浅谈愈伤组织的应用
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浅谈愈伤组织的应用
院（系）： xxxxxxxxxxx学院
专业： xxxx专业
班级：20xxxxxxxx班
学生姓名：懒猫学号: 20xxxxxx
浅谈愈伤组织的应用
懒猫
（学校班级）, （省市邮编）
摘要：愈伤组织主要是依靠植物细胞的全能性，运用愈伤组织培养，而得到我们需要的东西。而本次，我们主要是浅谈愈伤组织的在各个方面的应用。
关键词：愈伤组织应用发展前景
1愈伤组织的基本概念
1.1愈伤组织的基本定义及原理
愈伤组织是指在一定条件下从外植体的切口（伤口）部位生成的无特定结构和功能的薄壁细胞团。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。愈伤组织的形成原理主要是植物细胞的全能性。
1.2愈伤组织的诱导和形成
愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的无特定结构的组织。经一段时间的生长和增殖以后，在其内部出现一定程度的分化，产生出一些具有分生组织结构的细胞团、色素细胞或管状分子。
植物外植体在培养基和外界环境的作用下，经过一个复杂的过程形成愈伤组织，即：
外植体＋培养基＋环境愈伤组织
植物细胞形成愈伤组织大致经历三个时期：诱导期、分裂期、分化期。即脱分化恢复分裂，持续分裂增生和进一步再分化形成植株。（见图1.1）。
愈伤组织形成
诱导期
分裂期
分化期
改变原来的分化方向和代谢方式，
合成代谢加强，合成大量蛋白质和
核酸物质，为细胞的分裂和增殖奠
定基础
外植体外层细胞开始分裂，细胞脱
分化，愈伤组织结构疏松，缺少组
织结构，颜色浅而透明
愈伤组织表层细胞分裂逐渐停止，
转向内部的局部地区，并改变分裂
面的方向，出现瘤状结构外表，愈
伤组织中可以发现维管组织，但不
形成维管系统
图1.1 愈伤组织的形成特点
1.2.1诱导期
愈伤组织诱导期又称启动期，是指外植体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂方向和代谢方式，合成代谢活动加强，大量合成蛋白质和核酸物质，为细胞分裂做准备。
诱导期的长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因素而异，即使是同一种物种不同基因型同一外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），而有的植物诱导期需要数天（胡萝卜）。刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h，但经贮藏5个月后，诱导期延长为2天。
2，4-D对于细胞中RNA的转录合成有明显的促进作用，常被用于愈伤组织的诱导。诱导期中细胞生理指标的变化有：（1）.氧气吸收的迅速增加，（2）.RNA 含量的增加，（3）.蛋白质的周期性增加，（4）.代谢相关酶类的增加。
1.2.2分裂期
分裂期是指细胞通过分裂不断增生子细胞的过程。
主要表现如下：
（1）细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。
（2）每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。
（3）细胞体积小，内无液泡，如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。
（4）细胞的核和核仁增大到最大。
（5）细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。
（6）随着细胞不断分裂和生长，细胞的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。
分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。
来源于不同植物或同一种植物不同部位的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异。但优良的愈伤组织必备以下4个特性中的2-3个。
（1）高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物。
（2）容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。
（3）旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。
（4）经过长期继代保存而不丧失胚性，便有可能对它们进行各种遗传操作。
1.2.3分化期
愈伤组织分化期，是指停止分裂的细胞发生生理生化代谢变化，形成由不同形态和功能细胞组成的愈伤组织。分化期细胞体积不再减少，最明显的特征是生
长着的愈伤组织细胞的平均大小突然不再减少，而保持相对稳定。
其分化期特点如下：
（1）细胞分裂部位和方向发生改变：由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂。
（2）形成瘤状或片状的拟分生组织，称做分生组织结节。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节。
（3）细胞的体积相对稳定，不再减少。
