细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)
一、消化与吹打
版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。
许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论：
1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。
2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性，无论死活的细胞都是如此，你可
以尝试，准备100%的单个细胞悬液，贴壁后观察细胞，仍然是几个几个细胞聚集在一起。一些悬浮培养细胞也是如此，容易聚集，不要去尝试过几个小时就拿出来吹打成单细胞悬液（不要笑，这个是初养悬浮细胞的人常犯的错误，以为悬浮培养就是一个一个分开）。细胞只要能从基质上脱离下来，这个时候即使是成片的（比如Calu-3细胞），吹打不超过20次后（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右），是正常的，不要试图再去延长消化时间，或者象有的同学那样吹打1h，等待单细胞悬液出现。
3，另一个帖子里提到一个比较复杂的四步消化法，这个挺有意思，我也是第一次听说，应该是网友自己发展出来的方法，很有参考价值。但我估计这个方法可能对付少数非常怪异的细胞才需要这么复杂的程序。我目前养过的近300株细胞里面，还没遇到这么怪异的。比如Caco2其实是很好消化的细胞，不需要胰酶孵育即可，只是有点成片分布。不要以为成片分布是自己没养好，这个视细胞而定。如果和标准形态不一致，那可能是自己没消化好导致的，但如果消化方法正确，仍然成片分布，甚至完全吹打成单细胞悬液，贴壁后仍然成片分布，这是细胞的特性，是因为贴壁过程中重新聚集了。这个时候你拼了命要去让它均匀分布，你的细胞之后会对你越来越不好。
4，比较难消化的细胞（润洗方法5min还不能消化），就以colon cancer为例，比如HCT15, LS411和KM12，这样的细胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100 mm dish，一次最多加入500ul，就足够了，一般我加300ul。即使这样难消化的细胞，一般不超过5min，即可见细胞成片移动，就应该停止消化。一些正常细胞也会有难消化的时候，比如tsDC细胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙状移动。
5，常规的细胞实验（增殖，凋亡，迁移，分化之类的），受消化影响不是很大，如果不用胰酶去孵育而使用润洗的方法消化的话（难消化细胞例外）。但少数实验，比如病毒包装，对细胞代数，对细胞状态
要求极高。这个时候，胰酶消化，就是润洗，都会对细胞包装病毒的能力有影响，传代次数一多，细胞包装能力就会逐渐下降（当然也有其它因素影响包装效率）。这个时候都不用胰酶消化，用一些盐溶液（不是EDTA液）即可。这些盐溶液通过影响ECM相关酶的活性，来使得细胞脱离基质附着表面，但不切割任何蛋白。
6，EDTA的作用。许多人不用胰酶，只用EDTA，或者用
trypsin/EDTA联合作用。这里要明白，trypsin切割ECM的一些负责粘连和附着的蛋白，而EDTA通过螯合Ca离子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加温和。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者对付特别难消化的细胞，添加多一些EDTA，就是这个道理。一般不要试图延长消化时间（如果10min还消化不彻底的话），而应该想其它办法。
7，PBS洗涤。消化之前用PBS洗涤，是常见的操作，因为Serum 含有抑制trypsin的蛋白。但这里面也有学问可以讲，对于一些难消化细胞，那么可以配制不含Ca，Mg离子的PBS，因为这些离子也会抑制trypsin的活性。但对于绝大部分胰酶或者EDTA溶液润洗即可消化的细胞，不需要配制如此溶液。
总结下来，虽然这个帖子是关于消化的，但其实消化并不是细胞培养的关键所在（虽然很重要），关键所在是细胞来源，血清质量和水源（自己配制溶液的话）。我看到版上许多人养细胞遇到各种各样的问题，很多时候bottleneck没有找到，虽然通过其它方法有所改善，但仍然是事倍功半。因为人们往往注意自己的操作，总觉得自己没有经验，而忽视试剂，溶液尤其是细胞的质量，后者其实才是许多细胞培养实验室常见的问题。
从最基础的地方教起，一步一步详细介绍细胞培养技术，非常好的开门教程
常用设备
准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、
高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。
必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。
无菌操作
无菌室的灭菌：
定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。
CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射
实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟
实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备：
肥皂洗手。
穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋
用75％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：
凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面
靠近酒精灯火焰操作。
器皿使用前必须过火灭菌
继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。
吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
器械的清洗和消毒
玻璃器械洗消：
一、新的玻璃器皿的洗消：
自来水刷洗，除去灰尘。
烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
高压消毒后烘干
二、旧的玻璃器皿的洗消：
刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。
烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，
以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。
金属器械洗消：
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。
橡胶和塑料：
橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：
