤压变形，受低浓度

梯度介质损伤较少的颗粒。

一次分离量较少，宜作分析

分离。可分离核酸、蛋白质、

核糖体亚基及其它成份(如整

细胞、脂蛋白)

大小相同而密度不同，稳

定、不受高浓度介质损伤的

颗粒。一次分离样品量大，

用于制备及分析分离。可分

离核酸、亚细胞器、整细胞，

也可分离复合蛋白质，但简

单蛋白质不适用

1、差速离心法

差速离心法是指通过不断增加相对离心力，使沉降速度不同的颗粒，在不同离心速度及不同离心时间下分批离心方法。差速离心法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。

进行差速离心时，首先要选择好颗粒沉降所需要的离心力和离心时间。离心力过大或离心时间过长，容易导致大部分或全部颗粒沉降及颗粒被挤压损伤。当一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液进一步加大转速再次进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的―沉淀‖及含更小更轻颗粒的―上清液‖。如此多次离心处理，即能把流体中的不同颗粒较好地分离开，此法所得沉淀是不均一的，仍杂有其它成份，需经再悬浮和再离心(2~3次)，才能得到较纯的颗粒。

差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子；缺点是：(1)分离效果差，不能一次得到纯颗粒。

(2)管壁效应严重。特别当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀。(3)颗粒被挤压，离心力过大，离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种颗粒不容易分开，它常用于其他分离手段之前的粗制品提取。各种颗粒的沉降速度遵循式4—10。颗粒愈大，沉降速度也愈大，离心后沉淀到离心和底部所需的时间愈短。

1、密度梯度离心法

密度梯度离心法包括速度区带和等密度离心二种方法。后者又可分为预制梯度等密度及自形成梯度等密度两种方法，现分别叙述如下：

1）速度区带离心法

速度区带离心法是在离心前离心管内先装入密度梯度介质(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分离的样品铺在梯度液的顶部或梯度层中间，同梯度液一起离心。由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带。沉降系数越大，往下沉降越快，所呈的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上部分依次出现。在离心过程中，区带的位置和形状(或宽度)随时间而改变，因此区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。时间越长，区带越宽，适当增加离心力可缩短离心时间，并减少扩散所导致的区带加宽现象，增加区带面的稳定性。

归纳起来有两种密度梯度液，一种密度随管长或半径呈阶梯式增加，为不连续梯度。另一种是密度随管长或半径逐渐增加为连续梯度。

不连续密度梯度制备：通常先配好一系列不同密度的溶液，然后用移液管将梯度介质由浓到稀沿管壁小心加入，或用一加细管的注射器针头插到管底，从稀到浓一层层地铺到离心管中，即可产生一个不连续的密度梯度。

连续密度梯度制备：最简单的设备包括两个柱形的容器。中间装一连通管，连通管上安装有活塞开关，两边为储存室和混合室，后者内装有搅拌器，通过导液管使混合液流入离心管中。离心管顶部和底部所需要的两种不同密度溶液，分别装入储存室和混合室内。将较浓的溶液放在混合室中，较稀的溶液放在储存室中。开动搅拌器，打开接通管活塞，控制流速。导液管口必须紧贴离心管壁，(或导液管口插到管底部位并位于其中心)，因为这样从混合室中流出蔗糖溶液的浓度以线性速率减低，使溶液沿离心管壁流下，可以避免扰乱已形成的密度梯度。

2）等密度离心法

某些密度梯度介质经过离心后会自身形成梯度，如Percoll则可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘苯甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底部浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的颗粒也发生重新分布。当管底介质的密度大于颗粒的密度即ρm＞ρp时，颗粒上浮；当管顶介质的密度小于颗粒的密度即ρp＞ρm时，则颗粒沉降；最后颗粒进入到一个它本身的密度位置即ρp＝ρm，颗粒不再移动，形成稳定的区带。等密度离心法需时间较长，一般为十几小时至几十小时。

