间接elisa实验流程

间接ELISA实验流程

ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测抗体或抗原的存在。其中，间接ELISA是一种常用的抗体检测方法，其流程如下：

1.涂层：将待检测的抗原溶液加入96孔板中，使其在孔底形成一层涂层。通常使用1%的牛血清白蛋白（BSA）或羊血清白蛋白（GSA）作为涂层缓冲液，以防止非特异性结合。

2.阻断：将孔中的涂层缓冲液倒掉，加入5%的牛血清或羊血清，使其在孔底形成一层阻断液。阻断液可以防止非特异性结合，提高检测的灵敏度。

3.加入一抗：将待检测的样品加入孔中，与涂层中的抗原结合。一般情况下，使用稀释后的血清或纯化的抗体作为一抗。孵育时间一般为1-2小时。

4.加入二抗：加入与一抗特异性结合的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，孵育时间一般为1小时。二抗可以与一抗结合形成复合物，

从而增强信号。

5.加入底物：加入HRP底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺），孵育时间一般为10-30分钟。HRP底物在酶的作用下会发生颜色变化，从而形成信号。

6.停止反应：加入停止液，如2M的硫酸，停止底物的反应。停止液可以防止底物的继续反应，从而保证结果的准确性。

7.测量：使用酶标仪测量吸光度值，计算样品中抗体或抗原的浓度。

总结：间接ELISA是一种常用的抗体检测方法，其流程包括涂层、阻断、加入一抗、加入二抗、加入底物、停止反应和测量。通过这种方法可以检测样品中抗体或抗原的存在，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

ELISA实验步骤

血清中食物过敏原IgG的测定方法：ELISA间接法试剂：八种食物抗原、血清样品、Goat anti-human IgG-HRP（santa cruz biotechnology/ Thermo Fisher Scientific）、包被液(碳酸盐缓冲液/CBS)、封闭液（5%BSA+PBST）、洗涤液（PBST），稀释液（1%BSA+PBST），底物（TMB），中止液（2M H2SO4）。实验步骤： 1.血清收集保存：收集不抗凝血液3-5ml，保存4℃冰箱中，在恒温离心机中以4℃，3500r离心10min，收集上层血清，以200ul/管分管编号冻存-80℃冰箱中。 2.包被：用包被液（CBS）稀释八种抗原至5ug/ml，以100ul/孔加入酶标板中，空白孔加100ul/孔3%BSA+PBS.,4℃放置过夜12h上。 4.封闭：弃上清液，加封闭液（5%BSA+PBST）200ul/孔，37℃放置2h。 5.洗涤：以洗涤液洗涤5次，5min/次。 6.加血清样品：将冻存血清逐级解冻至室温，将待测血清（1:30稀释于 1%BSA+PBST）中，以100ul/孔加入酶标本中，37℃放置2h，阴性对照孔加100ul/孔稀释液（1%BSA+PBST）. 6. 洗涤：用洗涤液洗涤5次，5min/次。 7. 加酶标二抗：人抗IgG抗体-HRP,用1%BSA+PBST 液1：10000稀释，100ul/孔，37℃恒温箱温育2h。 8. 洗涤：洗涤液洗涤5次，5min/次。 9. 显色：加新鲜配制的底物（TMB：A液和B液等体积混合）100ul/孔。 10. 中止反应、比色：加50ul/孔中止液（2M H2SO4），用酶标仪测定吸收值（450nm），根据P/N确定阳性值。 1 血清特异性IgE检测小鼠检测完AHR后24h内处死动物，摘眼球取血，室温下静置30min，4℃4000rmp/min离心10min，小心吸取上层血清，分装-80℃保存备用。采用间