针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。
塑料培养瓶，培养板，冻存管：
其他消毒方法：
有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时__这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC12?6H2O)2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。
注意事项：
严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。
安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。
注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。
细胞培养用液的配制与消毒
器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。
具体步骤：
一. 水的制备：
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水
二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks 液的配制)：
1.溶解定容：将药品（NaCl：8.0g，KCl：0.2g，Na2HPO4?H2O：1.56g，KH2PO4：0. 2g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
四.青、链霉素溶液的配制于消毒
1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即
每毫升各为20万单位。
3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克？
五.RPMI1640的制备与消毒：
1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。
2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。
六．血清的灭火：
细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
七.HEPES溶液：
HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N‘-a-hydroxythylpiperazine-N‘- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：
准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，
分装后4℃保存。
注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。
八.谷氨酰胺：
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml 即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
九.肝素溶液的配制：
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为℃
使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。
十. Ⅰ型胶原酶：
0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。
十一.明胶溶液：
因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配
制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中，4℃保存。
其他培养用液的配制：
20ug/ml内皮生长因子，
注意事项：
1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。
细胞传代培养（消化法）
具体操作：
一. 传代前准备：
1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。
6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
二.胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
三、吹打分散细胞：
1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。
4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
四.分装稀释细胞：
1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。
五.继续培养：
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。
传代细胞培养注意事项：
1.严格的无菌操作
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g，KCl 0.20g，KH2PO4 0.02g，葡萄糖2.00g，0.5％酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。
细胞的复苏
细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作
一. 实验前准备：
1.将水浴锅预热至37℃
2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
二．取出冻存管：
1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
三．迅速解冻：
1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
四.平衡离心：
用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min
五.制备细胞悬液：
1.吸弃上清液。
2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。
六.细胞计数：
细胞浓度以5×105/ml为宜。
七.培养细胞
将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。
初学者易犯错误：
1水浴锅未预热或者未预热到37℃。
2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
细胞计数
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
