elisa常用方法及其原理

Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验方法，广泛应用于生物学和医学研究中。本文将介绍Elisa的常用方法及其原理。

一、Elisa的基本原理

Elisa是一种通过检测抗原-抗体反应来测定物质浓度的方法。其基本原理是将待测物质（抗原或抗体）固定在固相载体上，然后加入特异性的酶标记二抗，通过酶标记物的催化作用，将待测物质与酶底物反应产生可测定的信号。Elisa可以根据待测物质的特异性与酶标记物的催化作用来测定物质的浓度。

二、Elisa的常用方法

1.直接Elisa法：将待测抗原直接固定在固相载体上，然后加入酶标记的第一抗体，通过酶标记物的催化作用来测定抗原的浓度。这种方法简单快速，适用于抗原浓度较高的情况。

2.间接Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的第一抗体，再加入酶标记的第二抗体，通过酶标记物的催化作用来测定抗原的浓度。这种方法灵敏度较高，适用于抗原浓度较低的情况。

3.竞争Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的酶标记抗体和待测样品，通过抗原与酶标记抗体的竞争来测定抗原的浓度。这种方法可以测定抗原和抗体的亲和力，适用

于测定抗原或抗体的亲和力常数。

4.间接竞争Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的第一抗体，再加入酶标记的第二抗体和待测样品，通过第一抗体与第二抗体的竞争来测定抗原的浓度。这种方法可以测定抗原和抗体的亲和力，适用于测定抗原或抗体的亲和力常数。

三、Elisa的操作步骤

1.涂覆：将待测物质（抗原或抗体）溶液加入固相载体上，使其吸附固定在载体表面。

2.阻断：加入适当的阻断剂，防止非特异性结合。

3.第一抗体反应：加入特异性的第一抗体，使其与待测物质发生特异性结合。

4.洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。

5.酶标记抗体反应：加入酶标记的第二抗体，使其与第一抗体结合。

6.洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的酶标记抗体。

7.底物反应：加入酶底物，通过酶的催化作用产生可测定的信号。

8.停止反应：加入停止液停止酶的催化作用。

9.测定结果：使用酶标仪或光谱仪测定产生的信号强度，根据标准

曲线计算待测物质的浓度。

四、Elisa的优缺点

Elisa方法具有以下优点：

1.高灵敏度：可以检测到非常低浓度的物质。

2.高特异性：可以通过特异性抗体实现对特定物质的检测。

3.简单快速：操作相对简便，结果可以在短时间内得出。

4.适用范围广：可以用于检测各种类型的物质，包括蛋白质、抗体、病毒、细胞因子等。

然而，Elisa方法也存在一些缺点：

1.需要特异性抗体：需要针对待测物质的特异性抗体，因此对于没有特异性抗体的物质无法进行检测。

2.操作步骤繁琐：Elisa方法需要多个步骤和多次洗涤，操作过程较为繁琐，容易出现误差。

总结：

Elisa作为一种常用的实验方法，在生物学和医学研究中起着重要作用。其基本原理是通过抗原-抗体反应测定物质浓度，常用方法包括直接Elisa、间接Elisa、竞争Elisa和间接竞争Elisa。Elisa具有高灵敏度、高特异性和广泛适用性的优点，但也存在依赖特异性抗体和操作步骤繁琐的缺点。通过合理应用Elisa方法，可以实现对不同物质的准确测定，为科学研究和临床诊断提供有力支持。

