食品化学实验指导书第二版
食品化学实验指导书
编写整理人员：
丁长河鲁玉杰王争艳布冠好杨国龙田双岐河南工业大学粮油食品学院
2013年4月
实验一食品水分活度的测定
一、实验目的
掌握食品水分活度仪器测量方法。
二、实验原理
样品在密闭空间与空气水汽交换平衡后，其分水活度近似等于密闭空间空气的相对湿度。
三、实验材料与仪器
水分活度仪LabSwift（瑞士Novasina）。
测量样品：小麦、面粉。
四、实验步骤
1．接上电源线，将电源线插头插入带电插座内；
2．按MENU键开机，仪器自动运行“WARM UP”模式，经几分钟后，稳定并显示出测量腔的温度和水分活度值；
3．将标准品放入测量腔内（体积不要超过塑料器皿的上边缘），盖上仪器的上盖，默认模式为F模式，按MENU键开始测量；
4．仪器显示器上方会显示数据，下方会显示ANALYSIS及温度，下方数字会闪烁；
5．待仪器到达分析终点后会发出蜂鸣声并所有数字停止闪烁，此时即为测定平衡终点；
6．按MENU键，然后按ACTURAL键至屏幕显示CALIB页面，再按MENU 键进入校正程序；
7．仪器页面此时会显示数字，下面会有CAL XX字样，XX代表着放进去的标准品的浓度，然后按MENU键；
8．仪器页面会显示0000提示输入密码，按ACTURAL及MENU键输入8808，具体是按ACTURAL选择数字，按MENU确认；
9．密码输入后仪器显示为CAL NO，此时按ACTURAL使之变为CAL YES，按MENU确认，仪器会显示WAITING至DONE，此时校正结束，仪器页面显示水活度值；
10．将待测样品放入塑料盒（去掉塑料盒的盖子）后放入测量腔内，盖上盖子，默认模式仍然是F，仪器自动进行测量；
11．仪器显示器上方会显示数据，下方会显示ANALYSIS及温度，下方数字会闪烁；
12．待仪器到达分析终点后会发出蜂鸣声并所有数字停止闪烁，此时即为测定平衡终点；
13．分析结束后，长按MENU键仪器会显示OFF，并自动关机，拔下电源线，将仪器及电源线放入便携箱内。
注意：实际试验操作过程中，由于设备已校准，第3-9步不需要操作。
五、实验结果
记录样品的水分活度和测定时的温度。
六、注意事项
1．取样要在同一条件下进行，操作要迅速。
2．试样的大小和形状对结果的影响较小。
实验二淀粉的糊化和凝胶化实验
一、实验目的
1．了解淀粉糊化和凝胶形成作用的不同。
2．了解直链／支链淀粉比改变对淀粉糊黏度和淀粉凝胶强度的影响。
3．了解淀粉浓度、类型、糊化温度以及蔗糖、有机酸对淀粉糊化及凝胶形成的影响。
二、实验原理
常见的食用淀粉包括谷物淀粉、块茎淀粉和豆类淀粉等。淀粉处于淀粉粒状态是不能食用的，不论是为了去除生淀粉的风味、提高淀粉的消化性，还是发挥淀粉的增稠和凝胶作用，都要求使淀粉糊化。淀粉糊化时，其黏性和凝胶性质因淀粉品种不同而不同。这主要是由于不同品种淀粉所含的直链淀粉和支链淀粉比例不同，另外淀粉粒大小和聚合度不同也有一定的影响。
普通玉米、小麦、马铃薯淀粉中直链／支链淀粉比分别为23／77、24／76和22／78，大米淀粉中该比值为17／83，蜡质玉米和糯米淀粉中很少或几乎不含直链淀粉，而绿豆和豌豆淀粉中很少含支链淀粉。这种不同造成了它们具有不同的食用功能。
淀粉粒在水中加热所发生的变化叫糊化。常温下，淀粉悬液中的淀粉粒无明显变化；随着加热到60~70℃，水分子可穿透淀粉粒中的无定形区；继续升温则结晶区的氢键被打断，整个淀粉粒会更加疏松膨胀。使全部淀粉粒发生膨胀，双折射现象从开始失去到完全失去的温度范围叫糊化温度范围(见表1-3)。在糊化中除淀粉膨胀外，直链淀粉还会从膨胀的淀粉粒中向外淋滤，当直链淀粉扩散到水中后就形成胶体溶液，而未破坏的淀粉粒悬浮于其中。当温度更高时，淀粉粒便破裂成一系列片段。