一.准备工作：
取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。
二.细胞悬液制备：
细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
三.细胞计数：
1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4) ×2×104
说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：
1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3而1ml＝1000mm3
四.细胞计数要点：
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；
2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；
4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
五.初学者易犯的错误：
1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。
2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。
六.本实验特殊试剂的配制：
4％台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。
使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4％即可。
细胞的冻存
1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。
2.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。
3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。
4.置于液氮罐中长期保存。
5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。
注意事项：
1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。
2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是―危险温区‖。
3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。
细胞培养三不要
养细胞是医学研究生的基本功。我养过骨髓MSC、心肌细胞、心肌成纤维细胞、AD293腺病毒包装细胞、PA317逆转录病毒包装细胞。养得最多的是MSC。有三个小经验和大家分享一下：
1. 不要烧瓶口。大多数人都喜欢在酒精灯的火焰上关瓶子，觉得这样可以避免污染。不知道大家是不是有培养基怎么越用越发紫的困惑？知道为什么吗？烧瓶口烧的。培养基一般都是用碳酸/碳酸氢跟作缓冲体系。瓶口在火焰上的时候，炽热的空气进入瓶内。塞紧塞子放入冰箱后，空气变冷，压力骤降，培养基中的碳酸就会转化成二氧化碳，
释放出来。培养基中的碳酸少了，当然会变碱。如果不烧瓶口的话，你会发现培养液变碱的速度会大大减慢。（当然多多少少还是会有一点越用越碱，因为室温还是比冰箱内的温度高）
其实烧瓶口防止污染纯粹是心理安慰。不妨试一下把手指在火上晃几下，你会发现根本就不会烧疼。如果有细菌的话，这么晃两下也烧不死多少。要想烧死全部细菌，除非把瓶口和塞子烧红。我在国内从来就不烧瓶口。来美国以后发现这里更彻底，超净台内根本就不点酒精灯。
2. 不要频繁看细胞。对于初学者而言，养细胞就像养孩子一样，有空就要去看看。细胞越是养不好，就越是经常去看。实际上看细胞对细胞的生长没有任何好处，特别是对原代细胞或是免疫磁珠分选后，密度特别低的细胞。培养基中的生长因子是非常有限的。细胞好不容易自分泌一点儿促生长的因子在其周围，形成有利于生长的局部环境。你跑去看细胞，培养瓶这么一晃，把因子都给晃散了。经常可以看到新手一天到晚都在看细胞，细胞老是长不好。老手细胞一扔好几天不管，细胞疯长。
3. 不要怕消化。在传代的时候，初学者往往生怕细胞消化过度，早早地终止消化。细胞没下来就使劲吹灯，吹得满瓶子都是气泡。在我看来，用力吹打对细胞的损伤比消化更大。我师兄在做血管平滑肌原代的时候，37度消化过夜，细胞也没事。我一般是等细胞完全变圆后才中止消化。细胞轻轻一晃就能下来。还有，动作要轻柔，尽量不要产生气泡。气泡在破裂时的机械应力相当大，对细胞的伤害也是很大的。
原代培养技术
一、组织块直接培养法
1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
2、用手术剪将组织剪切成1mm3左右的小块，再用Hank's液洗三次。
3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。
4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在37℃恒温箱内培养。
5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。二、消化培养法
1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
2、用手术剪将组织剪切成1mm3左右的小块，再用Hank's液洗三次。
3、视组织块量加入酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
4、加入3—5ml培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。
5、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
6、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
7、加入Hank's液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
8、加入培养液1—2ml（视细胞量），血球计数板计数。
9、将细胞转移到培养瓶中，37℃下培养。
三、器官培养
1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔径滤膜。
2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。
3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2。
4、将上述准备好的培养物放入CO2培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到90%。
5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。
6、上述可进行器官培养1-3周，每2-3天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。