梯度材料的选择原则①对被分离的生物样品无作用，不会使生物样品失活；②在溶液中稳

定，在离心作用下不会解离或聚合；③在使用的密度范围中，粘度低，渗透压小，离子强度及pH值变化小；④易与被分离的颗粒分开；⑤不会对离心机设备发生腐蚀作用；⑥便于浓度测定等等。这些原则当然比较理想，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。下面介绍几种基本上符合上述原则的梯度材料：

(1)糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖(ficoll)、右旋糖酐、糖原等。

(2)无机盐类：CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、NaCl、KBr等。

(3)有机碘化物：三磺苯甲酰葡萄糖胺(martizamide)等。

(4)硅溶胶：Ludox的各种类型，如Percoll。

梯度液的收集离心后颗粒在梯度液中分层，小心取出离心管，防止振摇以避免分层的

颗粒混和。收集梯度液中颗粒的方法很多，有管底穿孔计滴法、插管虹吸计滴法，浓液顶替法和注射器穿孔抽取法等。

3、离心转头的种类

超速离心机主要由四个部分组成：(1)转子；(2)驱动和速度控制部分；(3)温度控制系统；(4)真空系统。其结构特点是有完善的冷却和真空系统，以消除摩擦热，保护转子和离心样品。高速离心机没有真空系统。

制备超速离心机常用的离心转子有三种：①固定角度转子(fixed-angle rotor)；②水平转子(swing-out rotor或swing-backet rotor)；③垂直转子(vertical rotor)。这三种转子的性能及用途有一定差异，正确选择转子有利于获得良好的实验结果。

固定角度转子：离心管放置的位置与旋转轴心形成固定角度。角度范围在14°~40°之间。

水平转子：开始处于垂直方向的离心管由于离心时转子高速旋转，受离心力作用，盛离心管的吊桶(backets)，使离心管甩成水平方向，颗粒的沉淀方向同旋转半径方向基本一致。

垂直转子：离心管与旋转轴心成0角度。

转子都有一定的使用速度和使用限度，任何转子都不允许在满额或超额转速下运转，有人建议使用转速为最大额定速的75％，以保证安全，延长使用寿命。随着使用时间和次数的增加，转子长期疲劳必然引起运转额定速度下降。所以使用转子时，必须设立档案，记录每次的使用时间，一定时间或次数后，应重新估算其最大允许速度，以保障使用安全。各制造厂和生产的转子均已标明其保证在最大转速下使用1,000次或2,500小时或5年，此后转速降低10％后又能再用1,000次或2,500小时。

转子通常用(铝)合金、铝(镍)合金或塑料制成。塑料转子(如聚氯苯，聚四氟乙烯)的固有弱点是强度低，使用速度仅限于6,000rpm以下；铝合金具有轻便、价廉、易加工、有一定强度和抗暴性能等优点。但不能加热消毒，易氧化，抗化学腐蚀性差，此外，抗金属疲劳损伤的性能也差。钛合金转子虽然价格昂贵，加工困难，内含的铜可能抑制一些酶的活性，也比较笨重，但它强度大，耐用，能经受冷冻及高温消毒处理，抗化学腐蚀和应变侵蚀的性能强，是当前最理想的转子。

实验十一血浆HDL-Ch含量的测定(肝素-Mn法) 目的

1、掌握测定血浆HDL—胆固醇的原理及方法

2、了解血浆HDL—胆固醇临床意义，进一步加深对脂蛋白结构与代谢有关内容的理解

原理

高密度脂蛋白是血浆脂蛋白的一种，起初由肝脏和小肠合成，分泌至血液循环时呈圆盘状称为新生HDL。在循环中或组织细胞中LCAT(磷脂酰胆碱—胆固醇脂酰基转移酶)的催化下，新生的HDL与其它脂蛋白相互作用，使颗粒表面的胆固醇接受磷脂转移酶转移来的脂酸转变为胆固醇酯，此非极性的胆固醇酯进入疏水核心，使盘状的HDL逐渐转变成球形的成熟的HDL。HDL 不仅能与其它脂蛋白互相作用转移其组成成分，而且能将组织细胞的胆固醇运输到肝脏而排泄(或变成胆酸而排泄)。HDL是由蛋白质、磷酯、胆固醇、甘油三酯按一定比例组成的。大量流行