ELISA六种方法类型及原理

ELISA六种方法类型及原理 ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验技术，用于测定样品中特定抗原或抗体的存在和浓度。它的原理基于抗原和抗体之间的专一结合，利用酶标记的抗体或抗原来检测并定量目标物。ELISA有多种不同的方法类型，以下将对其中六种方法类型及其原理进行详细介绍。 1.直接ELISA：直接ELISA是最简单和最常用的ELISA方法，适用于寻找目标抗原。在这种方法中，被测抗原直接吸附在固相或表面上，然后与特异性酶标记的抗原特异性结合。最后，通过酶标记的底物的反应来定量测定目标物的浓度。 2.间接ELISA：间接ELISA也是常用的方法，适用于寻找目标抗体。首先，将被测抗原吸附在固相或表面上，然后加入待测抗体。之后，特异性结合的第二抗体（酶标记的）被加入用于识别和检测第一抗体。最后通过酶标记的底物的反应来定量测定目标物的浓度。 3.竞争ELISA：竞争ELISA用于检测样品中的特定抗原或抗体。在这种方法中，特异性酶标记的抗原或抗体与待测样品中的抗原或抗体竞争结合。通过测定酶标记物的信号强度，可以确定待测样品中目标物的含量。 4.间接竞争ELISA：间接竞争ELISA是一种用于定量测定目标抗原的方法。首先，在固相或表面上吸附被测抗原，然后加入特异性抗体。该抗体与样品中的目标物

竞争结合。接着，再加入另一特异性抗体，该抗体与前面结合的抗体有竞争关系。最后通过测定酶标记物的信号强度，可以确定目标物的浓度。 5.间接夹心ELISA：间接夹心ELISA用于寻找样品中的特定抗体。首先，在固相或表面上吸附被测抗原，然后加入待测抗体。随后，特异性酶标记的第二抗体被加入，用于识别和检测待测抗体。最后通过测定酶标记物的信号强度，可以定量测定目标抗体的浓度。 6.双抗体ELISA：双抗体ELISA常用于寻找特定抗原。首先，在固相或表面上吸附被测特异性抗体，然后加入样品。目标抗原与抗体特异性结合。接着，酶标记的第二抗体被加入，该抗体与目标抗原结合。最后通过测定酶标记物的信号强度，可以定量测定目标抗原的浓度。总结起来，ELISA有多种方法类型，包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、间接竞争ELISA、间接夹心ELISA和双抗体ELISA。这些方法类型的选择取决于需要检测的目标物和实验的目的。每种方法都有其特定的应用场景和操作步骤，通过这些方法可以准确、快速地检测目标物的存在和浓度。

ELISA原理和几种方法

基本原理 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。方法类型和操作步骤 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

ELISA原理和应用

1.ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 2.ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型： 2.2.1双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标（参见6.2）。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。 2.2.2 双抗原夹心法测抗体

elisa常用方法及其原理

elisa常用方法及其原理 Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验方法，广泛应用于生物学和医学研究中。本文将介绍Elisa的常用方法及其原理。一、Elisa的基本原理 Elisa是一种通过检测抗原-抗体反应来测定物质浓度的方法。其基本原理是将待测物质（抗原或抗体）固定在固相载体上，然后加入特异性的酶标记二抗，通过酶标记物的催化作用，将待测物质与酶底物反应产生可测定的信号。Elisa可以根据待测物质的特异性与酶标记物的催化作用来测定物质的浓度。二、Elisa的常用方法 1.直接Elisa法：将待测抗原直接固定在固相载体上，然后加入酶标记的第一抗体，通过酶标记物的催化作用来测定抗原的浓度。这种方法简单快速，适用于抗原浓度较高的情况。 2.间接Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的第一抗体，再加入酶标记的第二抗体，通过酶标记物的催化作用来测定抗原的浓度。这种方法灵敏度较高，适用于抗原浓度较低的情况。 3.竞争Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的酶标记抗体和待测样品，通过抗原与酶标记抗体的竞争来测定抗原的浓度。这种方法可以测定抗原和抗体的亲和力，适用

于测定抗原或抗体的亲和力常数。 4.间接竞争Elisa法：将待测抗原固定在固相载体上，然后加入与抗原特异性结合的第一抗体，再加入酶标记的第二抗体和待测样品，通过第一抗体与第二抗体的竞争来测定抗原的浓度。这种方法可以测定抗原和抗体的亲和力，适用于测定抗原或抗体的亲和力常数。三、Elisa的操作步骤 1.涂覆：将待测物质（抗原或抗体）溶液加入固相载体上，使其吸附固定在载体表面。 2.阻断：加入适当的阻断剂，防止非特异性结合。 3.第一抗体反应：加入特异性的第一抗体，使其与待测物质发生特异性结合。 4.洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。 5.酶标记抗体反应：加入酶标记的第二抗体，使其与第一抗体结合。 6.洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的酶标记抗体。 7.底物反应：加入酶底物，通过酶的催化作用产生可测定的信号。 8.停止反应：加入停止液停止酶的催化作用。 9.测定结果：使用酶标仪或光谱仪测定产生的信号强度，根据标准