胚胎干细胞培养：从技巧走向科技
实验室培养人类胚胎干细胞是个不小的壮举，培养的讲究，易溶细胞劳动密集型，在一定程度上与其说是精密科学不如说是技巧。
然而，现在，威斯康星大学麦迪逊分校（the University of Wisconsin-Madison）一研究小组报告，研制了一个完全确定的培养体系，为细胞治疗提供更均一更安全产品
The journal Nature Methods Nov.14上报道，该小组由Laura Kiessling领导，一位威斯康星大学麦迪逊分校化学教授，介绍了一种廉价的、能（适应）所有细胞的（培养）系统，从而免受培养（操作过程中）的不确定性工作（或因素的影响）。
―这是一项很简单的技术，任何人都能使用‖ Kiessling说。
目前，人类胚胎干细胞培养的大多是用于研究，然而，随着时间推移培养系统会改进，科学家们仍用鼠源细胞及蛋白的支持干细胞生长的―表面‖培养人类细胞，诱导胚胎干细胞。如此会增加病原体，如病毒，如果培养的干细胞用于人体治疗，这是一个严肃的问题（涉及生物安全）。
新的培养系统利用一种人工合成的化学方法制成蛋白片段及多肽基质，对干细胞有亲和作用。结合界定的培养基，由威斯康星团队设计的培养系统可以让细胞处在未分化状态保持3个月或更长。根据新的报告，该系统也适用于诱导多能干细胞，成人细胞经过遗传学重编类似于胚胎干细胞。
Kiessling表示，在该系统，细胞经常被检测是否分化为所需的细胞类型，在一定时间内与市售有效的细胞培养系统对比看是否达到一致。
Kiessling表示，首个人类胚胎干细胞临床试验在进行中，正在启动人类患者更多试验，相信在安全性问题上是至高至上的。
Kiessling解释，目前通常使用的培养系统是不确定性，并没有真正
知道细胞是否接触，且无均一性，代与代之间是否存在变异。而我们研发的系统是确定的并且是廉价的。
Kiessling的研究小组的工作得到了美国国立卫生研究院和威斯康星材料科学与工程研究中心大学的支持。
细胞培养中的污染分为两类，化学污染和生物污染。
化学污染
化学污染是一些对细胞有毒性的或对细胞产生刺激的化学物质。这些污染一般来自于没有洗净的器皿、不纯的化学试剂和质量较差的蒸馏水等。
化学污染中比较引人注意的是细菌内毒素。它是革兰氏阴性细菌细胞死亡后解体释放出的疏水性的细胞壁组成物质，对塑料等疏水性强的物质有很强的吸附能力。细菌内毒素可刺激部分细胞产生一些激素或细胞因子，对细胞生长和实验结果产生影响。细菌内毒素是临床上的最主要的热原（即注射到动物体内会导致动物发热），所以通过细胞培养生产的疫苗、细胞因子等用在临床上的药品的生产过程中更是要避免细菌内毒素的污染。
生物污染
生物污染包括比较容易发现的细菌、霉菌和酵母的污染，和较难发现的病毒、支原体和其他细胞的污染。
细菌、霉菌和酵母到处存在，它们能在合适的环境中非常快速的生长。这些污染比较容易观察到，它们往往会使其污染的培养液产生可见的变化，或者通过显微镜观察就可以看见。
由于病毒有种属特异性，所以病毒污染的概率比较小。但是病毒污染难于发现，因为病毒颗粒特别微小，一般的实验室都没能力检查细胞培养中污染的病毒。由于病毒一般潜伏在细胞内，对整个细胞培养不是致死的，所以它可能会使研究人员长期得到受病毒影响的细胞的实验结果。
大规模细胞培养技术
大规模细胞培养技术简介 大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。 所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70 年代以来，细胞培养用生物
3D细胞培养行业研究分析报告
3D细胞培养 2021-2026年中国3D细胞培养行业投资前景咨询报告 【报告编号】CB16688 3D细胞培养行业专项报告,包括3D细胞培养行业发展趋势,3D细胞培养前景预测,3D细胞培养市场规模,3D细胞培养全球,3D细胞培养品牌,3D细胞培养细分,3D细胞培养产业链,3D细胞培养政策,3D细胞培养机遇和挑战,3D细胞培养竞争格局,3D细胞培养重点企业,3D细胞培养集中度,全球3D细胞培养,3D细胞培养价格,3D细胞培养进出口,3D细胞培养区域结构等 第一章宏观经济环境分析 第一节全球宏观经济分析 一、2016-2020年全球宏观经济运行概况 二、2021-2026年全球宏观经济趋势预测 第二节中国宏观经济环境分析 一、2016-2020年中国宏观经济运行概况 二、2021-2026年中国宏观经济趋势预测 第三节3D细胞培养行业社会环境分析 第四节3D细胞培养行业政治法律环境分析 一、行业管理体制分析 二、行业相关发展规划 三、主要产业政策解读 第五节3D细胞培养行业技术环境分析 一、技术发展水平分析
二、技术革新趋势分析 第二章国际3D细胞培养行业发展分析 第一节国际3D细胞培养行业发展现状分析 一、国际3D细胞培养行业发展概况 二、主要国家3D细胞培养行业的经济效益分析 三、2021-2026年国际3D细胞培养行业的发展趋势分析 第二节主要国家及地区3D细胞培养行业发展状况及经验借鉴 一、美国3D细胞培养行业发展分析 1、2016-2020年行业规模情况 2、2021-2026年行业前景展望 二、欧洲3D细胞培养行业发展分析 1、2016-2020年行业规模情况 2、2021-2026年行业前景展望 三、日韩3D细胞培养行业发展分析 1、2016-2020年行业规模情况 2、2021-2026年行业前景展望 四、2016-2020年其他国家及地区3D细胞培养行业发展分析 五、国外3D细胞培养行业发展经验总结 第三章2016-2020年中国3D细胞培养市场供需分析 第一节2016-2020年3D细胞培养产能分析 一、2016-2020年中国3D细胞培养产能及增长率
细胞培养技术个人总结
总结---细胞培养 一．基本理论概论 原代培养: 也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。 传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 细胞系：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。(如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。) 细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。 培养类型：细胞培养，组织培养，器官培养。 细胞生长的方式：贴附生长，悬浮生长 培养细胞的形态（形态不一定，环境改变形态可能改变）：成纤维性型细胞，上皮型细胞（单层膜样生长），游走性细胞（游散生长，常有伪足跟突起） 二．培养过程及要点（切记无菌操作） （一）工作环境的处理 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： CO2 钢瓶之CO2 压力。CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 （二）试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌 清洗： （1）玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置） 浸泡—刷洗—浸酸—冲洗 （2）胶塞的清洗 刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用 （3）塑料制品的清洗 2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。