间接法Elisa汇总

间接法ELISA SOP 一、包被板。20μg/1．抗原包被量为。．例如：抗原浓度为0.8mg/ml2 l/孔。100μl抗原与20mlCBS（抗原包被液）混匀，3．取25μ4℃过夜。4．包被完毕后，二、封闭4℃冰箱中取出酶标板，甩干包被液，拍板。1．从l/孔。2．加封闭液，200μ 2h。3．37℃孵育次）。4．甩干，洗板（34℃保存。5．用干燥的自封袋，甩出，将板拍在洗板液，静置2min200μl -300μl【注】：洗板，将孔内液体甩出，每孔加干的纱布上，将孔内液体拍干为佳。三、一抗1．可洗板一次。。：1000稀释（第一孔）1．阳性对照：1μl阳性血清加入1ml抗原稀释液中，做2 万稀释。1：23．阴性对照：做稀释。再从此液：100ll阴性血清加入100μ抗原稀释液中，先做1 用1μ 万。：2995μl的抗原稀释液中，最终稀释为1 取出5μl加入 4．空白对照：只加抗原稀释液。l抗原稀释液。5．除第一孔和阴性对照孔外，每孔加100μ1000）的阳性对照。l（1：6．第一孔加100μ号加到3）的阳性对照，吹打混匀，再从二号孔中吸取100μl．第二孔加100μl（1：10007 孔中，做倍比稀释，最后两孔为阴性对照或空白对照。1000 ：1 2000 ： 1 4000 ：1 8000 ：1 16000 1： 32000 1：万）1：2 阴性对照（空白对照 3次。37．将酶标板℃孵育1h，洗板8从中选择最佳的稀释倍数应该做阴性对照的梯度稀释，①通常在第一次做Elisa时，：【注】)。0.1(一般认为吸光值小于的阴性稀释倍数为易②更为严格的操作是，阳性，阴性，空白的对照空均为双复孔或三复孔。 ③在稀释一抗，或者二抗的时候，要算好每次的用量。四、二抗本次检测采用二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 1．用0.01MPBS做1：5000稀释（现用现配）。 2．100μl/孔。 3．酶标板37℃孵育30min, 洗板3次。【注】：采用的二抗的所抗的物种应当与一抗的来源相一致，例如一抗是兔多抗，那么二抗就应该选择羊抗兔或者是其他种属抗兔的酶标二抗。五、显色

酶联免疫吸附试验检间接法测igg抗体步骤

酶联免疫吸附试验检间接法测igg抗体步骤酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IgG抗体的间接法步骤如下： 1. 预处理样本：样本可以是血清、血浆或其他生物体液。需要将其离心或过滤去除杂质，并稀释至适当的浓度。 2. 涂覆板子：将抗原（通常是蛋白质）溶解在缓冲盐溶液中，涂覆在96孔板的孔中。将板子放置在4℃冰箱或室温下，有时还需要在孔中加入牛血清白蛋白（BSA）来防止非特异性吸附。 3. 封孔：将板子放在37℃恒温箱中进行2小时封孔，封孔溶液就是用BSA等蛋白质密度较大的液体形成的层，防止样本的IgG抗体直接贴附到孔壁上造成假阳性结果。 4. 添加稀释的样本：加入稀释后的样本到96孔板的各个孔中，并在恒温箱中孵育1小时，让IgG抗体与涂有抗原的板子结合。 5. 洗涤：去除非特异性吸附，将96孔板上多余的物质洗掉。有时需要经过多次洗涤来确保洗涤干净。 6. 加入检测抗体：向96孔板的各孔中加入识别IgG抗体的酶标记二抗，如兔抗人IgG-HRP。这种二抗分子完全地结合到原先样本中的IgG抗体上，好比一

个钩子勾着另一个东西。 7. 再次洗涤：洗掉任何没有连接到IgG抗体的酶标记二抗。 8. 加入底物：加入足够的酶标记底物，恒温孵育一定时间，观测形成的颜色变化。酶标记的酶分子会氧化底物，生成显色的产物，如TMB HRP底物。 9. 终止反应：过多地加酶底物会引起酶反应过程的不可逆转，产生饱和效应，不能单纯地用眼看颜色深浅。所以，加入适当类型的液体停止反应，最常用的停止剂是盐酸。 10. 测定光密度：用ELISA分析仪读取各表格的光密度。 11. 分析数据：将各样本的光密度计算出来并比较参比标准，根据公式计算IgG 抗体的相对含量。需要注意的是，ELISA检测IgG抗体的间接法可以很好地确定是否发生了特定病原体的感染，但不能确定感染的病程时间或某个时刻的IgG抗体水平。此外，某些药物、疫苗等因素可能对结果造成干扰。

(完整版)间接ELISA法检测抗体

间接ELISA法检测血清抗体 1. 仪器耗材（1）仪器：洗板机，酶标仪，恒温箱（2）耗材：96孔酶标板（NUNC或海门），加样槽 2. 试剂及配制（1）包被缓冲液： A. PBS (500ml，pH=7.2±0.1)：NaCl 4.25g， NaH2PO4·2H2O 0.178g，Na2HPO4·12H2O 1.386g，溶解定容至500ml，测量pH在7.1-7.3（若超出此范围则不能使用）。常温可保存一周。 B. 1×碳酸盐缓冲液（100ml，pH=9.6）：Na2CO3 0.2756g，NaHCO3 0.6216g，溶解定容至100ml水，测量pH在9.5-9.7之间（若超出此范围则不能使用）。4℃可保存一个月。（2）洗液：0.5%PBS’T（1L）：每1L PBS（pH=7.2±0.1）加入Tween-20 5ml，充分混匀。（3）封闭液： A. 2.5%drymilk/PBS’T（100ml）：将2.5g drymilk 溶解于100ml PBS’T中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃。 B. 10%FBS/PBS’T（100ml）：10ml FBS于90ml PBS’T混合，短期保存与4℃。（4）稀释缓冲液： A. 2.5%drymilk/PBS’T：配方同上。 B. 10%FBS/PBS’T：配方同上。 C. 2.5% dry milk EDTA/EGTA PBS’T： C-1：EDTA/EGTA PBS’T：1.117g EDTA加入至100ml PBS’T中，搅拌至溶解（大约15min）；1.141g EGTA加入至100ml PBS’T中，搅拌（大约15min），待部分溶解后，用10N 的NaOH调节pH至7.0；上述两种溶液以1：1的比例混合，测量其pH值在6.3±0.5