（4）出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。
（5）生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。
愈伤组织分化期，是指停止分裂的细胞发生生理生化代谢变化，形成由不同形态和功能细胞组成的愈伤组织。分化期细胞体积不再减少，最明显的特征是生长着的愈伤组织细胞的平均大小突然不再减少，而保持相对稳定。[1]
2愈伤组织的应用
在离体培养中，接受各种因素的作用，细胞都会分裂进入脱分化，经持续分裂增生成细胞团，进一步发展成为不受亲本植株影响的愈伤组织。愈伤组织培养作为一种最常培养形式，除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其他几种培养形式最终都要愈伤组织才能产生再生植株，而且，愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的。因此，愈伤组织培养具有多种用途。一方面可研究植物生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对植物遗传育种具有特殊意义；另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体培养中的原生质体来源等。实践证明，愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良，种质保存和有用化合物生产的理想途径。
2.1加快了园艺植物新品种和良种繁育速度，迅速高效低成本
加快了园艺植物新品种和良种繁育速度，特别是对于无性繁殖的果树，观赏树木等植物。良种繁育可以是在新选育品种的基础上进行，也可以理解为选种的继续，是新品种产生后到大量推广到生产中去的重要环节。如果没有良种繁育，所选育出的新品种也无法在生产上发挥作用，而良种有必须用正确合适的方法来繁育。这对园艺植物的生产具有重要的作用。
2.2培育无病毒苗木
培育无病毒苗木，避免了无性生殖的植物受到病原侵染后品种退化甚至死亡的现象。目前世界各国受病害的植物很多，植物病毒已超过500多种。消除无性
繁殖植物体上的病原菌，尤其是病毒，可使许多作物大幅度增产。无病毒植物材料生长较为整齐一致，并且寿命大为延长。无病材料使国际间传递方便了。
在我们的果树生产中，运用愈伤组织结合嫁接、扦插、环剥等技术，获得无病毒的优良果树。[2]
2.3获得倍性不同的植株，易染色体核内加倍育种有利用价值
获得倍性不同的植株，这对于无性繁殖园艺植物的育种，具有较大的利用价值，因为愈伤组织过程中易发生染色体的核内加倍。在《不同染色体倍性水稻植株光合特性的研究》中，以花培获得的粳稻０２４２８单倍体，二倍体和四倍体植株为材料，测定了光合作用有关的若干性状。气孔大小、比叶重随染色体倍性的增加而递增；而单位面积的气孔数则呈递减的趋势。[3]
2.4克服远缘杂交的困难
通过愈伤组织克服远缘杂交，为培育新品种提供了技术保证。
2.5利于种质资源长期保存和远距离运输
运用组织培养保存种质资源，具有节约土地，节省人力、物力，手续简便，利于长距离运输，而且不致受病虫侵袭，便于交流的优点。
2.6提供育种中间材料
通过组织培养可获得不同性质的愈伤组织，可为原生质分离，融合或遗传转化提供优质材料。结合从事小麦育种工作多年的经验体会，小麦育种须走育种先育材料的路子，没有突破性的中间育种材料，就不可能选育出有突破性的新品种。现阶段小麦育种工作中改良创新中间育种材料的是很重要的。[4]
2.7诱发和离体筛选突变体，并从中获得有益的突变体
根腐病是小麦的主要病害之一，一般引起减产10一15%，有时高达30写,迄今尚无有效的防治方法。抗病育种被认为是一种有效的防治途径。电离辐射可以引起生物的广泛变异，国内外利用辐射以及辐射与其它因子结合的方法选出了许多新品种，在生产上发挥了重大作用。[5]茄子黄萎病是茄子三大病害之一，因缺乏黄萎病抗性强、农艺性状优良的育种材料[2]，使生产上所用的品种对茄子黄萎病的抗性不理想。因此，创造新的抗病材料，为育种奠定坚实的基础，是当前我国茄子育种工作的重点和难点[3]。在茄子抗病材料的创新上，以往多采取驯化野生材料和常规杂交转育抗性基因[4]，而采用离体诱变筛选技术，国内目前尚无成功的报道。[6]
2.8制造人工种子
为某些濒临灭绝或珍贵的物种的繁殖，提供高效的技术。例如：研究白术人工种子最佳胚乳配方,为白术人工种子技术规模化开发应用提供理论依据。以组织培养为基础的白术人工种子快速繁殖技术具有一定的优越性。[7]
参考文献
[1]殷红.细胞工程.北京：化学工业出版社，2006.7.
[2]作者.关于果树嫁接方法及愈伤组织生产应用问题的探讨.企业库，
https://www.360docs.net/doc/4c9936124.html,/xinwen/1306510.html.2010-7-11.
[3]傅亚萍，颜红岚.不同染色体倍性水稻植株光合特性的研究.中国水稻科学，1999年第3期.
[4]周吉红，李彰明，吴绍宇，黄寰.小麦育种中中间育种材料的改良与创新.植物遗传资源学报，2003年01期.
[5]孙光祖，陈义纯，张月学，王广金，唐凤兰，阎文义，李忠杰，张景春，朱秀廷，卢海涛.抗根腐病小麦突变体的诱发和离体筛选体系的研究.黑龙江农业科学，1991年06期. [6]刘君绍，田时炳，皮伟，陈亦康，罗章勇，王永清.茄子抗黄萎病突变体离体筛选Ⅱ.突变体筛选.西南农业学报，2003年第04期.
[7]汪福源，唐宁，贲爱玲.白术人工种子制作技术研究.安徽农业科学，2012年第2期.