ELISA实验原理及操作

ELISA实验原理及操作 ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测和定量分析特定分子（如蛋白质、抗原、抗体等）的存在和浓度。ELISA实验基于特异性抗原-抗体相互作用的原理，其中酶被用作信号发生器。以下将详细介绍ELISA实验的原理和操作步骤。实验原理： 1.吸附：首先，将待检测物质（如抗原、抗体等）稀释并加入到孔板（通常是96孔板）中的孔中。然后，将孔板在低温条件下孵育，使待检测物质与孔壁结合。 2.结合：在吸附步骤完成后，孔板中存在未结合的部分空白孔。这些空白孔将被添加特异性的第二抗体或标记物与待测物质的结合进行识别。当第二抗体结合到待测物质时，会形成一个抗原-抗体-第二抗体（或标记物）复合物。 3.检测：根据所使用的标记物的不同，有两种常用的检测方法：酶标方法和荧光方法。在酶标方法中，标记物通常是酶，如HRP（辣根过氧化物酶）或AP（碱性磷酸酶）。标记物可以与底物反应，产生一个可检测的信号。通过加入特定的底物和染色物质，可以检测到酶的活性，从而确定待测物质的存在和浓度。操作步骤： 1.准备试剂和设备：如溶液、洗涤缓冲液、酶标板、吸液管、微量分注器、孔板读数仪等。

2.样品制备：将待测物样品适当稀释，并添加到孔板中。正样和阴性对照也需相应加入。每个样品应有至少两个孔。 3.孔板处理：将孔板置于4°C的冰箱中孵育一段时间，使待测物与孔壁结合。然后，将标准物质和对照物质加入到孔板中的相应孔中。 4.吸除样品：将孔板倒置，并使用洗涤缓冲液洗涤孔壁上未结合的物质。 5.结合抗体：加入特异性的第二抗体或标记物，使其与待测物结合。 6.吸除未结合的抗体：用洗涤缓冲液洗涤孔壁上未结合的抗体。 7.信号发生：加入底物和染色剂，允许酶与底物反应，生成可检测的信号。 8.读取结果：使用孔板读数仪测量各孔的吸光度，并将其转化为待测物浓度。需要注意的是，每个实验都应包括阴性对照、阳性对照和标准曲线。通过与标准曲线比较，可以确定待测物的浓度范围。此外，操作过程中需要保持严格的操作规范，避免交叉污染和误差的发生。总结： ELISA是一种敏感、特异且广泛应用于医学、生物化学和生物技术领域的实验方法。它可以用于检测和定量分析特定分子的存在和浓度。通过吸附、结合和检测三个步骤，ELISA实验可以提供快速和准确的结果，并广泛应用于诊断、药物研发和基础研究等领域。

elisa的方法及原理

elisa的方法及原理 Elisa（酶联免疫吸附测定）是一种常用于检测特定蛋白质、抗体或抗原的分析方法。它具有高度的敏感性和特异性，被广泛应用于医学、生物学和生物技术领域。本文将介绍Elisa的原理、步骤和应用。一、Elisa的原理 Elisa基于免疫学原理和酶学反应，通过特异性抗原-抗体反应来检测目标物质的存在与否。Elisa通常包括以下几个关键步骤： 1. 固定抗原：将目标抗原固定在盘或膜上，以便后续的抗体结合反应。 2. 试样添加：将待测样品加入固定抗原的孔中，允许样品中的抗原与已固定的抗原发生结合。 3. 抗原结合：加入特异性的抗体，并使其与待测样品中的抗原结合。 4. 洗涤：通过洗涤剂去除未结合的物质，以减少非特异性反应。 5. 酶标记抗体结合：加入酶标记的抗体，它与待测样品中的抗原结合。 6. 信号发生：加入染色底物，使酶标记的抗体产生一个可测量的信号（如颜色变化）。 7. 信号检测：使用光度计或其他测量仪器测量信号的强度，与标准曲线相比较，确定待测样品中目标物质的浓度。