生化,分子,细胞试验汇总
主要培养基的配制 LB液体培养基 胰蛋白胨10 g，酵母浸出物 5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 ml，用 1 mol/L HCl 调节pH 至7.4，121℃高压灭菌20 min。如果需要加抗生素，则待灭过菌的培养基温度降到55℃以下后加入适量的抗生素储存液。 LB 固体培养基 在LB液体培养基中加入2%琼脂。 DMEM细胞培养基 DMEM溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v)，青霉素100U/ml，链霉素100 μg/ml McCoy’s 5A细胞培养基 McCoy’s 5A溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v),青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml
实验试剂及药品的配制 1 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 在800 ml的双蒸水中溶解Tris(三羟甲基氨基甲烷)121.1 g，用浓盐酸调pH 至8.0，用双蒸水定容至1000 ml。121℃高压灭菌15 min，备用。 TE 缓冲液(pH8.0) 1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)10 ml和500 mmol/L EDTA(pH8.0)溶液 2 ml，用双蒸水定容至1000 ml。121℃高压灭菌15 min，备用。 500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0) 在800 mL 的双蒸水中加入18.6 g 乙二铵四乙酸二钠，充分溶解后，用10 mol/L NaOH 溶液调pH 至8.0，用双蒸水定容到1000 ml。121℃高压灭菌15 min，备用。 溴化乙锭(EB) 1 g EB，加入100 ml 灭菌双蒸水中，磁力搅拌数h以确保其完全溶解，然后转入棕色瓶中，4℃保存。 TAE 电泳缓冲液(50×) 242 g Tris碱，57 ml冰乙酸，100 ml 0.5M EDTA，加灭菌去离子水定容至1000 ml，使用时稀释50倍。 10% SDS 将10 g高纯度的SDS置于烧杯中，加入约80 ml的ddH2O，68℃加热溶解，滴加盐酸调节pH值至7.2，定容至100 ml后，室温保存。 G418 (Neomycin) 用PBS (pH 7.4) 配成浓度为50 mg/ml的原液，0.22 m滤膜过滤除菌，分装储于-20℃备用。
细胞培养常见问题及其解决
细胞培养常见问题及其解决 1. 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。 2. 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。 7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？ HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles 液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 8. 细胞之接种密度为何？
细胞培养技术原理及应用
细胞培养技术原理及应用研究进展 姓名：赵鹏学号：158033038 专业：流行病与卫生统计学 摘要：细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。 关键词：细胞培养；应用；研究进展 细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代谢体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体内环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体内等同的结论。 动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法[1 ]。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。20 世纪60 年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法[2 ]。 1 细胞培养 细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。细胞培养开始于1906 年，Harrison 用蛙新鲜淋巴液培养蛙胚神经组织4 周，首次成功地利用体外培养液培养神经元，标志着组织细胞的体外培养模式的基本建立。随着细胞培养技术的不断发展和完善，20 世纪50 年代进入繁盛阶段，细胞培养逐渐被基础研究与应用领域所应用，特别是在医学领域得到迅速的发展。目前，细胞培养技术已经涉及到生物学、农业、环境保护等领域[ 3 ]。 目前，在细胞培养过程中，只能根据离体细胞的特点和培养条件，提供满足其生长和发育的一些基本生理条件。必须在无菌条件下进行，细胞感染微生物后，会因被夺营养物质而导致细胞生长缓慢或停滞，甚至死亡。需要提供适宜的温度和pH，一般哺乳动物细胞培养的温度控制在37 ℃，鱼类的温度要低一些。温度过高或过低时，均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。动物细胞最适宜pH一般控制在7.2~7.4，在此范围细胞生长活跃，增殖速度快，如果过低或过高性，细胞会因为细胞膜受损而死亡。细胞离体培养技术的关键是细胞培养液的设计，理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质的全部需要。细胞培养液中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质。如提供能量的物质（N源、C源）、代谢调节控制的物质（无机盐、维生素、激素）。另外，在细胞培养过程中需要提供一定量的气体（O2和CO2）。CO2具有调节pH和缓冲的作用，一般提供5% CO2。
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养
干细胞培养基行业进出口分析报告
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干细胞培养基行业进出口分析 (最新版报告请登陆我司官方网站联系) 公司网址: https://www.360docs.net/doc/4a12036999.html, 1