表2-1 不同粮食淀粉的糊化温度范围
糊化后的淀粉液冷却时，直链淀粉间首先形成氢键而相互结合，当高度膨胀的淀粉粒与临近的直链淀粉间形成广泛的三维网状结构而形成凝胶，大量水固定在该网状结构中。凝胶形成后的前几个小时，凝胶强度不断加强，直至趋于稳定。仅仅含支链淀粉的淀粉粒溶液不能形成凝胶(尽管黏度可能不小)，除非含量高达30％以上。一般情况下，增加直链淀粉的比例，增稠作用(黏度引起)和凝胶强度都增加。
淀粉的糊化、凝胶化和增稠性质极易受食品中多种其他成分影响。蔗糖会使黏度降低，能使糊化起始温度提高，还能使膨胀的淀粉更耐机械作用力，而不易被打碎。酸能使淀粉糊黏度降低，也能使淀粉凝胶强度降低。在酸热作用下，淀粉会水解为糊精，既会导致淀粉粒过早片段化，又会导致进入溶液的直链淀粉部分水解。但不论是蔗糖还是酸都会使淀粉糊更加透明。
三、实验材料与仪器（以一组实验计）
1．材料
冰若干，白糖1l0g，柠檬汁1l0mL，玉米淀粉80g，小麦淀粉40g，马铃薯淀粉40g，大米淀粉40g，绿豆淀粉40g。
2．器材
温度计1支，线扩散模具（或用切口整齐的粗玻璃管代替）2个，小玻板（10cm ×l0cm）48块，300mL塑料开水杯16个，锅2个，肉串扦2个，碗16个，500mL 刻度量筒2个。
3．基本配方
玉米淀粉169，水236mL。
四、实验步骤
1．基本操作
称料、校正温度计后把淀粉与水加入锅中，搅匀后文火加热，在不断搅动下直至沸腾，记录沸点温度，在沸腾下搅动保持lmin。将锅从火上移开，自然冷却至90℃时取20mL热溶胶液，加入线扩散模具（放于玻璃板上），然后提起模具让溶胶液自然向四周分散，直到停止扩散（或限定扩散时间为1min）。测量线扩散在东、南、西、北四个方向的扩散距离，其平均值即为线扩散值。
完成线扩散测量后，将剩余溶胶液的一部分（定量，如150mL）倒入塑料杯中，用玻板盖住杯口，然后放入冰水碗中冷却，另一部分自然冷却。当温度达到30℃时，再取20mL作线扩散实验。冰水碗内的塑料杯可在凝胶形成后取出，尽量控制使冷却时问和最终温度在各次实验中相同。用肉串扦插入杯内的凝胶中，测量凝胶高度。然后将杯中凝胶块倒在玻璃板上，再次用肉串扦测量高度，求出凝胶下陷百分比，
下陷百分比(％)=(容器内高度一容器外高度)／容器内高度×100
2．改变淀粉种类
①用16g小麦淀粉代替玉米淀粉，然后按基本配方、基本操作完成。
②用16g马铃薯淀粉，其他同①。
③用16g大米淀粉，其他同①。
④用16g绿豆淀粉，其他同①。
3．变化淀粉浓度
①用8g玉米淀粉（而不是16g玉米淀粉）、236mL水为配方，按基本操作完成。
②用8g小麦淀粉，其他同①。
③用8g马铃薯淀粉，其他同①。
④用8g大米淀粉，其他同①。
⑤用8g绿豆淀粉，其他同①。
4．添加蔗糖和柠檬汁
①在基本配方中增加25g蔗糖，其他操作不变。
②在基本配方中增加50g蔗糖，其他操作不变。
③在基本配方中用30mL柠檬汁取代相同量的水，其他操作不变。
④在基本配方中用60mL柠檬汁取代相同量的水，其他操作不变。
5．糊化温度研究
将五种淀粉分别按基本配方的量配料后，依次进行一次下列实验。配料入锅，文火加热，不断搅动，随时监测温度。当温度到达70℃、80℃、90℃、95℃、沸腾温度时立即作线扩散实验。
6．感官评价
本实验只目测所制凝胶块的透明度，以5分制评定结果。
五、实验结果
将上述实验结果记录于表2-2中。
六、注意事项
淀粉糊化时需文火加热，并需不断搅动，且随时监测温度。
参考文献
刘静波主编.食品化学与工程专业实验指导.化学工业出版社,2010.09.