二、Elisa的步骤 Elisa的步骤十分关键，需要严格按照以下程序进行： 1. 准备工作：准备所需的试剂和设备，保持实验区域的洁净。 2. 抗原包被：将具有特异性的抗原添加到固相载体（如96孔板或膜）上，制备固定抗原。 3. 样品添加：将待测样品和标准品加入孔中，与固定抗原发生结合。 4. 增强体添加：加入特异性的酶标记抗体，允许其与结合的抗原发生结合。 5. 洗涤：通过洗涤液去除未结合的物质，减少背景干扰。 6. 底物加入：加入染色底物，与酶标记的抗体发生酶学反应。 7. 反应终止：加入终止液，停止酶学反应，保持结果稳定。 8. 信号测量：使用光度计测量发色底物的吸光度，与标准曲线或对照样品进行比较。三、Elisa的应用 Elisa具有广泛的应用领域，以下是一些常见的应用示例： 1. 医学诊断：Elisa可用于检测疾病标记物、肿瘤标志物和病原体抗体，用于早期诊断和治疗监测。 2. 免疫学研究：Elisa可用于研究免疫相关蛋白质、细胞因子和细胞表面受体，以深入了解免疫系统功能。

ELISA原理和几种方法

ELISA原理和几种方法 ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）是一种基于免疫学原理的广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的试验方法。其原理是利用酶标记的抗体特异性结合待检测样品中的抗原，通过酶的催化作用可产生可测量的信号，从而得到待检测物质的含量或者存在与否。 1.直接和间接ELISA 直接ELISA方法利用抗体的特异性与待测抗原结合，然后使用酶标记的二抗与抗体结合，最后通过酶促反应产生可测量的信号。这种方法的优势是快速、简便、灵敏，但可能会受到待测样品中其他成分对结果影响。间接ELISA方法在抗原检测过程中引入第二抗体，即先将待测样品中的抗原与特异性抗体结合，然后再添加酶标记的二抗，最后通过酶促反应产生可测量的信号。间接ELISA方法具有较高的灵敏性和特异性。 2.竞争ELISA 竞争ELISA方法主要用于检测待测样品中含有的抗原或者小分子的结合物。这种方法将标记好的抗原和样品中的抗原同时参与竞争与抗体结合，通过比较信号减弱程度来推断待测样品中的抗原含量。竞争ELISA方法适用于测定一些药物、激素、多肽等小分子物质。 3.夹心ELISA 夹心ELISA方法与间接ELISA类似，不同之处在于在固定的抗原上添加待测物和酶标记的抗体，形成“抗原-待测物-抗体-酶标记抗体”的夹心结构。夹心ELISA方法可以检测血清中的抗体或者病原微生物，具有高灵敏度、高特异性的优点。

4.反应速率ELISA 反应速率ELISA方法是通过等量连续添加底物，通过酶催化反应的速率来测定待检测物质的含量。这种方法通常更加灵敏，并且可以测定底物转化的程度，可以应用于药物浓度测定和代谢物鉴定等领域。总之，ELISA方法是一种非常重要的生物学检测技术，可以快速、简便地检测待测物质的含量或者存在与否。不同的ELISA方法适用于不同的检测对象和目的，在生物医学研究和临床诊断中起到了重要的作用。