目录 干细胞培养基行业进出口分析 (3) 第一节2015年出口分析 (3) 一、我国干细胞培养基行业出口总量及增长情况 (3) 二、干细胞培养基行业经营海外市场的主要品牌 (3) 三、国内外经济形式对干细胞培养基行业出口的影响 (3) 第二节2015年进口分析 (4) 一、我国干细胞培养基行业进口总量及增长情况 (4) 二、进口品牌对干细胞培养基行业的促进与影响 (4) 三、国内外经济形式对干细胞培养基行业进口的影响 (4) 第三节进出口政策 (5) 一、贸易政策 (5) 一、对外贸易经营者在中国必须是经国务院对外经济贸易主管部门许可的企业，主要有以下几种： (5) 二、关于出口退税 (6) （2）出口退税附送材料 (7) 二、倾销与反倾销 (8) （1）产品以低于正常价值或公平价值的价格销售； (8) 1、销售鲜活商品 (9) 2、处理有效期限即将届满的商品或者其他积压的商品 (9) 3、季节性降价 (9) 4、因清偿债务、转产、歇业降价销售商品 (9) 三、区域或本土保护政策 (16) 四、贸易壁垒 (16) 2
干细胞培养基行业进出口分析 第一节2015年出口分析 一、我国干细胞培养基行业出口总量及增长情况 图表 1 2014-2016年3月我国干细胞培养基行业出口分析 数据来源：海关总署二、干细胞培养基行业经营海外市场的主要品牌 目前国内市场上出现的国外品牌干细胞培养基主要有：美国英杰、SAFC Bio、Hyclone等。 三、国内外经济形式对干细胞培养基行业出口的影响 全球金融危机以来,我国出台了密集的扩大消费政策,但是这些政策主要针对的是“常规消费”。随着我国经济逐步走出金融危机的阴影,制约“常规消费”的瓶颈将得到缓解,只需要保持消费政策的连续性,“常规消费”就会保持平稳较快增长。但是由于灾害频发、行政垄断、进口限制和政策缺失等原因,“非常消费”问题在后危机时代显得尤为突出。因此,建议鼓励开发防灾应急商品, 3
细胞培养常见问题及解答课稿
细胞培养常见问题及解答 1、如何选用培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基（SFM）。 2、为什么要热灭活血清？ 加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。 3、L－谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L－谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L－谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L－谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L－谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 4、GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α－氨基用L－丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L－谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L－谷氨酰胺几乎完全降解。 5、为什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 6、如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200－2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。 7、如何消除组织培养的污染？
细胞培养时存在的生物安全问题简析
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/4a12036999.html, 细胞培养时存在的生物安全问题简析 作者：胡燕玲高习文 来源：《现代畜牧科技》2018年第07期 摘要：动物细胞培养技术在生物技术和生物医药的相关研究领域中的应用非常广泛。随着动物细胞培养在各个领域应用的内涵逐渐的深入，随之也产生了相应的生物安全问题，也就是生产中常说的生物健康和环境因素之间的风险性问题，而且此问题已经受到相关领域专业人士的广泛关注。现主要分析动物细胞培养过程中存在的生物安全问题，并且针对具体的问题及其风险进行评估，以及更深入的探讨和研究，以期为生物健康和环保提供更加可靠的理论基础和相关的技术支持。 关键词：动物细胞培养；生物安全；危险评估 中图分类号：R446.11+3 文献标识码：B 文章编号：2095-9737（2018）07-0018-01 1 概述 目前，通常是通过动物细胞进行培养，以作为培养基质提供给病毒疫苗的生产所用，此外，许多生物药品的生产过程中也不能缺少动物细胞的培养。随着动物细胞培养的不断深入应用，相应的生物安全问题随机出现，愈来愈受到关注。然而，实际生产中如果想将风险在最大程度上加以控制，就需要采取比较全面的风险评估再进行确定，还要考虑细胞培养操作的类型以及细胞培养潜在的生物危害等情况。 2 动物细胞培养过程中存在的生物安全问题 2.1 细胞培养的特点 实际生产中针对动物细胞培养过程的风险进行评估时，必须考虑的因素就是细胞培养的本质特征，主要体现在物种来源、细胞或组织类型以及培养类型三个不同的方面。 2.2 遗传修饰获得的特征 实际生产中，在实验室遗传修饰获得的重组细胞与其非重组类似物相比较，通常对生物健康和环境破坏的能力要更强一些。所以在实际评估动物细胞培养风险时，还必须确定重组细胞获得的遗传修饰特征，将其对评估的影响考虑在内。
细胞培养基本操作技能
细胞培养基本操作技能 无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 实验用品 1. 种类︰ 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透 明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗︰ 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌︰ 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于
2019年高考生物真题集锦【专题30】克隆技术(含答案)