elisa原理和步骤

elisa原理和步骤 ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）是一种检测生物分子的方法，主要用于检测抗原或抗体的存在。它是一种非常灵敏、快速、可靠的检测方法，广泛应用于医学、生命科学、生物工程、环境监测等领域中。下面就为大家详细地介绍一下ELISA的原理和步骤。 1. 原理 ELISA的原理是利用酶作用产生的光信号来检测目标分子。一般来说，ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和夹心ELISA 等几种类型。其中最常使用的就是间接ELISA。间接ELISA主要是利用抗体的特异性识别目标抗原，然后用另一种抗体与其结合，标记上酶来检测。当样品中含有目标抗原时，它将特异性地结合到ELISA板上的抗体上，随后加入酶标记的第二抗体，在洗涤后酶标记的抗体得以固定。最后，加入底物后，酶作用会产生光信号，信号的强度与目标抗原的浓度成正比。 2. 步骤（1）涂覆ELISA板将检测抗体溶液加入到微孔板中，一般是96孔板，放置过夜。它的作用是将检测抗体吸附到微孔板上，形成成分固定的ELISA板。（2）阻断加入一定浓度的蛋白质或其他酶抑制剂，以防止非特异性的蛋白质与孔的表面互相结合，从而阻止抗体结合并引起假阳性的结果。（3）加入样品加入待测试的样品，通常需要稀释样品以得到正确的浓度范围。ELISA可以检测抗原或抗体，或者两者之间的竞争。如果检测的是抗原，则加入样品和待测物，如果检测的是抗体，则加入包含特异抗原的样品。（4）加入检测抗体加入与检测抗原特异性结合的检测抗体，也称为探针抗体。这个

抗体标记了酶，通常是使用HRP（辣根过氧化物酶）。（5）加入底物加入底物，就是加入一种可以被该特定酶催化分解的化合物，以产生一个可检测的信号，通常是这种底物是TMB（3,3′,5,5′-四甲基联苯二胺）。（6）读取结果使用酶标仪读取微孔板的吸收值，可以算出待测样品中目标分子的含量。通常会测量每个孔的吸光度，并使用标准曲线来计算样品中目标分子的浓度。总之，ELISA是一种快速、简单的检测方法，可以用于检测抗原或抗体的存在。随着生物技术的发展，ELISA也被应用于越来越多的领域，如疾病诊断、药物筛选、潜在生物危害物质的检测等。

ELISA实验步骤

操作步骤 1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。 2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。 4. 洗涤同2。 5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。 6. 洗涤同2。 7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃1小时。 8. 洗涤同2。 9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。 10. 加终止液：每孔50微升。 11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。操作步骤：包被原用包被缓冲液稀释至1μg／mL，酶标板每孔加100μL，37℃孵育2h进行包被，用洗涤液洗涤4次，拍干。每孔加入3 %BS A2 0 0 μL，37 ℃封闭2h ，用洗涤液洗涤4次，拍干。将庆大霉素标准品用样品稀释液依次稀释成5、2、1、0.5、0.1、0n g/mL 共6个稀释度，将系列标准液加入酶标板中，每孔50μL，再加入用PBS稀释的庆大霉素单克隆抗体50μL ，37℃孵育1h ，用洗涤液洗涤4次，拍干。加入稀释度为1：5000的羊抗鼠IgG—HRP，每孔100μL，37 ℃反应1h ，用洗涤液洗涤4次，拍干。每孔加TMB