ELISA原理方法及操作细节

ELISA原理方法及操作细节 ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于定量或定性检测特定抗原或抗体的存在。ELISA方法简单、灵敏、高效，并且可以在多个领域应用，如医学诊断、药物筛选等。下面将详细介绍ELISA的原理、方法及操作细节。一、原理： 1.涂布：将待检测的抗原或抗体溶液均匀地涂布在固相载体（如96 孔板）上。 2. 靶抗体结合：将Biotin标记的靶抗体加入孔内，与涂布的抗原或抗体特异性结合。 3.洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的物质。 4. 标记物-酶结合：将辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）加入孔内，与靶抗体的生物素标记位点结合。 5.再次洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的标记物-酶。 6.底物反应：加入底物，酶催化底物发生颜色反应。 7.反应停止：加入反应停止液，停止底物的反应，生成的颜色与待测抗原或抗体的浓度成正比。 8.检测：用酶标仪测定反应产生的颜色强度，根据已知标准曲线得出待测样品中抗原或抗体的浓度。二、方法及操作细节：

1.准备实验材料：包括96孔板、洗涤缓冲液、稀释缓冲液、标准品、抗原或抗体、探针和底物等。 2.板涂布：将待测抗原或抗体溶液加入96孔板中，保持平衡涂布，可以在4℃下过夜或室温下孵育2小时。 3.洗涤：将洗涤缓冲液加入孔内，轻轻振动去除非特异性结合物。 4.添加靶抗体：将靶抗体加入孔内，孵育一定时间，通常为1小时，用稀释缓冲液来稀释靶抗体。 5.再次洗涤：将洗涤缓冲液加入孔内，洗去未结合的靶抗体。 6. 加入标记物-酶：将Streptavidin-HRP加入孔内，与靶抗体的生物素标记位点结合，孵育一定时间。 7. 再次洗涤：将洗涤缓冲液加入孔内，洗去未结合的 Streptavidin-HRP。 8.底物反应：将底物加入孔内，酶催化底物发生颜色反应，孵育一定时间。 9.反应停止：加入反应停止液，停止底物的反应，生成的颜色停止变化。 10.检测：用酶标仪测定每孔的吸光度，将其与已知标准曲线比较，得出待测样品中抗原或抗体的浓度。 11.数据处理：计算结果并进行统计分析，根据需要可使用不同的数据处理软件。三、实验注意事项：

ELISA的基本原理和方法

ELISA的基本原理和方法 ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种广泛应用于生物医学领域的免疫分析方法，被用于检测体内或体外的抗原或抗体。其基本原理是利用酶标记技术和免疫反应原理来定量测定样品中特定抗原或抗体的浓度。 1.固相吸附：将特定的抗原或抗体固定于具有高亲和性的固相载体，如微孔板。在微孔板表面以共价键或非共价键结合，确保其稳定性和固定性。 2.样品加入：待测样品中的抗原或抗体与固相载体上的抗体或抗原进行特异性结合。 3.洗涤：通过洗涤步骤，去除非特异性的结合物，保留特异性结合物。 4.酶标记：加入特异性抗体或抗原与被测物结合，并经过化学或酶反应与酶结合或直接偶联。常用的酶标记物包括辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），它们能够产生可见的信号。 5.洗涤：再次进行洗涤，以去除非特异性的结合物。 6.底物加入：加入酶底物，使其与酶结合发生化学反应，生成可见的信号。例如，HRP酶作用于染色底物，产生可见的颜色。 7.反应终止：通过加入酸或碱，停止酶反应，并停止信号产生。 8.读取结果：使用酶标仪或颜色比较法测定样品中特定抗原或抗体的浓度，根据信号的强度来定量分析。根据不同的检测目的和所用的抗原或抗体，ELISA可以分为以下几种常见的方法：

1.间接ELISA：通过固相吸附将抗原固定于微孔板上，再加入待测样品，样品中的抗体与固定抗原结合，再加入酶标记的二抗结合到抗体上，经过洗涤和底物加入后，酶反应发生，生成可见的信号。 2.直接ELISA：将酶标记的抗体直接与待测抗原结合，而无需预先固定。该方法简单快捷，但灵敏度较低。 3.间接竞争ELISA：通过共同的固相抗原和酶标记二抗与待测样品中的竞争抗原或抗体结合，竞争性质绑定，样品中特异性结合物的浓度与酶标记物结合信号强度呈负相关关系。 4.半定量ELISA：通过标准曲线法，将已知浓度的标准样品与待测样品的酶标特异性蛋白或抗体进行竞争，通过样品和已知浓度标准之间的关系，来确定待测样品中特异性结合物的浓度范围。 5.双抗夹心ELISA：将待测样品加入固相抗原上，结合后加入酶标记的二抗与样品中特异结合物反应，并通过洗涤和底物加入来形成信号。总之，ELISA作为一种常用的生化分析技术，已经成为许多生物医学领域中重要的检测方法之一，其灵敏度和特异性使其适用于体外植入器械、微生物检测、遗传检测、肿瘤标志物检测、药物检测和生物检测等多个领域。