实验三蛋白质功能性质的测定
（一）蛋白质的溶解性
一、实验目的
通过本实验了解蛋白质的溶解性及其影响因素。
二、实验原理
蛋白质的溶解性是蛋白质的基本物理性质之一，一种蛋白质要有较好的功能性，它必须有较好的溶解性。影响蛋白质溶解性的因素有内部因素和外部因素。内部因素有氨基酸组成、分子结构、亲/疏水性和带电性等，外部因素有温度、pH值、离子强度和离子对种类、其他食品成分等。这些因素通过影响蛋白质-蛋白质和蛋白质-水相互作用平衡来影响蛋白质的溶解性。
三、实验材料和仪器
1. 试剂
蛋清蛋白，分离大豆蛋白粉，1M盐酸，1M氢氧化钠，饱和氯化钠溶液，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵。
2. 器材
水浴锅，50ml烧杯，试管，pH试纸。
四、实验步骤
1、在20ml的试管（编号A）中加入0.5ml蛋清蛋白，加入5ml水，摇匀，观察其水溶性，有无沉淀产生。在溶液中逐滴加入饱和氯化钠溶液，摇匀，得到澄清的蛋白质的氯化钠溶液。
取上述蛋白质的氯化钠溶液3ml，加入3ml饱和的硫酸铵溶液，观察球蛋白的沉淀析出，再加入粉末硫酸铵至饱和，摇匀，观察清蛋白从溶液中析出，解释蛋清蛋白质在水中及氯化钠溶液中的溶解度以及蛋白质沉淀的原因。
2、在四个试管（编号为B、C、D、E）中各加入0.2g大豆分离蛋白粉，分别加入5ml水，5ml饱和食盐水，5ml 1M的氢氧化钠溶液，5ml，1M的盐酸溶液，摇匀，在温水浴中温热片刻，观察大豆蛋白在不同溶液中的溶解度。在第一、第二支试管中加入饱和硫酸铵溶液3ml，析出大豆球蛋白沉淀。第三、四支试管中分别用1M盐酸及1M氢氧化钠中和至pH4.5，观察沉淀的生成，解释大豆蛋白的溶解性以及pH值对大豆蛋白溶解性的影响。
五、实验结果
表1 蛋白质溶解性实验结果
（二）蛋白质的乳化性
一、实验目的
通过本实验了解蛋白质的乳化性质，以及乳化活性和乳化能力的测定方法。
二、实验原理
在食品乳化体系中，蛋白质能够降低油水界面的表面张力，从而阻止体系中油滴的聚集，提供体系的稳定性。常用乳化能力（emulsion capacity）、乳化活性指数（emulsifying activity index，EAI）和乳化稳定性指数（emulsifying stability index，ESI）来评价蛋白质的乳化性能。
乳化能力是衡量在一定的条件下，一定量的蛋白质所能乳化的油的量。乳化活性指数的理论依据是蛋白质乳化液的浊度和乳化微粒的界面面积存在线性关系，涉及蛋白质在油-水界面的吸附、扩散和定向排列。乳化稳定性与时间和乳化液微粒直径（或颗粒度）有关，粒径越小稳定性越好。
三、实验材料和仪器
试剂：大豆分离蛋白粉，pH7.0磷酸盐缓冲液，大豆油，0.1%SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。
器材：高速匀浆机，分光光度计，烧杯
四、实验步骤
1、用pH 7.0磷酸盐缓冲液配制100mL、0.5%(m/v)的蛋白悬浮液。
2、取30mL于高速匀浆机中，加入30mL大豆油，10000r/min均质1min以形成悬浊液。
3、均质后，分别在0min与10min时从底部吸取100μL分散于10mL的0.1%SDS（m/v）中，于500nm处测定吸光度值（测定三次平均值）。
五、实验计算与结果
以A0表示乳化活性（EAI），乳化稳定性（ESI）的表示方法为：
ESI(min)=
A0
×t A0—A10