间接法ELISA的原理和应用

间接法ELISA的原理和应用 1. 原理间接酶联免疫吸附测定（Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的免疫测定方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。其原理基于抗原与特异性抗体结合的免疫反应，借助酶的特殊性质实现信号放大。下面是间接法ELISA的主要步骤： 1.涂布：将待测抗原溶液均匀地涂布在固相载体（如微孔板）上。 2.孵育：孵育载有抗原的固相载体，使抗原与载体之间发生亲和反应，将其固定在载体上。 3.阻断：用非特异性蛋白质（如牛血清蛋白）封闭非特异位点，防止后续步骤中的假阳性反应。 4.洗涤：用缓冲液洗涤载体，去除未结合的抗原。 5.包被：加入经过稀释的特异性抗体溶液，使其与载体上的抗原结合。 6.洗涤：用缓冲液洗涤载体，去除未结合的抗体。 7.标记：加入与特异性抗体具有亲和性的标记物，如酶素（如辣根过氧化物酶HRP）。 8.洗涤：用缓冲液洗涤载体，去除未结合的标记物。 9.检测：加入与标记物的底物发生化学反应的底物溶液。 10.停止反应：添加终止剂，终止底物的继续反应。 11.测定：用分光光度计或荧光分析仪测定产生的光信号的强度，即抗原的定量。 2. 应用间接法ELISA在医学、农业和环境监测等领域具有广泛的应用。以下是一些常见的应用： 2.1 检测疾病标志物间接法ELISA可以用于检测血清、尿液、唾液等体液中的疾病标志物。例如，乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的检测、人类免疫缺陷病毒（HIV）的抗体检测等。 2.2 药物检测间接法ELISA还可以用于检测药物在体内的浓度，以评估药物吸收、分布和代谢情况。该方法可以用于药物疗效的监测和药物动力学研究。

间接酶联免疫吸附试验(间接elisa)

附件2：间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA） 1．操作步骤： 1.1 血清用PBS 稀释液按1:400、1:800、1:1600、1:3200 稀释。 1.2 取包被钩体抗原的酶标板，将稀释好的阳性血清、阴性血清及样本血清分别加入酶标板孔中，每孔100^1同时加入2孔空白对照（PBS）。 37C 60分钟，弃去孔中液体。矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖賃軔。 1.3洗板，于酶标板每孔加入洗涤液250卩,1洗板3次。 1.4每支酶标羊抗人IgG用0.5ml三蒸水充分溶解均匀后，再用PBS按1:50 稀释，每孔加稀释好的酶结合物100卩。放置37C 40分钟。聞創沟燴鐺險爱氇谴净祸測。 1.5 洗板：洗板4 次（方法同1.3）。 1.6显色与终止：加底物液A、底物液B各1滴。室温避光显色，10分钟后，每孔加终止液 1 滴，终止反应。残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟婭骒。 1.7采用波长405nm的酶标仪测定OD值，阴性OD值X 2.1作为判定界值。检测样本的OD 值昂比判定界值则为阳性。酽锕极額閉镇桧猪訣锥顧荭。 2．试剂配制： 2. 1 洗涤液（PBST，pH7.4）： NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g Tween 20 0.5ml 硫柳汞0.1g D2H2O 至1000ml 2. 2 稀释液(PBS，pH7.4): NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g 硫柳汞0.1g D2H2O 至1000ml 2. 3 底物液A（0.1M 柠檬酸-0.2M 磷酸氢二钠缓冲液，0.06%过氧化氢脲，pH 5.0-5.4）彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑诒尔。 Na2HPO4.12H2O 36.82g 9.2g 柠檬酸.H2O 10.21g 2.55g 过氧化氢脲0.6g 0.15g D2H2O 至1000ml 250ml 2. 4底物液B（3、3'、5、5' T甲基联苯胺，TMB，作用时终浓度0.1mg/ml） 2．4．1 TMB 贮存液 TMB 贮存液（50mg/ml） TMB 150mg 二甲基亚砜3ml 注意事项：TMB 不易溶解，缓慢加入二甲基亚砜中并不断摇晃或搅拌，水浴适当加热可加速溶解。 2. 4. 2 底物液B 柠檬酸.H2O 1.05g 0.263 EDTA-Na2 (EDTA) 0.146g 0.0365 g D2H2O 至1000ml 250ml TMB 贮存液(50mg/ml) 4ml 1ml 2. 5 终止液：2M H2SO4

elisa间接法测定指标

elisa间接法测定指标 Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的间接法测定指标的方法。它通过将待测物与特异性抗体结合，再与标记有酶的二抗结合，通过酶的催化作用产生显色反应来检测目标物质的存在和浓度。下面将详细介绍Elisa间接法测定指标的原理、步骤和应用。一、原理 Elisa间接法是利用特异性抗体与待测物结合来检测目标物质的方法。首先，待测物与包被在微孔板上的特异性抗体结合，形成固相抗原。然后，加入待测物样品，待测物与固相抗原结合。接着，加入与待测物不同表位的酶标记抗体，酶标记抗体与待测物结合。最后，通过添加显色底物，测定酶催化反应产生的颜色变化，从而间接测定待测物的浓度。二、步骤 Elisa间接法的步骤主要包括：涂布、阻断、孵育、洗涤、添加酶标记抗体、孵育、洗涤、添加底物、反应终止和测定。首先，在微孔板上涂布特异性抗体，形成固相抗原。然后，阻断未被特异性抗体结合的孔位，以避免非特异性结合。接着，加入待测物样品，待测物与固相抗原结合。随后，洗涤孔位，以去除未结合的物质。然后，加入酶标记抗体，酶标记抗体与待测物结合。再次孵育和洗涤，以去除未结合的酶标记抗体。接下来，添加显色底物，观察颜色的变化。最后，通过添加反应终止剂停止酶催化反应，并使用酶标仪测