愈伤组织诱导及观察
实验二愈伤组织诱导及观察 一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照
粉蕉愈伤组织的诱导
粉蕉愈伤组织的诱导1 朱军，黄惠琴，方哲，鲍时翔 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 (571101) E-mail：bsxhhq@https://www.360docs.net/doc/4c9936124.html, 摘要：香蕉是一种重要的热带水果。本文就影响粉蕉愈伤组织诱导的因素（外植体来源、生长调节剂种类、浓度等）进行了研究。其诱导的最佳条件是：以未成熟雄花花序或球茎为外植体，MS＋2,4-D 4 mg/L＋IAA 1 mg/L＋NAA 1 mg/L，28℃下暗培养。以球茎所诱导的愈伤组织诱导率可达89.1%。 关键词：香蕉，愈伤组织，诱导 中图分类号：S668 1. 引言 近年来，利用植物生产人类疫苗和其他药用蛋白越来越受到人们的重视。作为世界上重要的热带水果和粮食作物的香蕉（Musa spp.），因其果实营养丰富、生产周期短、可鲜食等特点而成为理想的植物生物反应器，因此香蕉转基因技术研究尤其显得重要。由于利用愈伤组织作为转化受体并诱导胚状体而再生的转基因香蕉可降低嵌合体发生[1]，且胚性愈伤组织可大量增殖、保存时间长，因此愈伤组织作为香蕉转基因受体受到越来越多研究者的重视。但香蕉是一种愈伤诱导率极低的作物，且品种间差异极大[1～5]。这极大的限制了香蕉转基因技术的研究。本文就粉蕉愈伤组织诱导进行了探讨，希望为我国香蕉转基因技术的研究提供参考。 2. 材料与方法 2.1 材料 选取香蕉品种粉蕉(Musa spp., ABB)为试验材料。 2.2 方法 2.2.1 外植体表面消毒 剥去未成熟雄花花序的苞叶，直至4 cm左右；在70%(体积分数)的酒精中浸泡1 min；再用1 g/L升汞(HgCl)浸泡10 min；取出，用无菌水彻底冲洗汞。假茎、球茎、幼叶取自试管苗，故无须消毒。 2.2.2 不同外植体的处理 选取粉蕉未成熟雄花花序、假茎、球茎、幼叶为外植体。分别将香蕉未成熟雄花花序剥去苞叶直至1.5 cm左右，沿轴线纵切成4块，再横切成厚约1 mm的薄片；假茎切成厚约1 mm左右的薄片；球茎切成小块；幼叶切成10 mm×10 mm方块接入愈伤组织诱导培养基中培养。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(No.20050565004) 的资助。
小麦愈伤组织的诱导
小麦愈伤组织诱导与其再生培养体系的建立 前言：小麦属于禾本科植物，麦粒在植物学上称为颖果，在种子学上则称为种子，通常称为小麦。麦粒皮色有红白之分，红皮的叫红麦，白皮的叫白麦。由于品种和受环境影响不同，红皮小麦又有深红色和红褐色；白皮小麦又有白色、乳白色或黄白色之分。 一：目的及意义 我国小麦目前的状况有以下几点：1 我国是农业大国，小麦面积4亿亩、产量9000万吨左右，分别占世界总量的 12%和18%，均居世界第一位。2 我国春小麦主要分布在东北、西北及华北北部。据中国粮油信息中心的数据显示，预计中国 03/04市场年度（7月至次年6月）春小麦播种面积仅为190万公顷，较上年度减少5％，这是多年来中国春小麦种植面积首次低于200万公顷；预计03/04年度春小麦产量为580万吨，较02/03年度下降7.48%。我国的小麦种植面积不断的减小，总产量也在不断减少。由于我国目前存在的状况，农业大国，主产小麦，但小麦的产量的质量都不是很好，种植面积又在减少，本研究主要是提高小麦的产量和质量。 二：综述国内外对小麦的研究状况 2.1 小麦愈伤组织诱导及原生质体的分离与纯化张小红，闵东红，邵景侠（西北农林科技大学，陕西杨凌712100） 试验方法：以普通小麦的幼穗和幼胚为外植体进行了愈伤组织诱导，及由幼胚愈伤组织进行了原生质体分离和纯化试验，研究了幼穗和幼胚外植体及低温预处理等因素对愈伤组织诱导的影响，在原生质体分离中研究了酶浓度和配比、酶解时间及蔗糖浓度等因素对幼胚愈伤组织原生质体游离和纯化的影响。结果表明：小麦幼穗离体培养时，以1.0~1.5 cm长度的幼穗有利于愈伤组织的诱导；小麦幼穗和幼胚外植体采后低温储藏时不易超过3 天，时间太长会影响愈伤组织诱导；2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶+0.6 M甘露醇分离原生质体较好，最佳酶解时间为 4~6 h，原生质体产量和活力较高。 2.2 小麦愈伤组织诱导及其植株再生研究进展王廷璞，陈荃，崔爱明，刘瑞媛，马伟超 （天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001） 试验方法：小麦组织培养体系的建立与完善是应用植物基因工程改良小麦品质的重要基础和保证，综述了近年来小麦愈伤组织诱导及植株再生的研究情况。研究资料表明：小麦组织培养中，不同来源和不同生理状态的小麦外植体（幼胚、幼穗、花药、成熟胚、叶、根等），在愈伤组织诱导和获得再生植株的能力方面均显示了优点和不足。不足之处是在生产过程中，不断受到生物、非生物等因素的胁迫，严重影响其产量及品质。 2.3小麦愈伤组织诱导及其再生能力影响因素的研究贾海燕, 王洪刚 ( 山东 农业大学农学院, 山东泰安 271018) 试验方法：以农艺性状较好的24 份小麦品种( 系) 为材料, 筛选出了愈伤组织诱导率高且植株再生能力强的基因型材料山农995604 和F281- 10, 在此基础上对影响愈伤组织的分化能力以及较长时间保持分化能力的因素进行了研究。结果表明, 在愈伤组织的继代过程中, 保持较高浓度的2, 4- D, 或对愈伤组织进行交替继代培养有利于较长时间保持其再生能力。最佳取材时间在开花后15d 左右,
愈伤组织的诱导和培养