式中：A0：0min时的吸光度值；t：测定乳化性的两次时间间隔，本实验取10min；A10：10分钟时的吸光度值。
（三）蛋白质的起泡性和泡沫稳定性
一、实验目的
通过本实验了解蛋白质的起泡性质和泡沫稳定性，并掌握蛋白质的起泡性和泡沫稳定性的测定方法。
二、实验原理
起泡性，也叫发泡性，是指蛋白产品搅打起泡的能力。蛋白的这一性质在食品工业中有重要的作用，如可用作蛋类代用品作发泡剂，改善烘焙食品的品质，使产品松软可口。评价蛋白质泡沫性质的方法有多种，评价指标也很多，如泡沫密度、泡沫强度、起泡平均直径和直径分布、蛋白质的发泡能力和泡沫的稳定性等。在食品工业的实际生产中，发泡能力和泡沫稳定性是应用最广的用来评价蛋白质发泡性的指标，它们的测定方法也有多种。
蛋白质是一种表面活性剂，具有表面活性和成膜性，因此一定浓度的蛋白溶液在搅打过程中会进入空气，其溶液中会产生泡沫，而且由于蛋白质能在泡沫表面形成一定有一定强度和弹性的膜，因此蛋白质能在一定程度上使泡沫稳定。
三、实验材料和仪器
试剂：2%蛋清蛋白溶液：取2g蛋清加98g蒸馏水稀释，过滤取清液；
氯化钠，酒石酸，分离大豆蛋白粉。
器材：电动搅拌器，250ml烧杯，玻璃棒，玻璃管。
四、实验步骤
1、在三个250ml的烧杯（编号A、B、C）中各加入2%的蛋清蛋白溶液100ml，一份用电动搅拌器连续搅拌2分钟；一份用玻棒不断搅打2分钟；另一份用玻管不断鼓入空气泡2分钟，观察泡沫的生成，估计泡沫的多少及泡沫稳定时间的长短。评价不同的搅打方式对蛋白质起泡性的影响。计算起泡性和泡沫稳定性。
2、取二个250ml的烧杯（编号D、E）各加入2%的蛋清蛋白溶液50ml，一份放入冷水中冷却至10℃，一份保持室温（20-25℃），同时以相同的方式搅打2分钟，观察泡沫产生的数量及泡沫稳定性有何不同。
3、取二个250ml烧杯（编号F、G）各加入2%蛋清蛋白溶液50ml，其中一份加入酒石酸0.5g，一份加入氯化钠0.1g，以相同的方式搅拌2分钟，观察泡沫产生的多少及泡沫稳定性有何不同。
4、用2%的大豆蛋白溶液进行以上的同样实验，比较蛋清蛋白与大豆蛋白的起泡性。
五、实验结果
起泡性= 泡沫体积(ml)
×100% 100(ml)
静置20分钟后，再次测量泡沫体积，为泡沫稳定性。
泡沫稳定性= 静置后泡沫体积(ml)
×100% 100(ml)
表2 蛋清蛋白实验结果
表3 大豆蛋白实验结果
（四）蛋白质的凝胶性
一、实验目的
通过本实验了解蛋白质的凝胶性。
二、实验原理
蛋白质凝胶化是指热或其他试剂使蛋白质从溶液或分散液转变成凝胶网络结构，在凝胶化过程中蛋白质分子相互作用形成一个三维网状结构。疏水作用力、静电作用力、氢键和二硫键都参与了凝胶化过程。蛋白质-蛋白质、蛋白质-溶剂（水）的相互作用和多肽链的柔性都影响蛋白质凝胶的性质。
三、实验材料和仪器
试剂：
分离大豆蛋白粉，δ-葡萄糖酸内酯，氯化钙饱和溶液，明胶。
器材：
水浴锅，天平，试管，烧杯。
四、实验步骤
1、在试管（试管A）中取1ml蛋清蛋白，加1ml水和几滴饱和食盐水至溶解澄清，放入沸水浴中，加热片刻观察凝胶的形成。
2、在100ml烧杯中加入2g大豆分离蛋白粉，40ml水，在沸水浴中加热不断搅拌均匀，稍冷，将其分成二份（烧杯A和烧杯B），一份加入5滴饱和氯化钙，另一份加入0.2g δ-葡萄糖酸内酯，放置温水浴中数分钟，观察凝胶的生成。
3、在试管（试管B）中加入0.5g明胶，5ml水，水浴中温热溶解形成粘稠溶液，冷后，观察凝胶的生成。