病学研究表明，血浆HDL水平与冠心病的发病率呈负相关，高水平HDL有利于预防冠心病的发生。

一定浓度的肝素—Mn混合液在一定条件下可选择性地使血浆中VLDL及LDL沉淀起来，而HDL仍留在上清液中，从而使HDL与LDL及VLDL分开。HDL中含有一定的胆固醇。利用胆固醇的类脂性质，可用有机溶剂进行抽提，然后取一定量抽提液蒸干，加入冰醋酸，利用Zak 氏三氯化铁显色法，使溶解于冰醋酸中的胆固醇在硫酸存在的条件下与高铁离子作用，产生稳定的红色物质。此物质在560nm波长有最大吸收，可作定量分析。

试剂

1、标准胆固醇液：

a. 贮存液(1000μg/ml)：准确称取胆固醇标准100mg溶于100ml三氯化铁冰醋酸溶液中。

b. 应用液：(80μg/ml)：取贮存液4ml加三氯化铁冰醋酸至50ml。

2、三氯化铁冰醋溶液：

a. 贮存液(125mg/ml)：取1.25克三氯化铁溶于100ml冰醋酸中

b. 应用液(1mg/ml)：取贮存液2ml加冰醋酸至250ml

3、浓H2SO4(要求AR)

4、丙酮—乙醇混合液(按1：1比例配制V/V)

5、肝素—Mn混合液

a. 1.06mol/L氯化锰液(MnCl2·4H2O，MW198)：取209.9克MnCl2·4H2O溶于1000mlH2O中

b. 肝素液(280mg/ml)：取肝素280mg溶于1.0ml水溶液中。

c. 肝素—Mn混合液：取a液10ml＋b液0.6ml混匀即成。

临用前配制，放冰箱保存，至多用一个月。

操作

1、HDL的分离

取干燥离心管一支，取0.5ml血浆加肝素—Mn混合液0.05ml，混匀后室温静置10min。3000转/分离心10min。沉淀部分为VLDL和LDL，而HDL存在于上清液中。

2、HDL—胆固醇的提取(有机溶剂抽提法)

取肝素—Mn沉淀后的上清液0.1ml，加酮醇混合液2.5ml(快速加入，使沉淀均匀)，3000 转/分离心5~6min。取上清液2 ml于沸水中蒸干，此为样品管(沉淀部分为蛋白质)。

3、胆固醇测定取短试管三支，按下表操作，注意加H2SO4时需将试管斜置，沿管壁加入

试剂(ml)管号空白样品标准(80μg/ml)三氯化铁冰醋酸溶液 1.5 1.5 0.5 标准胆固醇(ml) —— 1.0

浓硫酸(ml) 1.0 1.0 1.0

摇匀，60℃水浴10分钟，560nm比色。记录吸光度。

计算公式：

血清HDL—胆固醇(mg％)＝A样/A标×C标×K(mg/dl)

K＝(0.5＋0.05)/0.5×(0.1＋2.5)/2×1/0.1×100/1000＝1.1×1.3＝1.43 临床意义及正常值：

正常人血浆总胆固醇为125~200mg％，HDL中所含的胆固醇占总胆固醇的1/3~1/4，人们常用HDL中胆固醇的含量表示HDL的量。

HDL—胆固醇水平愈高，愈有利于将组织中的胆固醇运输出来，对人们健康长寿十分有益，长期坚持体育锻炼者，其血浆HDL胆固醇较一般人为高，冠心病者比一般正常人低，临床在测定血脂时也测定HDL—胆固醇的含量，对于诊断冠心病以及观察治疗效果有一定意义。