ELISA方法的基本原理和操作步骤

ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理： 1.直接ELISA：直接将酶标记的抗体与待测样品中的抗原结合。该方法简单，适用于检测高浓度抗原，但不适用于低浓度抗原检测。 2.间接ELISA：先将待测样品中的抗原与特异性抗体结合，随后再加入酶标记的二抗与该特异性抗体结合。该方法适用于特异性抗体较多的情况，能够提高检测灵敏度。 3.夹心ELISA：利用两种抗体分别与待测样品中的抗原结合，形成夹心复合物。酶标记抗体与第二个抗体结合的复合物逐渐积累，从而实现对目标分子的定量检测。 4.竞争ELISA：利用酶标记抗体与待测样品中的抗原竞争结合，根据酶标记物对底物的催化反应产生的信号强度来反映待测样品中抗原的浓度。操作步骤： 1.酶标板涂布：取出96孔的酶标板，在每孔中加入特异性抗体，通常用于检测的是抗原，也可以是抗体。将酶标板在4°C下孵育数小时或过夜，使抗体吸附在孔壁上。 2.冲洗：倒掉孔内液，用PBS-T洗涤缓冲液冲洗3-4次，去除未结合的抗体。 3.阻断：加入阻断缓冲液如5％的牛血清白蛋白(BSA)或非脂乳粉，防止非特异性结合。 4.样品加入：加入待测样品、标准品或对照样品，使待测物质与固相抗体结合。

5.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的样品。 6.酶标记抗体：加入酶标记的二级抗体，即酶联检测剂。 7.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的酶标记抗体。 8.底物加入：加入底物，底物受到酶标记的物质的催化，会产生信号。 9.反应停止：加入反应停止液，终止底物的反应。 10.读取结果：通过酶催化底物反应的产物颜色的变化，利用酶标仪读取OD值，反映抗原或抗体的浓度。

ELISA的基本原理和方法

ELISA的基本原理和方法 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)，也称为酶联免疫吸附法，是一种常用的免疫学检测方法，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发中。ELISA的基本原理是利用抗原与抗体之间的特异结合来检测和量化抗原或抗体的存在。 ELISA的基本方法是将待测物（抗原或抗体）与特异性的抗体进行相互作用，然后使用染色反应来测定这种相互作用的程度。通常，ELISA可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等不同的变种。直接ELISA是最简单的一种ELISA方法。它首先在固体载体（如酶标板）上固定抗原，然后将样品中的抗体添加到载体上与固定的抗原相结合。随后，用与待测物标记有酶的抗体（通常是辣根过氧化物酶，HRP）与结合的抗体结合。最后，加入适当的底物，通过测量酶催化反应产生的颜色变化程度来定量检测待测物的浓度。间接ELISA是一种更常见的ELISA方法。在这种方法中，首先在固体载体上固定抗原，然后加入待测物，使其与固定的抗原结合。随后，加入一个与待测物结合的辣根过氧化物酶标记的二抗（通常是兔抗人IgG），这个二抗与待测物结合形成免疫复合物。最后，加入适当的底物，通过测量酶催化反应产生的颜色变化程度来定量检测待测物的浓度。相比直接ELISA，间接ELISA可以提高信号的灵敏度。竞争ELISA是一种用于检测样品中抗原浓度的ELISA方法。在这种方法中，固定的抗原被标记有酶的与待测抗原存在竞争关系的抗体结合。然后，待测样品中的抗原与标记抗原竞争与抗体结合。待测样品中抗原的浓