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223 愈伤组织的诱导和培养 一、实验目的及意义 植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。 二、实验原理 植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。 三、实验仪器与药品 超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉 材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗 四、实验步骤 1.按下表分别配制培养基
将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固 2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。 3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。 4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况 五、实验结果
水稻愈伤组织的诱导实验报告
水稻愈伤组织的诱导实验 报告 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
水稻愈伤组织的诱导 一、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)； 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（）； 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒 在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO，不时摇动搅拌，共处理30分
植物组织培养习题及答案
0．填空 1.根据培养的材料,植物组织培养分:愈伤组织培养、(器官培养、细胞格养、原生质体培养(悬浮培养 2.植物组织培养的发展分为三个阶段:萌芽阶段、奠基阶段，快速发展和快速发展和应用阶段 3，1902年,Haberlandt提出了植物细胞“全能性”学说,1934年, White出版了《植物组织培养手册》培养等类型从而使植物组织培养为一门新兴学科。 一．填空、 1，组织培养实验室必要的设备有超净工作台、高压灭菌器、调机、_天平、显微镜、_蒸馏水，发生器，酸度计 养基成分主要包括①无机营养成分、②有机营养成分)、_③植物生长调节物质、_④碳水化合物、⑤其它物质 3、培养基最常用的碳源是_蔗糖,使用浓度在1%-5%常用3% 4、糖在植物组织培养中是不可缺少的,它不但作为离体组织棱以生长的碳源而且还能维持培养基渗透压 5、在固体培养时琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物般用量6-10g/L之间 6.驯化的目的:在于于提高试管苗对外界环境条件的适应性,提高其光合作用的能力,促使试健壮,提高苗的移裁成活 7、生长素/细胞分裂素的高低决定着外植体的发育方向,其比值高:有利于根的形成和愈伤组织的形成:低:有利于芽的形成 8、培养基灭菌一般在108kPa的压力下,锅内温度达_121℃C,维持_20-30min、 9.选择外植体时应选择①选择优良的种质、②选健壮的植株、③选最适的时期和④选取适宜的大小。 10、诱导胚状体比诱导芽的优点:(1)数量多、(2)速度快、_(3)结构完整 11、试管苗的生态环境:高温且恒温、高湿、弱光、无菌 12、培养基中加入活性炭的目的:利用其吸附能力,减少一些有害物质的影响大 13、筛选培养基的方法:单因子试验法、多因子试验法、广谱实验法 14、植物培养技术:灭菌、接种种、培养、驯化四个环节 15、试管苗的驯化注意:基质、温、光、水、肥、气的综合管理 二．填空 1.绝大多数培养植物再生植株时都先经过愈伤组织阶段 2.愈伤伤组织形成大致经历诱导期、分裂期一和分化期三个时期 3、愈用植物生长调节物质时要注意:种类和浓度生长素和细胞分裂素的比值4.愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式 5.组织培养细胞再分化包括四个水平:细胞水平的再分化、组织水平的再分化、器官水平的再分化(器宣发生)和植株水平的分化 三．填空: 1.植物器官培养主要是指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。 2、茎尖培养根据培养目的和取材大小分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。前者主要是对茎尖长度不超过,最小只有几十微米的茎尖进行培养,目的是获得无病毒植株:后者是对几毫米乃至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养,目的是离体快繁 3.不定芽产生的途径一是从外植体上直接产生二是从由外植体诱导产生的愈伤组织上产生 4.离体叶培养是指包括叶原基、叶栖、叶鞘、叶片、子吐等叶组织的无菌培养 5.在离体叶培养中,6-BA和KT利于芽的形成;24D利于愈伤组织的形成 四．填空 1、胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养 2、离体胚的培养分为二种类型:。成熟胚培养和_幼胚培养六
胡萝卜愈伤组织诱导培养实验