定吸光度。三、应用 Elisa间接法广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。在生物医学研究中，Elisa间接法常用于检测特定抗原、抗体或药物的浓度，用于疾病的早期诊断、预后判断和疗效监测。例如，在肿瘤标志物的检测中，Elisa间接法可以检测血液中的肿瘤特异性抗原，帮助医生评估肿瘤的发展和治疗效果。此外，Elisa间接法还可以用于检测感染性疾病，如乙肝、艾滋病等。通过检测血液中的病原体抗体或抗原，可以快速、准确地判断患者是否感染。总结： Elisa间接法是一种常用的测定指标的方法，它通过特异性抗体与待测物结合，再与酶标记抗体结合，通过酶的催化作用产生显色反应来间接测定目标物质的存在和浓度。Elisa间接法的步骤包括涂布、阻断、孵育、洗涤、添加酶标记抗体、孵育、洗涤、添加底物、反应终止和测定。Elisa间接法在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用，可以用于早期诊断、预后判断和疗效监测。通过Elisa间接法，我们可以快速、准确地检测各种疾病的指标，为疾病的治疗和管理提供重要的依据。

酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序

酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序第一节间接ELISA试验一用可溶性抗原的ELISA： 1、纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml； 2、以50—100ul/孔量加入酶标板孔中； 3、置4（度）过夜或37（度）吸附3h； 4、PBST洗三次； 5、每孔200ulPBS/NCS 4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h； 6、PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保存备用） 7、每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。若杂交瘤筛选，每孔加杂交瘤培养上清； 8、37（度）孵育2h 9、PBST洗5次，每次5min 10、每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP 标记的抗小鼠（IgG+IgM）抗体； 11、37（度）孵育2h 12、PBST洗5次，每次数5分钟； 13、每孔加OPD 或TMBS底物100ul 14、37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD 底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤:光片）；

16结果判定：（1）P/N≥2.1 为阳性 (2) P≥N+3SD 为阳性成功范例:NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测亚类鉴定和鸡白痢检疫等。二、用全菌抗原的ELISA法（一）GA法 1、新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌浓度至1X10（6）个/ml。注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液； 2、酶标板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1M NaHCO4 95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小时 3、蒸馏水洗5次; 4、加细菌悬浮液,50ul/孔; 5、37(度)温箱内过液,干燥吸附(20—24h) 6、加PBS/NCS 220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭； 7、PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用； 8、以下步骤同一。（二）MA法 1、细菌悬液（1X10（6））50ul/孔；

间接elisa实验报告

间接elisa实验报告间接ELISA实验报告引言： ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于生物医学研究、药物开发等领域。本实验旨在通过间接ELISA方法检测目标蛋白的存在和浓度。材料与方法： 1. 实验材料： - 目标蛋白样品 - 目标蛋白的特异性抗体 - 辅助抗体（如兔抗小鼠IgG抗体） - 酶标记的二抗（如HRP标记的抗兔IgG抗体） - TMB底物 - 停止液（如2M H2SO4） - 洗涤缓冲液（如PBS-Tween 20） - 溶解缓冲液（如PBS） 2. 实验步骤： 1) 酶标板涂布：将目标蛋白样品稀释至适当浓度，用该浓度的目标蛋白溶液在酶标板孔中涂布，然后在4℃下孵育过夜。 2) 阻断：将酶标板孔中的目标蛋白洗涤掉，加入阻断缓冲液（如5%脱脂奶粉溶液），在37℃下孵育1小时，以防止非特异性结合。 3) 抗体结合：将特异性抗体稀释至适当浓度，加入到酶标板孔中，与目标蛋