专题30 克隆技术 1．(2018·高考江苏卷)某种极具观赏价值的兰科珍稀花卉很难获得成熟种子。为尽快推广种植，可应用多种技术获得大量优质苗，下列技术中不． 能选用的是( ) A ．利用茎段扦插诱导生根技术快速育苗 B ．采用花粉粒组织培养获得单倍体苗 C ．采集幼芽嫁接到合适的其他种类植物体上 D ．采用幼叶、茎尖等部位的组织进行组织培养 解析：选B 。利用扦插、嫁接、植物组织培养的方法能快速繁殖种苗，且能够保持亲本的优良性状；花粉粒离体培养可获得单倍体幼苗，其性状可能与亲本不一样。 2．(2018·高考重庆卷)某兴趣小组拟用组织培养繁殖一种名贵花卉，其技术路线为“取材→消毒→愈伤组织培养→出芽→生根→移栽”。下列有关叙述，错误的是( ) A ．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害 B ．在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞 C ．出芽是细胞再分化的的结果，受基因选择性表达的调控 D ．生根时，培养基通常应含α -萘乙酸等生长素类调节剂 解析：选B 。消毒主要是为了杀死材料表面的微生物，同时要注意减少消毒剂对植物细胞的伤害，A 项正确；植物细胞融合前必须先去除细胞壁才能诱导融合，直接在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，不能得到融合细胞，B 项错误；出芽从细胞水平上看，是细胞分化的结果，从分子水平上看，是基因选择性表达的结果，C 项正确；生长素类调节剂可促进愈伤组织生根，因此生根时，培养基中应含有生长素类调节剂，D 项正确。 3．(2018·高考浙江卷)实验小鼠皮肤细胞培养(非克隆培养)的基本过程如图所示。下列叙述错误的是 ( ) 实验小鼠――→甲皮肤组织――→乙皮肤细胞――→丙培养细胞1――→丁培养细胞2 A ．甲过程需要对实验小鼠进行消毒 B ．乙过程对皮肤组织可用胰蛋白酶消化 C ．丙过程得到的细胞大多具有异倍体核型 D ．丁过程得到的细胞具有异质性 解析：选C 。分析图示技术流程，结合动物细胞培养的基础知识作答。甲过程表示从实验小鼠身上取皮肤组织小块，该过程需要对小鼠进行消毒，故A 项正确。乙过程表示将皮肤组织分散为单个细胞，可用胰蛋白酶进行酶解消化，故B 项正确。丙过程表示由组织细胞培养到细胞系的过程，小鼠细胞是二倍体细胞，其细胞系大多数为有限细胞系，能继续培养下去具有异倍体核型的连续细胞系很少，故C 项错误。丁过程表示通过选择或纯化从细胞系中获得具有特殊性质的细胞株的过程，细胞株具有异质性，故D 项正确。 4．(2018·高考重庆卷)下图是单克隆抗体制备流程的简明示意图。下列有关叙述，正确的是( ) A ．①是从已免疫的小鼠脾脏中获得的效应T 淋巴细胞 B ．②中使用胰蛋白酶有利于杂交瘤细胞的形成 C ．③同时具有脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞的特性 D ．④是经筛选培养获得的能分泌特异性抗体的细胞群 解析：选D 。①是从小鼠脾脏中获得的能产生抗体的浆细胞，A 项错误；②中应该使用能
细胞培养各种培养基简介
DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识 培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 一、基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM 含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。 二、血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些 痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞
细胞培养技术
细胞培养技术 指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。 定义 培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。 在现代医学和生物科学研究中应用广泛 优点 1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究. 2.直接观察细胞的变化可便于摄影。 3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。 6.易于施用物理、化学生物的实验研究。 7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。 8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。 缺点 组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。 细胞类型 细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为: 贴附型悬浮型（一）贴附型 细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。 贴附型细胞的分型 1.成纤维型细胞：(fibroblast) 来自中胚层 特点：与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。 起源：细胞来自中胚层间充质组织。 除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。
细胞培养技术考题整理
1.为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩， 细胞核血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。（在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。） 2.谷氨酰胺在细胞培养中起什么作用及使用方法？作用：几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求， 细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。使用方法：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃保存，临用前加入培养液。配 制方法：谷氨酰胺溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分 装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 3.如何用台盼兰计数活细胞？正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。台盼蓝染色后，通过 显微镜下直接计数或显微镜下拍照后计数，就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。（用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升，在毫升的细胞中加入毫升的％的台盼兰溶液。轻轻混匀， 数分钟后，用血球计数板计数细胞。） 4.如何消除组织培养的污染？确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔 离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。（一）认真做好外植体的选择和消毒工作，防止外植体带菌。（二）改善接种室和培养室的环境条件，保证接种与培养环境清洁无菌。（三）操作人员严格遵守无菌操作规程。