云南大学生命科学学院本科教学实验教学中心 细胞工程实验实验报告 胡萝卜愈伤组织诱导培养实验 摘要：以胡萝卜为实验材料，利用直根形成层为外植体诱导出愈伤组织，探讨了不同激素比例对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，然后在诱导后的愈伤组织多次继代培养获得生长旺盛的分化组织，接着进行再分化，在胡萝卜培养过程中掌握诱导培养技术还有细胞培养所要求的无菌技术。 关键字：胡萝卜；愈伤组织；继代培养；再分化；组织培养 胡萝卜(Daucus carota L)为伞形科两年生草本植物，因其营养丰富、又具药用价值，且耐运输、易栽培、病虫害少和耐贮藏，而成为人们常食蔬菜。同时又作为生物技术研究的理想材料，因此建立一个高效的、实用的组织培养快速繁殖体系则是研究植物遗传转化的基础。本文对胡萝卜愈伤组织诱导的最佳培养基进行探讨，研究了激素对胡萝卜愈伤组织诱导的影响，为其高效生产次生代谢产物α-胡萝卜素、β-胡萝卜素以及将来组织培养的工厂化和分子生物学研究打下基础【1】。 1.材料和方法 1.1材料来源：胡萝卜根，长10~20cm，直径1cm以上。 1.2方法： 1.2.1愈伤组织的诱导培养 （1）培养基的配制：MS +2，4-D 2mg/L + KT 0.5mg/L+3%（30g/L）白砂糖+0.95%（9.5g/L）琼脂，pH5.8 （2）胡萝卜的选材、修剪和清洗：选择新鲜较粗的萝卜，先用自来水冲洗，再2％洗涤剂浸泡20分钟，清水冲洗（注意材料损伤） （3）对材料进行灭菌：在超净工作台上用75％乙醇30-60s；0.1%升汞8-10分钟; 无菌水冲洗3-5次； （4）无菌修剪：用解剖刀进一步去除两端1cm，将中断切成0.5cm厚的薄圆片，然后再切去外壁2—3mm厚的皮，选取中间的部分移至无菌的部分，用刀通过形成层切成1cm2的小块； （5）接种：无菌操作将处理好的材料接种于培养基上，2-3个材料/瓶 （6）培养及观察记录：25 ℃，光照培养，定期观察污染情况，生长状况 1.2.2继代培养 从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在无激素的新鲜培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3个切块。用记号笔标注操作者、组别和日期。（3~4周后在相同培养基上继代培养1次）1.2.3愈伤组织再分化的诱导 （1）培养基： MS+2，4-D 0.5mg/L+KT 0.2mg/L （2）从培养瓶中取出愈伤组织，置于无菌培养皿内，用解剖刀将愈伤组织坏死部分剔除并将愈伤组织切成黄豆大小颗粒，放在培养基表面，用镊子轻轻压实，每个培养瓶接种2~3
实验愈伤组织的继代与分化培养
实验四、愈伤组织的继代与分化培养 一、实验目的 学习愈伤组织的继代培养方法；巩固无菌操作技术；观察愈伤或培养物的再生情况及其形态特点。 二、实验原理 愈伤在生长一段时间后，由于营养、水分减少和代谢物等积累，使其生长减缓甚至变褐衰亡，须转接到新鲜培养基上进行继代培养或分化培养。 通常，生长素/细胞分裂素比值低利于芽的分化，高则利于根的分化。将外植体或愈伤接种到激素配比适宜的培养基上培养，可以通过器官发生或体胚发生途径获得再生植株。 三、实验用品 器皿与设备同前；用实验三培养的甜瓜/烟草愈伤或子叶外植体，分化培养基（老师准备，同实验三）。 四、实验内容及操作方法 注意：四人一组，每组2-3瓶培养基；挑选培养物量大或者培养基少的优先转接。1）超净工作台等准备工作：同前。 2）将三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台中，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将培养物夹取、转接到装有新鲜培养基的三角瓶中。如果愈伤或子叶较大，或分化出根，则用镊子或剪刀将根切除，并将愈伤切割成0.5 cm见方的小块（在培养皿中进行），然后再进行转接。 3）封好瓶口，标好姓名和接种日期。 4）将接种后的三角瓶置于25℃、每天16 h光照和8 h黑暗条件下培养。 五、观察记载内容与实验报告 1、观察记载内容 每人接种数，4人小组接种总数；外植体/培养物的变化及其形态特征，再生情况；污染情况等。每隔3天观察一次。 2、实验报告
1）实验目的 2）实验原理 3）实验方法：可用流程图表示 4）实验结果与分析 A. 描述培养物的变化及其形态特征； B. 统计再生率与污染率，并对结果进行分析。 再生率=分化绿芽（不定根/小植株/胚状体）的愈伤或外植体数/接种总数×100%。说明：实验报告每人一份，实验结果与分析如有抄袭，涉者均按不及格论处。
绿豆芽愈伤组织诱导培养实验报告
生物工程中游技术实验 --植物组织、器官培养的研究 学校： 学院： 班级： 姓名： 学号：
绿豆芽愈伤组织诱导培养实验 【摘要】本实验以MS＋2,4-D为基本培养基,添加NAA或6-BA,对绿豆芽材料进行体外培养,诱导形成愈伤组织。结果表明,在一定浓度范围内,NAA和6-BA对绿豆芽的诱导有促进作用。不同激素组合培养下，绿豆芽外植体形成愈伤组织的类型不同,其色泽、细胞的形态结构显著不同。其中，细胞分裂素和生长素的组合诱导芽及芽的增殖效果最好，MS+6-BA(6mg/L)+NAA(0.4mg/L)培养基最适。 【关键词】绿豆芽；组织培养；愈伤组织；6-BA；2,4-D；NAA;全能性 一、前言 细胞工程(Cell engineering) 是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。其常用技术手段有植物组织培养，植物体细胞杂交、动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。根据细胞类型的不同，可以把细胞工程分为植物细胞工程和动物细胞工程两大类。本文主要综述细胞工程中植物细胞工程的植物组织培养这一技术手段。植物组织培养技术的应用范围包括快速繁殖、培育无病毒植物，通过大规模的植物细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等。 植物组织培养，诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。在植物组织培养中，由于植物细胞具有全能性,即植物的体细胞具有母体植株全部遗传信息并会发育成为完整的个体。因而,每一个植物细胞可以像胚胎细胞一样,经离体培养再生成植株。随着细胞工程技术的不断发展,植物细胞和组织培养这一细胞工程技术也无例外地得到发展,目前已在许多植物上,特别是在农林生产实践中得到了广泛应用。尤其在林木优良品种和无性系的快速繁殖方面进展较快。统计资料显示,目前全世界已有6000多种植物细胞和组织培养成株。实验证实,植物叶肉细胞、茎尖、根尖、花粉、胚、胚乳等细胞或组织均可以再生成植株。 本试验旨在利用NAA和6-BA的组合调控来诱导绿豆芽的愈伤组织，加深对植物外植体消毒、接种的无菌操作技术，学习外植体愈伤组织诱导的方法。 6-BA为细胞分裂素，主要作用是促进芽的形成,也可以诱导愈伤组织发生。如果超过0.1毫克就会抑制发根，超过0.5毫克则完全不发根。NAA是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根。2,4-D是一种人工合成的植物生长激素。