白发生特异性结合，孵育1小时。 4) 洗涤：将酶标板孔中的非特异性结合物洗涤掉，重复3次，每次使用洗涤缓冲液，以确保洗涤干净。 5) 酶标记的二抗结合：将酶标记的二抗稀释至适当浓度，加入到酶标板孔中，与特异性抗体结合，孵育1小时。 6) 再次洗涤：将酶标板孔中的非特异性结合物洗涤掉，重复3次，每次使用洗涤缓冲液。 7) 底物反应：加入TMB底物，孵育适当时间，使底物与酶发生反应，产生可测定的颜色。 8) 反应停止：加入停止液，停止底物反应。 9) 测定：使用酶标仪测定酶标板孔中的吸光度值，计算目标蛋白的浓度。结果与讨论：通过上述实验步骤，我们成功地进行了间接ELISA实验，并得到了目标蛋白的浓度。实验结果显示，目标蛋白的浓度为X ng/mL。这表明我们的实验方法是可行的，并且可以准确地检测目标蛋白的存在和浓度。在实验过程中，我们采用了间接ELISA方法，该方法的优点是灵敏度高、特异性好。通过将特异性抗体与目标蛋白结合，然后再加入酶标记的二抗，可以增强检测的灵敏度，同时保持特异性。此外，我们还进行了阻断步骤，以防止非特异性结合，提高实验结果的准确性。然而，间接ELISA方法也存在一些局限性。首先，该方法需要较长的实验时间，因为需要多个步骤的孵育和洗涤。其次，对于复杂的样品，可能会出现交叉反应或干扰物的问题，影响结果的准确性。因此，在实际应用中，我们需要根据

ELISA操作步骤

ELISA操作步骤酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。双抗体夹心法是ELISA的一种常见方法，也被称为间接ELISA。该方法通过将待测抗原与特异性抗体结合，然后将该复合物夹在两种抗体之间，从而实现检测目标物的定量。以下是ELISA操作步骤（双抗体夹心法）： 1.准备所需试剂和设备，包括等量酶联免疫吸附试剂，洗涤缓冲液，检测抗体，底物液和浓缩液。 2.预先涂上酶标板：用特异性抗体溶液将酶标板的孔涂覆。将抗体溶液加入每个孔中，然后在常温下孵育2小时或过夜在4°C下孵育。孵育结束后，将溶液倒掉，然后用洗涤缓冲液洗涤掉未结合的抗体。 3.加入待测样品：将待测样品加入酶标板中，然后在常温下孵育1小时。孵育结束后，倒掉孵育液，并用洗涤缓冲液洗涤掉未结合的样品。 4.加入检测抗体：将检测抗体加入酶标板孔中，然后在常温下孵育1 小时。检测抗体可以与目标物中的特异性抗体结合，并形成夹心复合物。 5.加入底物液：将底物液加入每个孔中，然后在室温下孵育20-30分钟。底物液通常含有染色剂，当底物液与酶产生反应时，颜色会发生变化。 6.停止反应：在孵育结束后，加入停止液停止反应。停止液会改变底物液的pH值，从而停止酶的反应。这将保持颜色稳定，并允许结果的定量测量。

7.结果分析：使用酶标仪读取每个孔的吸光值。这些吸光值可以用于计算样品中目标物的浓度。通常，在酶标板上设置标准曲线，用于根据吸光值确定目标物的浓度。 8.清洗：在每个步骤之后，用洗涤缓冲液充分清洗酶标板。洗涤的目的是去除未结合的试剂和非特异性物质，以确保结果的准确性。 9.数据处理和统计分析：根据读数结果计算样品中目标物的浓度，并进行统计分析。常见的统计方法包括均值、标准差和方差。以上是双抗体夹心法ELISA的一般操作步骤。在实际操作中，可能会根据具体要求进行一些调整和优化。同时，实验室安全操作规范和个性化要求也需要被遵循和注意。

ELISA试剂及溶液配制及实验步骤

ELISA试剂及溶液配制 ①包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6) 0.75g碳酸钠,1.46g碳酸氢钠,加去离子水定容至500ml。 ②0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml。 ③抗体稀释液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2%BSA 0.2gBSA加配好的0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至100g。 ④封闭液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)+2.0%BSA 2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100g。 ⑤洗涤液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05%Tween-20 将50ulTween-20溶入100ml0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，震荡混匀。 ⑥显色液：TMB-过氧化氢尿素溶液 A液(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，TMB):称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至100ml。 B液(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4):称取 Na 2HPO 4 ·12H 2 O14.34g，柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，加0.75%过氧化氢尿素 1.28ml，定容至200ml，调pH至5.0-5.4。将A液和B液按1：l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液。 ⑦终止液：2mol/L H 2SO 4 溶液 10ml98%浓硫酸加入60ml双蒸水中，定容至100ml，室温保存。 ⑧酶标二抗：HRP标记的羊抗兔 IgG，应用时用抗体稀释液稀释3000倍。 2.2.6 抗血清的分离采集血液后，去掉针头，缓慢注入已经灭菌的三角烧瓶中，待凝固后用灭菌滴管将血液沿边缘剥离，室温放置1小时，再放入4℃冰箱过夜(不能冰冻，否则产生溶血)，使血清充分析出。第二天取出后以4℃3000r/min离心30min，取上清，分装后-20℃保存备用。 2.2.7 间接ELISA法检测家兔抗血清效价