ELISA原理和分类(附图解)

一、ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。二、ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“酶联物”、“结合物”（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：（一）双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。（3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。（4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显

ELISA方法及基本原理

ELISA的概念、原理、操作步骤 ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。 (一)原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即：用于检测抗体的间接法(图a) 、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 (二) 操作步骤方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA 检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。方法二：用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW 洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。 (三) 试剂器材 1. 试剂： (1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液): NaCO31.59g, NaHCO32.93g加蒸馏水至1000ml； (2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, NaCl 8.0g, KCl 0.2g Tween-20 0.05％0.5ml 加蒸馏水至1000ml (3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1g 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。 (4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。 (5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸

elisa的基本原理方法类型及应用

Elisa的基本原理、方法类型及应用概述 Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用于生物化学和生物医学研究领域的实验技术。它利用酶标记的抗原或抗体与待测物相互作用并生成可读出的信号，从而达到检测和定量分析的目的。本文将介绍Elisa的基本原理、方法类型及应用。基本原理 Elisa的基本原理是通过特异性抗原与抗体间的结合反应来检测和定量分析待测物。其基本步骤如下： 1.固定：将抗原或抗体固定在固相载体（如微孔板、膜等）上，形成固定相； 2.实验样本加入：加入待测物样本到固相载体中，使待测物与固定的抗体或抗原发生特异性结合； 3.洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的物质； 4.酶标记的抗体或抗原结合：加入酶标记的抗体或抗原，使其与待测物发生反应； 5.洗涤：再次洗涤以去除未结合的酶标记的抗体或抗原； 6.底物添加：加入底物，通过酶催化反应生成可检测的信号； 7.信号检测：利用光度计、荧光计等仪器测量所产生的信号。方法类型 Elisa通常可以分为以下几种类型： 1.间接Elisa：该方法是最常用的Elisa类型之一。它通过在固相载体上固定抗原，然后加入待测物和酶标记的抗体，最后通过添加底物产生颜色反应来测定待测物的浓度。 2.直接Elisa：该方法直接在固相载体上固定酶标记的抗原，待测物与固定的抗原发生反应后，通过添加底物测定待测物的浓度。与间接Elisa相比，直接Elisa节省了一个环节，因此更简单和快速。 3.竞争性Elisa：该方法适用于待测物是小分子的情况。竞争性Elisa将待测物与酶标记的抗原竞争与固定抗原结合，通过测定底物的酶活性来测定待测物的浓度。 4.逆转Elisa：该方法常用于检测体内特定抗体的浓度。逆转Elisa是将固定抗体或抗原加入实验样本中，之后加入酶标记的待测物，最后通过添加底物的酶活性来测定抗体的浓度。

ELISA原理总结

ELISA实验原理总结 ELISA 即酶联免疫吸附测定，是一类常用的免疫酶技术。主要方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，然后利用酶标记（偶联）的抗体或抗原与之孵育，加入显色剂显色，通过酶标仪测定待测物颜色与标准物颜色的差异，绘制出酶活曲线得出待测物浓度。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。ELISA实验中有三种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（用于结合到固相载体上） ②标记的抗原或抗体（标记物） ③作用的底物（显色剂，用于显色）四种常见ELISA方法 1.直接ELISA 将抗原固定于ELISA板上，然后用酶标抗体直接检测抗原。优点：（1）直接ELISA实验步骤少，检测速度快；（2）不需要用到二抗，避免了交叉反应，测定结果不容易出错。缺点：（1）由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与ELISA板结合，实验背景会比较高；（2）直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活；（3）由于没有使用二抗，信号没有被放大，降低了测定的灵敏度。 2.间接ELISA 先将抗原结合到ELISA板上，随后分两步进行检测：首先加入检测抗体与抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。优点：（1）与直接ELISA相比，间接ELISA用到酶标二抗，具有更高的灵敏度，也需要更少的标记抗体，更经济；（2）间接ELISA还提供了更大的灵活性，因为不同的一抗能够与单一标记的二抗一同使用。缺点：（1）是存在交叉反应的可能性（酶标二抗直接与抗原结合），可能会增加背景；