解释在不同情况下凝胶形成的原因。
五、实验结果
表4 蛋白质凝胶性实验结果
（五）啤酒泡持性的测定
一、实验目的
通过本实验对啤酒的泡持性及泡持性测定方法有所了解。
二、实验原理
与其他饮料不同，啤酒具有丰富的泡沫。好的泡沫表现为细腻、洁白、持久挂杯。因此，在感官上，我们通常把啤酒的泡沫性能作为衡量啤酒质量的一项重要指标。啤酒泡沫主要是由二氧化碳、起泡蛋白与异葎草酮等组成的复合体。在啤酒泡沫性能分析中，最重要的是啤酒的泡持性。
三、实验材料和仪器
材料：啤酒
仪器：秒表，泡持杯（杯内高120mm，内径60mm，壁厚2mm，无色透明玻璃），铁架台，铁环
四、实验步骤
1. 将酒样（整瓶或整听）置于（20士0.5）℃水浴中恒温30min；将泡持杯彻底清洗干净，备用。
2. 将泡持杯置于铁架台底座上，距杯口3cm处固定铁环，开启瓶盖，立即置瓶（或听）口于铁环上，沿杯中心线，以均匀流速将酒样注人杯中，直至泡沫
高度与杯口相齐时为止（满杯时间宜控制在4s-8s内）。同时按秒表开始计时。
3. 观察泡沫升起情况，记录泡沫的形态（包括色泽及细腻程度）和泡沫挂杯情况。
4. 记录泡沫从满杯至消失（露出0.05cm2酒面）的时间。
注意：试验时严禁有空气流通，测定前样品瓶应避免振摇。所得结果表示至整数。在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对值不得超过算术平均值的10%。
五、实验结果
1. 记录实验操作中观察到现象。
2. 观察泡沫升起情况，记录泡沫的形态（包括色泽及细腻程度）和泡沫挂杯
情况。
3. 记录泡沫从满杯至消失（露出0.05cm2酒面）的时间。
实验四食用油脂肪酸组成分析
一．实验目的
掌握食用油脂肪酸组成的分析原理与方法。
二．实验原理
食用油中脂肪酸碳链长度较长，在分析其中的脂肪酸组成时，一般不直接进行气相色谱分析，其原因是油脂本身的沸点很高，如果如此高温下气化，油脂会发生分解或聚合反应；游离脂肪酸的沸点比较高，如果在高温下让游离脂肪酸气化，脂肪酸会发生裂解和聚合反应；这样都会使分析结果失真。通常是将油脂与甲醇反应转化成相应的脂肪酸甲酯，脂肪酸甲酯的沸点较相应的脂肪酸的沸点低得多，更容易气化，从而提高了脂肪酸的稳定性。
三．实验材料与仪器
(1) 仪器
50mL、100mL磨口圆底烧瓶
滴管
带磨口塞的试管，10mL，3支
10mL移液管，2支
沸石
5mL或10mL移液管，1支
(2) 试剂
正己烷（色谱纯）
甲醇，分析纯
无水硫酸钠，分析纯
0.5M NaOH/甲醇溶液
BF3/甲醇溶液，12-25%（质量比）
饱和NaCl溶液
无水硫酸钠，分析纯
0.5M NaOH/甲醇溶液：11.5克钠溶于1000mL甲醇中。
精炼食用油
气相色谱仪（带火焰离子化检测器），1台
氢气发生器，1台
空气压缩机，1台
高纯度氮气，1瓶（钢瓶）
极性毛细管柱（如BPX-70, 30m×0.25mm×0.25μm），1根
色谱工作站，1套（包括电脑）
1μL进样针，1支（如有自动进样器可省去）
四．实验步骤
(一) 甲酯化处理
(1) 三氟化硼甲酯化
本方法适用于不含特殊结构脂肪酸且脂肪酸碳原子数大于等于6的油脂、酸值大于等于2 mgKOH/kg的油脂或游离脂肪酸的甲酯化。
①称取大约350mg油样放入50mL烧瓶中，移取6mL 0.5M NaOH/甲醇溶液于油样中，加入几粒沸石，连接回流装置，开始加热回流，回流过程中要不断摇动烧瓶。