（四）培养基及接种工器具要严格灭菌，确保灭菌质量。（五）在培养基中加入适量的抗生素。（六）利用病毒在植株体内分布不均匀的原理，生产脱毒苗。（七）利用培养基中高盐或高糖的浓度，抑制微生物的生长。（八）减少培养基中的某些有机成分， 可抑制微生物的生长繁殖。 5.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 6.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀？胎牛血清没有预老化，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。由 –20℃至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。推荐在－20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。 7.二价离子会抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的？二价离子能够抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。在胰蛋白酶处理细胞 前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 8. 液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？液体培养基冷冻后再经融化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往会变碱，某些成分溶解也会受到影响，对细胞生长不利，故培养液一定要存放在冷 藏条件下。 9.培养用液pH对细胞生长的影响？由于大多数细胞适宜pH为，偏离此范围可能对细胞生长产生有害的影响。但各种细胞对pH的要求不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受能力强。但总的来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。 法的原理？又称细胞增殖检测活细胞线粒体中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物 甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定甲臢染料的吸光值，可间接的反应活细胞数量。 细胞培养实验室的基本设备有哪些常用的基本设备：1、仪器：显微镜、培养箱、干燥箱、水纯化
细胞培养技术发展史及培养条件 黄璐
学号：20095071126 系（院）生命科学学院 专业生物科学专业 年级 2009 级 姓名黄璐 论文（设计）题目细胞培养技术的发展史及培养条件 指导教师卢东升职称教授 2011 年 5 月16 日
目录 摘要 (2) Abstract (2) 0引言 (3) 1细胞培养技术发展史 (3) 2细胞培养的条件 (4) 2.1 细胞培养的一般条件 (4) 2.1.1温度 (4) 2.1.2 pH (4) 2.1.3 渗透压 (4) 2.1.4 营养物 (4) 2.1.5 水 (5) 2.1.6 无菌条件 (5) 2.1.7 光 (5) 2.1.8 气体 (5) 2.2动物细胞培养的特殊条件 (5) 2.2.1 血清 (6) 2.2.2 支持物 (6) 2.2.3 气体交换 (6) 2.3植物细胞培养的特殊条件 (6) 2.3.1 光照 (6) 2.3.2 激素 (6) 2.4微生物细胞培养的特殊条件 (6) 3小结 (7) 参考文献 (7)
细胞培养技术的发展史及培养条件 学生姓名：黄璐学号：20095071126 生命科学学院生物科学专业 指导教师：卢东升职称：教授 摘要：19世纪英国生理学家Sydney Ringer研制出可维持离体动物心脏跳动的盐溶液，1885年德国人Roux用温生理盐水在体外培养鸡胚组织并存活数月，从而开始了组织培养。1907-1912年，人们创建了悬滴培养法，由此建立了体外培养组织。从50年代起，细胞培养进入了迅速发展的阶段并渗透到其他学科中，目前细胞培养技术已广泛用于生物学和医学研究的各个领域。细胞的生长需要一定的营养环境，细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。因此离体的细胞培养需要在温度、pH、营养物、无菌环境、气体等方面进行设置。而动植物细胞和微生物细胞的培养均有其自身的特殊培养条件。关键词：组织培养；细胞培养；细胞生长；培养条件 Abstract:The 19th century British physiologist Sydney Ringer developed from the body can maintain the salt solution animal the beating of the heart, in 1885 German Roux with warm saline the in vitro culture of chicken embryos organization and live for months, and thus began the tissue culture. 1907 - 1912, people created suspended drops culture method, creating the in vitro organization. From the 1950s on, cell culture into the rapid development stage and spread to other disciplines, currently cell culture technology has widely used in biology and medicine for different areas of study. Cell growth need certain nutrients environment, cell culture refers to remove cells from body organization in the presence of the environment, echoing the ph and sterile, proper temperature conditions, with certain nutrients that period, and maintain its to grow the structure and function of a culture technology. So the cells from the body in need of cultivation temperature, ph, nutrients, sterile environment, gas, etc Settings. But animals and plants cells and microbial cells cultured in all has its own special cultivation condition.