实验十二 细胞器的分离和鉴定

许多具有生物活性的生物大分子和亚细胞器很不稳定，在分离过程中要求温度低，操作温和，不能应用一般的化学分离方法，因此需用低温高速离心法。如常用差速离心法分离亚细胞器、线粒体、微粒体和细胞核等，在分离亚细胞的过程中要注意尽可能地保存其原来活性和结构形态。

试剂：

1、0.25mol/L 蔗糖液100ml ，pH7.5

称取蔗糖8.6g 溶于少量重蒸馏水，用1mol/LNaOH 调整pH7.5，1mol/LNaOH 的用量约0.75ml ，再加蒸馏水至100ml 即可。4℃可保存一周。

2、MA 液：4℃保存1~2周。

0.25mol/L 蔗糖液8.6g/100ml

10mmol/L Tris-HCL 液0.12g Tris/100ml 用HCL 调pH8.0(约1mol/L HCL0.215ml)

3mMMgCl 20.061g/100ml

先配制Tris-HCL 液，用该溶液溶解蔗糖和MgCl 2至100ml

3、MB 液：4℃保存1~2周

配制同MA 液，在MA 溶液中加0.1ml Triton X-100/100ml

4、MC 液：4℃保存1~2周

2.2mol/L 蔗糖75.3g/100ml

5、0.4mol/L KCl 溶液：2.98g/100ml

6、10％过氯酸(PCA)：取99.8％过氯酸100ml 加水至100ml

7、二苯胺—冰乙酸溶液：(新鲜配制)

称二苯胺1.5g 溶于100ml 冰乙酸中，再加浓硫酸1.5ml

8、1mol/L NaOH

9、0.01％甲烯兰溶液

操作

(一)细胞器的分离过程

1、肝匀浆制备：将大鼠断头放血处死，迅速取出肝脏，用生理盐水冲净肝脏表面的血液，剔去结缔组织，称取1.0克肝组织，剪碎放入盛有0.25mol/L 蔗糖液3ml 的Tefion-glass 匀浆器内，上清液（弃去） 沉淀（含线粒体） 沉淀 上清液（弃去）

上清液（弃去）

50

10000rpm,30min 上清液（含线粒体）

2500rpm,10min+2ml pH7.

加0.25mol 蔗糖3ml

甲烯兰液于对照

37℃静置15－MA 液5ml,摇匀,15000rpm,1h

沉淀 加10％过氯酸上清液（含DNA ） 沉淀（

接上电动马达匀浆，直至无肉眼可见的组织残块，再把匀浆倒入离心管，用0.25mol/l 蔗糖液2ml 冲洗匀浆管，一并放入离心管。

2、线粒体和细胞核的分离，按表操作。

(二)细胞器的鉴定：

1、线粒体的鉴定：在线粒体内有由氧化还原酶类组成的呼吸链，包括NADH 氧化呼吸链和琥珀酸氧化呼吸链。在生理条件下，底物脱下的氢可经呼吸链彻底氧化生成H 2O ，并释放出能量。

但在体外可用甲烯兰(MB)作为受氢体。MB 按受H 2则变成甲烯白(MBH 2)，颜色由兰色变白色。

2、细胞核的鉴定：

(1)显微镜观察：用HE 染色法，在镜下观察核的形态。

(2)用Burten's 法测定DNA 浓度：DNA 是细胞核内的特征性物质。各种动物的细胞核所含的DNA 量是十分恒定的，不受生理条件、环境因素等的影响。因此可用测定DNA 含量来鉴定细胞核。

取水解上清液1ml 放入T 管，取10％过氯酸1ml 放入B 管，分别加二苯胺液4ml 于T 、B 管中摇匀后，置80℃水浴10min ，取出冷却后，在分光光度计上(600nm)测吸光度，查标准曲线或用标准管直接计算。

磷酸

含氮碱

脱氧核糖 H +

△ ω－羟－γ－酮戊糖 二苯胺 兰色化合物