②当烧瓶内的油珠消失，溶液变得透明时（大约需5-10分钟），用移液管从冷凝管上端加入7mL BF3/甲醇溶液于烧瓶中，继续回流1min。
③从冷凝器上端加入2-5mL正己烷，再回流1min。
④撤离火源，取出烧瓶，向烧瓶中加入一定量的NaCl饱和溶液，盖上塞子，轻轻上下颠倒几次，静置分层。
⑤用滴管将烧瓶内的上层液体取出，转移至磨口试管中，并加入适量无水硫酸钠以除去微量水分，得到甲酯化样品以备气相色谱分析用。
(2) 简易碱法甲酯化
本方法适用于酸值小于2 mgKOH/kg的油脂。
①取大约20-30mg油样放入10mL带磨口塞的试管中，再向试管中加入3mL 正己烷，轻摇使油样溶于正己烷中。
②向试管中加入1-2mL 0.5M NaOH/甲醇溶液，室温下摇动5min。
③向试管中加入少量无水硫酸钠，静置1h，于2000-3000rpm下离心2-3分钟，上层清夜即可用于气相色谱分析。
(二) 气相色谱分析
①先开启辅助设备，而后开启主机，待主机完成自检后再开启色谱工作站。
②设置合适的工作条件，让色谱仪在此条件下空载运行30min以上。
③进样分析。
④分析结束后，对图谱进行定性和定量分析。
五．实验数据处理
根据经验或标准样品进行定性处理；结合色谱工作站对色谱峰进行定量处理。
六．注意事项
①BF3有毒，实验应在通风厨中进行；同时，用后的玻璃仪器应立即清洗。
②BF3/甲醇溶液一般现配现用，或者置于冰箱中储藏，否则会在气相色谱分析的图谱中产生怪峰，甚至造成多部饱和脂肪酸损失。
实验五蛋白酶活力的测定方法
（一）可见光法测定蛋白酶活力
一、实验目的
掌握一种蛋白酶活力的测定原理和方法；学习一种酶活的计算方法。
二、实验原理
蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。酶活单位的定义：在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，
1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸的酶活为一个酶活力单位，以u表示。
三、实验材料和仪器
1．试剂
（1）乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶
甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000 mL。
乙液：称取乳酸钠（70%）16 g,加水溶解并定容至1000 mL.
使用溶液：取甲液8 mL,加乙液1 mL，摇匀，稀释一倍，即成0.05 mol/L 乳酸缓冲溶液。
（2）磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶
准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12H2O）6.02和磷酸二氢钠
（NaH2PO3.2H2O）0.5 g,加水定容至1000ml
（3）硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶
甲液：称取硼酸钠19.08 g，加水溶解并定容至1000 ml。
乙液：称取氢氧化钠4.0 g，加水溶解并定容至1000 ml.
使用溶液：取甲液500 mL，加乙液400mL，摇匀，用水稀释至1 L。（4）0.4mol/L碳酸钠溶液：
准确称取无水碳酸钠42.4g，以蒸馏水溶解定溶至1000ml.