间接elisa原理

间接elisa原理一、引言酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种广泛应用于生物学、医学等领域的分析方法。其中，间接ELISA是其中一种常用的方法。它通过特定的抗体与抗原相互作用，利用酶做标记来检测样品中是否存在目标物质。本文将详细介绍间接ELISA的原理。二、实验步骤 1.涂布：将待测物质（如蛋白质）溶液加入到微孔板中，使其在孔壁上均匀地吸附。 2.阻断：在孔壁上添加非特异性蛋白（如牛血清白蛋白），以避免后续步骤中非特异性结合。 3.加入第一层抗体：加入与待测物质相对应的第一层抗体，并与待测物质结合形成复合物。 4.加入第二层抗体：加入与第一层抗体相对应的酶标记二抗，并与第一

层抗体结合形成复合物。 5.加入底物：加入底物，使酶催化反应产生可检测的信号。 6.测定：利用光密度计等设备测定底物反应产生的吸光度，从而判断待测物质是否存在。三、原理解析 1.抗原-抗体反应间接ELISA是基于抗原-抗体反应的原理。在实验中，待测物质（如蛋白质）被吸附到微孔板上，并与第一层特异性抗体结合形成复合物。此时，如果样品中存在与待测物质相对应的第二层抗体，则第二层抗体会与复合物结合形成更大的复合物。这种特异性的结合反应是ELISA检测方法的核心。 2.酶标记在间接ELISA中，酶标记是检测结果可视化的关键。在实验中，第二层抗体被标记上酶（如辣根过氧化物酶），当底物被加入时，酶催化底物产生可检测的信号（如荧光、发光、颜色变化等）。这种信号可以通过吸光度计等仪器来检测和量化。

3.非特异性结合在实验中，非特异性结合是需要避免的。为了避免非特异性结合，实验中会加入一定量的阻断剂（如牛血清白蛋白），以防止非特异性蛋白质与抗体结合。 4.优缺点间接ELISA具有以下优点：（1）灵敏度高：ELISA可以检测极低浓度的物质，通常可以检测到纳克/毫升级别的物质。（2）特异性强：ELISA可以区分不同种类的物质，因为它是基于抗原-抗体反应的原理。（3）操作简便：ELISA操作相对简单，只需要一些基本实验技能即可进行。但是，间接ELISA也存在以下缺点：（1）需要较长时间：实验时间通常需要数小时至数天不等。

间接ELISA实验方法

间接ELISA 一实验材料 1.96 孔酶标板 2. TMB 二实验试剂 1. 包被液（pH9.6）： Na2CO3 0.17g ，NaHC3O 0.28g ，加蒸馏水至100ml。4℃保存。 2. 洗涤液（PBST）: KH2PO4 0.2g ，KCl 0.2g ，NaCl 8.0g ，Na2HPO4·12H2O 2.9g ，Tween-20 0.5ml ，加去离子水至1000ml，调pH至7.2-7.4 。 3. 底物反应液: （1）底物缓冲液: 柠檬酸0.51g ，Na2HPO4·12H2O 1.84g ，加蒸馏水至100ml，充分溶解，置4℃保存备用。（2）底物反应液: a. OPD显色：称5mg OPD，避光下加入10ml 底物缓冲液，一般现配现用，用时5ml+8ul 30%H2O2。 b. TMB显色：预先配置10mg TMB/1ml DMSO溶液5ml，避光4℃保存，用时9.9ml 底物缓冲液+100ul TMB/DMS溶O液+10ul 3%H2O2避光, 现配现用） 4. 羊抗小鼠IgG-HRP 三实验步骤（1）包被：取抗原用包被液稀释至适合的包被浓度, 根据所需的孔计算出所需的包被液的量, 每孔加100ul ，37℃作用1h 后4℃过夜，此步骤是将特异性抗原与固相载体联结。（2）封闭：次日取出酶标板用PBST加满各孔洗涤3 次每次五分钟，每次充分拍干。然后每孔加入200ul 的封闭液（1%BSA或者5%脱脂乳），37℃作用2h，PBST洗涤3 次。（3）加一抗：按一定比例稀释相应的一抗，每孔加100ul 稀释液。设置阴性对照和空白对照，37℃作用1h，PBST洗涤3 次。此步骤是加稀释受检血清，使血清中的特异性抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