（2）同时与直接ELISA相比，间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。 3.夹心ELISA 先将捕获抗体固定于ELISA板孔中，然后加入样品，接着加入检测抗体。如果检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心ELISA；如果检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心ELISA。优点：（1）灵敏度高：比直接或间接ELISA敏感2-5倍；（2）特异性高：夹心ELISA使用两种特异性抗体与抗原结合，拥有很高的特异性；（3）灵活性较高：夹心ELISA能够通过直接或间接的方式进行检测，灵活性较高。缺点：（1）对配对抗体要求很高，如果没有标准化的试剂盒或者已经通过测试的配对抗体，则需要进行配对抗体定制并进行优化，因为降低捕获抗体与检测抗体之间的交叉反应是非常重要的。 4.竞争ELISA法预先将抗原包被在固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体。实验时，加入待检抗原（或抗体），如果待检物是抗原，则待检抗原与预先包被在固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体；如果待检测物是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被在固相载体上的抗原。通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体，最后加底物显色。需要注意的是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比。优点：（1）可检测不纯的样品；（2）数据再现性高。缺点：（1）整体敏感性和专一性较差。 ELISA常见问题与解决方法： 1.阴性对照出现阳性结果 ①样品、试剂被污染，或加样时操作不当导致相邻孔之间溶液溅洒出现交叉污染——更换试剂，小心操作。 ②酶标板洗涤不彻底——洗板前先将抗体溶液倒干净，然后清洗液倒满板孔，确保能充

酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理

酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，用于检测并定量测定生物样品中的抗体或抗原。ELISA方法包括直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等。下面将对这些方法的类型和反应原理进行详细介绍。 1.直接ELISA 直接ELISA是最简单的ELISA方法之一、在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。然后加入特异性抗体，这些抗体已标记有酶，比如辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP），然后加入适当的底物。酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。 2.间接ELISA 间接ELISA是常用的ELISA方法之一，比直接ELISA灵敏度更高。在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原，然后加入待检测样品，如血清等。待检测样品中的抗体与涂覆的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。然后加入与待测抗体特异性的二抗，这些二抗已标记有酶，如HRP，再加入适当的底物。酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。 3.竞争ELISA 竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的ELISA方法。在这种方法中，微孔板表面上涂覆有特异性抗体，然后加入待检测样品和已标记的抗原或抗体。待检测样品中的抗原或抗体与涂覆的抗体竞争结合，

形成复合物。然后加入特异性的抗原或抗体，这些抗原或抗体已标记有酶，比如HRP，继续竞争与涂覆抗体结合。酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成反比。 4.间接竞争ELISA 间接竞争ELISA是一种用于测定样品中抗原或抗体浓度的高灵敏度ELISA方法。在这种方法中，微孔板表面上涂覆有抗原。首先，加入待检测样品和已标记的抗原或抗体。待检测样品中的抗原或抗体与特异性抗体竞争结合，形成复合物。然后加入未标记的特异性抗体，再加入已标记的二抗，如HRP，继续竞争与涂覆抗原结合。酶与底物反应产生比色或荧光信号，信号的强度与待测样品中抗原或抗体的浓度成正比。 ELISA的反应原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合反应。ELISA 的微孔板表面通常涂覆有抗原或抗体，待检测样品中的抗体或抗原与涂覆的物质结合形成复合物。经过清洗步骤，加入与样品中的抗体或抗原特异性结合的二抗，这些二抗已标记有酶。然后加入适当的底物，底物与酶反应产生比色或荧光信号。这些信号的强度与待测样品中抗体或抗原的浓度成正比，通过比色或荧光检测设备可以定量测定待测样品中抗体或抗原的浓度。总的来说，ELISA是一种简单而有效的生物化学分析方法，广泛应用于医学诊断、生物学研究、药物研发等领域。不同类型的ELISA方法有不同的适用范围和优势，可以根据具体实验需求选择合适的方法进行检测和分析。