实验1 愈伤组织的诱导
实验1 愈伤组织的诱导 1、实验目的 （1）学习植物材料表面灭菌的常规方法； （2）了解接种的无菌操作技术； （3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。 2、实验原理 植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。 由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。 3、实验仪器和试剂 仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。 无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。 植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。 试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。 培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.8 4、实验步骤 （1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。 （2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。 （3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。以下操作全部在无菌条件下进行。
（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。 （5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。注意：在每一次使用镊子、解剖刀后，都要对其消毒一次。 （6）接种：在酒精灯焰附近处，用无菌镊子夹取胡萝卜薄片并迅速半插入琼脂培养基上，每皿放4-5片，注意将近根尖的一面接触培养基。将培养皿口在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒，立即用封口膜封好瓶口。 （7）培养：将接种后的三角瓶放到光照培养箱中，在25℃下的黑暗中培养3-4周。 5、结果记录与分析 （1）接种1周-10天后，调查、计算污染率： 污染率(%)=污染的材料数/接种材料数×100% （2）每周观察并记录胡萝卜外植体产生愈伤组织的情况，包括出现愈伤组织前培养物的形态，愈伤组织出现的时间以及愈伤组织的形态特征（愈伤组织的颜色、质地等），4周后调查、计算愈伤组织诱导率： 诱导率（%）=形成愈伤组织的材料数/接种材料数×100% 6、思考题 （1）分析影响愈伤组织诱导的主要因素。 （2）以胡萝卜为材料为什么要强调要切取含有形成层部分，胡萝卜其它部分（如茎、叶、花）能否诱导出愈伤组织？ 实验二真菌菌丝DNA提取 1实验目的 学习利用CTAB法少量提取真菌菌丝体DNA，同时掌握在DNA提取中各
愈伤组织诱导及观察
一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出
植物组织培养在实际生活中的应用
植物组织培养在实际当中的应用 摘要：植物细胞要表现出全能性，须经过脱分化、再分化等一系列过程。在实际应用中可用胚状体作为特定的优良基因型个体的无性繁殖手段，同时在研究胚胎发育中也有很重要的理论意义。随着科学技术的不断进步，植物组织培养这门崭新的技术将日益普及和深入，成为现代农业生产中重要的技术手段 关键字：脱分化,愈伤组织,原生质体,脱毒苗,培养基 形成芽的培养基条件常有不同，可以同时在组织培养中形成，一般说，培养物中形成的芽如胡萝卜悬浮培养，油菜愈伤组织等。在组织培养中通过根、芽诱导再生植株方式有三种：一种在芽产生之后，于芽形成的基部长根而形成小植株，一种是在根上生长出芽来，另一种即在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植物。除营养芽之外，在组织培养中有时也有花芽的形成，如烟草、花生等。也有变态器官的形成，如百合鳞片切块分化出的芽，形成小鳞茎，唐菖蒲茎端可诱导形成小球茎，马铃薯的茎切段可以形成块茎。 在很多禾谷类作物的组织培养中发现，用较高浓度的生长素（2，4-D）诱导形成的愈伤组织，当培养在除去生长素，或适当浓度的活性较低的生长素中时，就可以诱导芽的形成。Nitsch等用Linsmaier(LM)培养基附加10-5摩尔2，4-D 培养水稻愈伤组织可以生根，一旦转入无生长素的培养基时就能产生芽。Rangan 将小米愈伤组织从含生长素的培养基转移到无生长素的培养基，一个星期内就形成了芽。 但在另一些例子中激素比例控制器官分化的问题则出现完全相反的情况。苜蓿在有2，4-D和细胞分裂素的培养基中，可以形成愈伤组织，转入不加以上两种激素的培养基中能分化，但分化的情况与原来的激素比例有关。如果愈伤组织是在高细胞分裂素/生长素比例的培养基中形成的，易于生根，而在高生长素/ 细胞分裂素比例的培养基中形成的，易于生根，而在高生长素/细胞分裂素比例的培养基中形成的愈伤组织，则易生芽。由此看来，分化与激素的关系同植物的
植物愈伤组织诱导培养基的配制