（5）0.4 mol/L的三氯醋酸液：
准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000 ml
（6）0.5 mol/L的NaOH：
准确称取2 g NaOH溶解并定至100 ml
（7）10.00 mg/ml酪素溶液
称取酪素1.000 g,准确至0.001 g。用少量的0.5 mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿，加入适量的各适宜的缓冲液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的缓冲液稀释至刻，此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。
（8）100μg/ml酪氨酸标准溶液
a、准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.
b、吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.
(9)酶样的制备
准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。滤液可作为测试酶用.该酶已经稀释100倍。
2．仪器和设备
分析天平：精度0.0001 g
恒温水浴：精度±0.2℃
计时表
分光光度计
沸水浴器
振荡混合器
pH计: 精度0.01pH单位
四、实验步骤
（1）标准曲线的绘制
L-酪氨酸标准溶液按下表配制。
试管号0 1 2 3 4 5 取100 μ g/ml 酪氨溶液（ml ）0 1 2 3 4 5
蒸馏水（ml ）10 9 8 7 6 5 酪氨酸实际浓度（μ g/ml ）0 10 20 30 40 50 （2）分别取上述溶液各1.00 mL(须做平行试验)，各加0.4 mol/L碳酸钠溶液5.00 mL。福林试剂使用溶液1.00 mL，置于40+0.2℃水浴中显色20 min，取出用分光光度计于波长680 nm，比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内。
（3）样品测定：
a)先将酪素溶液放入40±0.2℃恒温水浴中，预热5 min
b)取4支试管，各加入1 mL酶液
c)取一支作为空白管，加2 mL三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入1 mL 酪素，摇匀，40℃保温10 min
d)取出试管，3支测试管中各加入2 mL三氯乙酸，空白管中加1 mL酪素。
e)静置10 min，过滤沉淀
f)各取1 mL滤液，分别加0.4 mol/L的Na2CO3 5mL、福林试剂1 mL。在40℃显色20 min。680 nm处测OD值。以空白管调零点。
注：1.398中性蛋白酶制剂和166中性蛋白酸制剂，除反应与显色温度为30℃±0.2℃外，其他操作同上，标准曲线做同样处理。
五、计算
计算酶的活力依据以下公式
蛋白酶的活力= A×K×4/10×n U/g(mL)
A：样品平行试验的平均OD值
K：吸光常数
4：反应试剂的总体积
10：酶解反应时间
n：酶液稀释总倍数
（二）紫外法测定蛋白酶活力
一、实验目的
掌握一种蛋白酶活力的测定原理和方法；学习一种酶活的计算方法。
二、实验原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：在40℃（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸的酶活为一个酶活力单位，以u表示。
三、实验材料和仪器
1．试剂
（1）三氯乙酸c（CCl3·COOH）=0.4 mol/L
称取三氯乙酸65.4 g，用水溶解并定容至1000 mL。
（2）氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5 mol/L
按GB601配制。
（3）盐酸溶液c（HCl）＝1 mol/L及0.1 mol/L
1 mol/L HＣl：取90 mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000 mL。
0.1 mol/L HＣl：取9 mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000 mL。（4）缓冲溶液
a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02 g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）
0.5 g，加水溶解并定容至1000 mL。
b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶
甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6 g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液：称取乳酸钠（70％）16 g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05 mol/L 乳酸缓冲溶液。
c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶
甲液：称取硼酸钠（硼砂）19.08 g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液：称取氢氧化钠4.0 g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液：取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000 mL。
上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。
（5）10g/L酪素溶液
称取酪素1.000 g，精确至0.001 g，用少量0.5 mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。（6）100 ug/mL－酪氨酸标准溶液
a、称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000 g，精确至0.0002 g，用1 mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL，即为1 mg/mL酪氨酸标准溶液。
b、吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1 mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。2．仪器和设备
恒温水浴40±0.2℃；紫外分光光度计（应符合GB 9721的规定）。
三、实验步骤
1．求K值
按下表配制不同浓度的L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于275 nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）, 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值;（其K值应在（130～135）范围内）。