间接elisa的原理及应用

间接ELISA的原理及应用 1. 什么是间接ELISA 间接ELISA全称为酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是一种常用的免疫学检测方法。它依靠特定抗原和抗体之间的高度专一性反应，通过酶标记抗体或抗原的相互作用来检测目标物质的存在和浓度。 2. 间接ELISA的原理间接ELISA的原理是将待测物与特定抗原偶联到固定在微孔板上的抗原表面上。然后引入与待测物特异性结合的酶标记抗体，使其与待测物结合。接下来，通过添加底物，酶标记抗体催化底物的变色反应，从而间接检测出待测物的存在。间接ELISA的步骤如下： 1.固相涂布：将抗原溶液均匀涂布在微孔板上，使其在孔壁上固定。 2.阻断：加入一定浓度的非特异性抗体，使其与未吸附的表面结合，防止非特异性的结合。 3.加入待测物：将待测物标本加入到微孔板中与固相抗原发生特异结合。 4.加入检测抗体：加入配有酶标记的抗体，该抗体有望与待测物结合形成夹心免疫复合物。 5.洗涤：洗涤微孔板以去除未结合的物质。 6.加入底物：加入含有底物的试剂，底物受到酶催化产生变色反应。 7.阅读测量：使用酶标仪对底物反应产生的颜色进行定量检测。 3. 间接ELISA的应用间接ELISA广泛用于医学、生命科学研究、生物制药和农业领域。以下是间接ELISA在不同领域的应用： 3.1 医学领域间接ELISA在医学领域的应用非常广泛，主要用于以下几个方面： •临床诊断：可以用于检测疾病的早期诊断，如艾滋病、肝炎、结核病等。 •药物监测：可以测定药物的浓度，监测药物治疗的疗效和剂量。

•免疫学研究：可用于研究免疫系统的功能和疾病发生机制。 3.2 生命科学研究间接ELISA在生命科学研究中也有广泛的应用，主要用于以下方面：•蛋白质检测：可以用于检测目标蛋白质在细胞或生物体中的表达量。 •抗体研究：可以用于检测抗体在细胞或液体中的浓度，了解免疫应答和抗体产生的情况。 •基因表达：可以用于检测转基因植物或动物中目标基因的表达水平。 3.3 生物制药间接ELISA在生物制药中有重要的应用，主要用于以下方面： •疫苗研制：可以用于疫苗生产中对抗原含量的检测和疫苗稳定性的评估。 •蛋白质药物监测：可以用于监测蛋白质药物的纯度和活性。 •药物检测：可以用于药物的浓度检测和质量控制。 3.4 农业领域间接ELISA在农业领域也有一定的应用，主要用于以下方面： •病原菌检测：可以用于检测作物上的病原菌，进行病害的早期预警。 •农药残留检测：可以用于检测农产品中农药的残留量，保障农产品的安全性。 •家畜免疫监测：可以用于检测家畜免疫水平，预防疫病的发生。以上是间接ELISA的原理及应用的简要介绍。通过间接ELISA的特异性和敏感性，我们可以快速、准确地检测出目标物质的存在和浓度，为医学、科研和生产领域提供了强有力的支持。

ELISA方法的及步骤

ELISA方法的及步骤 (一) 原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 (二) 操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D 值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。方法二用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。 ↓ 加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)

ELISA原理及步骤

ELISA原理及步骤 ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附法）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的分析技术。它基于免疫学原理，通过检测特定抗原和抗体的结合来定量测定目标物。 1.直接ELISA的原理及步骤：直接ELISA方法适用于已知抗体，且目标物的抗原性较好的情况。该方法将特异性的抗原通过硫酸盐或其他方法固定于微孔板上，然后用荧光素标记的抗体与其结合，最后通过测量荧光素的荧光强度来进行定量测定。步骤： 1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。 2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。 3）加入荧光素标记的抗体，与抗原特异性结合。 4）洗涤净化微孔板以除去未结合的荧光素标记的抗体。 5）加入底物，并进行发光强度测定。 6）测量荧光素的荧光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。 2.间接ELISA的原理及步骤：间接ELISA方法适用于已知抗原，但目标物的抗原性较差的情况。该方法在抗原固定之后，加入绕行适体素标记的次级抗体，通过该次级抗体与目标物特异性结合，最后通过测量标记抗体的发光强度来进行定量测定。步骤：

1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。 2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。 3）加入特异性的初级抗体与目标物结合。 4）洗涤净化微孔板以除去未结合的初级抗体。 5）加入绕行适体素标记的次级抗体，使其与初级抗体结合。 6）洗涤净化微孔板以除去未结合的次级抗体。 7）加入底物，并进行发光强度测定。 8）测量标记抗体的发光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。 3.竞争ELISA的原理及步骤：竞争ELISA方法适用于已知抗体和已知抗体与抗原的结合关系的情况。该方法将标记抗原与固定抗原共同加入到微孔板中，通过测量标记抗原与抗体的竞争情况来进行定量测定。步骤： 1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。 2）将标记抗原共同加入到微孔板中。 3）加入抗体，使其与固定抗原和标记抗原竞争结合。 4）洗涤净化微孔板以除去未结合的抗体。 5）加入底物，并进行发光强度测定。