中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 姓名： 马宁 专业年级： 生命基地班2009级 学号： 040212009020 课程： 植物生理学实验 题目： 植物愈伤组织诱导培养基的配制 一 .实验目的 1、掌握植物组织培养基母液配制的原则。 2、掌握植物MS 培养基的配制方法。 3、学会使用高压灭菌锅。学会植物组织含水量、自由水和束缚水含量的测定 二 .实验原理 概念： 1.植物组织培养： 将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。 2.愈伤组织及脱分化、再分化： 植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。 培养基配置见下表 化合物 含量 mg/L 母 液 吸取母 液量 ml/L 编号 浓度 mg/ml 称量 mg 配制量 ml NH 4NO 3 1650 1 33 16500 500 25 KNO 3 1900 38 19000 KH 2PO 4 170 3.4 1700 MgSO 4.7H 2O 370 7.4 3700 CaCl 2.2H 2O 440 2 8.8 4400 500 25
三 .主要仪器试剂 三蒸水、蔗糖、琼脂、用分析纯试剂：NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4?7H2O 、CaCl2?2H2O 、 ZnSO4?7H2O 、MnSO4?4H2O 、H3BO3预先配制好的不同组分的培养基母液、2-4D 溶液、烧杯、移液管、铁缸子、玻璃棒、手套、加热器等。 四.实验操作步骤 1、母液的配制（教师配好） 1）配制母液的好处和原则 （1）好处 a.可减少每次配制称量药品的麻烦. b.减少极微量药品在每次称量时造成的误差。 母液配成10~100倍，2－4℃冰箱中保存，用时按比例稀释。 （2）原则：按照药品的种类和性质（相似）分别配制，避免形成沉淀。 2）实验中用到的各母液 ZnSO 4.7H 2O 8.6 3 0.86 430 500 5 MnSO 4.4H 2O 22.3 2.23 1115 H 3BO 3 6.2 0.62 310 NaMoO 4.2H 2O 0.25 4 0.25 125 500 0.5 CuSO 4.5H 2O 0.025 0.025 12.5 CoCl 2.6H 2O 0.025 0.025 12.5 KI 0.83 5 0.083 41.5 500 5 Na-EDTA 37.3 6 7.46 3730 500 2.5 FeSO 4.7H 2O 27.8 5.56 2780 盐酸硫胺素 0.1 7 1 25 25 0.05 盐酸吡多醇 0.5 8 1 25 25 0.25 肌醇 100 9 20 1000 50 2.5 甘氨酸 2 10 1 50 50 1 烟酸 0.5 11 1 25 25 0.25
水稻愈伤组织培养
水稻愈伤组织的诱导 李希 北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，100083 摘要：以水稻种子为外植体，研究了外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过 程。结果表明水稻种子接种在诱导培养基上两天已产生愈伤组织发芽2mm，四天愈伤组织呈现浅黄色发芽5-10mm，6天愈伤组织颜色加深发芽1-2cm，8天愈伤组织为橙黄色发芽2-3cm，无杂菌污染。 关键词：水稻种子外植体诱导愈伤组织 引言 自Niizeki和Oono1968年首次获得水稻花粉植株以来，水稻组织培养取得了很大的进展，如各种水稻品种愈伤组织的诱导、继代、植株再生培养基的筛选，遗传特性，基因工程转化体系的建立等等。水稻种子愈伤组织的诱导是这些研究的基础，因此掌握外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程至关重要。以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用。本次试验使用的诱导剂为2,4-D，诱导率为100%。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1实验材料 水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 1.1.2仪器设备及用具 超净工作台培养室、培养皿：￠9cm×2 枪形镊量筒：100mL×2 三角瓶：50mL×2(无菌)；废液缸；保鲜膜；标签纸 1.1.3试剂及培养基 试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL) 培养基：诱导培养基：MS+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8） 1.2 实验方法 1.2.1 MS固体培养基配制： 由于实验室中的MS培养基已含有蔗糖和琼脂，所以直接按照41.5g/L的浓度配置。实验中配置50ml培养基，需依次加入2.075gMS，0.1mg2,4-D； 用NaOH或HCl调节PH=5.8； 高压蒸汽锅121℃灭菌20min。 1.2.2接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 1.2.3种子去壳 选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳（注意保持胚完整），准备20粒去壳种子，
愈伤组织诱导及观察
实验二愈伤组织诱导及观察 . 实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二. 实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技 术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件 下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期
起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是 成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有2，4- 二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸和细胞分裂素等。 分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。 分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2?4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。 愈伤组织的形态发生方式 经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式两种。不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化
植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师
植物组织培养基的配制与植物愈伤组织诱导 一、实验目的； 通过植物组织培养基和植物愈伤组织诱导实验的学习和训练，使学生了 解植物组织培养的基本原理和操作技术，初步掌握MS固体培养基制备 方法、外植体的常规灭菌技术以及愈伤组织诱导方法。 二、实验原理： 根据植物细胞全能性原理，培养植物材料。即在无菌条件下，将植物的器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）放在人工培养基上进行培养，通过细胞分裂，形成一团薄壁细胞，即愈伤组织。愈伤组织可以在适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下进行再分化，重新产生出植物的各种器官和组织，进而发育成完整的植株。 三、实验内容实验包括以下3部分内容: 实验1-1、植物组织培养基母液的配制和保存 实验1-2、MS培养基的配制与灭菌 实验1-3、胡萝卜愈伤组织的诱导 实验1-1植物组织培养基母液的配制和保存 1、目的要求学习植物组织培养基母液的配制方法，为培养基的配制 做准备。 2、基本原理植物培养基是植物离体培养的组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节等物质。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配 制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度，按比例稀释。本实验以MS培养基为例，学习培养基母液的 配制。 MS培养基母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长激素母液，在不同类型的培养基中使用。 3、实验仪器设备和试剂3.1仪器、用具 分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、 1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量 筒、移液抢、微波炉等。 3.2试剂 （1）95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。 （2）MS培养基成分： ①大量元素（母液I ）: NHNO、KNO CaCb2H2O MgSO7mO KHPO; ②微量元素（母液口）: KI、HBQ MnSQ4H2O ZnSQ.7H2O NQM0Q.2H2O CuSQ5H2O C0CI2.6H2Q；③铁盐（母液川）:FeSQ.7H2Q NQ.EDTA.2H2Q； ④有机成分（母液,维生素和氨基酸）：肌醇、盐酸吡哆醇（维生素&）、烟
诱导愈伤组织的生长素最常用的是IAA
诱导愈伤组织的生长素最常用的是IAA、NAA和2, 4-D，大多数材料选用2, 4-D，它对愈伤组织的诱导作用优于其它生长素，缺乏2, 4-D是导致直接出芽的原因。 最常用的细胞分裂素是KT和6-BA。KT 的主要作用是促进细胞分裂，在分化培养基中，通常是添加KT、6-BA来促进愈伤组织分化。KT对愈伤组织诱导率不大，但在诱导培养基中添加KT 可以改善愈伤组织的质量，在一定程度上能延缓愈伤组织的衰老，延缓其器官分化能力的丧失，从而提高植株再生频率。 诱导的MS培养基激素:1mL2,4-D 200ul6BA 分化的MS培养基激素:400ul NAA 200ul6BA 建立山茱萸的组织培养及植株再生体系。方法：分别以山茱萸的叶片、花柄和花托为材料,进行山茱萸不同外植体的离体培养研究,筛选最佳培养基组成。 结果：适宜山茱萸叶片愈伤组织诱导的培养基组合为1／2MS,附加BA2．0mg／、IBA 0．5-1．0mg／L；适宜山茱萸花柄、花托愈伤组织诱导的培养基组合为1／2MS,附加BA1．0mg／L、2,4-D 0．5mg／L；在1／2MS附加BA 2．0mg／L、IBA0．05mg／L的培养基上,可诱导不定芽的产生；1／2MS 附加IBA 2．0mg／L的培养基有利于山茱萸试管苗生根。讨论：山茱萸的花托是进行组织培养的最适外植体,白色或翠绿色、结构致密的愈伤组织较易分化产生不定芽。 目的:研究山茱萸茎段组织培养技术,为山茱萸优良株系的快繁建立最佳条件. 方法:选 择山茱萸优良母株的茎段为外植体,分别在不同的培养基中培养,形成大量丛芽, 再诱导单株苗生根成为完整植株.结果与结论:茎段在WPM+6-BA 2.0 mg*L-1 +ZT 0.1 mg*L- 1+NAA 0.1 mg*L-1培养基上,能形成大量丛芽;在WPM+6-BA 1.0 mg*L -1 +ZT 0.1 mg*L-1+GA3 0.5 mg*L-1+NAA 0.1 mg*L-1中继代培养,可获大量壮苗;切取单株苗在1/2 MS+ 6-BA 0.1 mg*L -1 +IBA 1.0 mg*L-1培养基中能生根,移栽并成活. 红瑞木(Cornus alba L.)山茱萸科(Cornaceae)木来木属(Cornus L.),落叶灌木。叶对生,椭圆形,聚伞花序,顶生。具有较高观赏价值和园林绿化价值。选取红瑞木当年生的嫩枝段为外植体,用自来水冲洗30分钟,在无菌条件下先用70%乙醇表面消毒20秒,再用0.1%HgCl2溶液(加2-3滴吐温)处理8分钟,然后用无菌水冲洗6-8次。消毒后的外植体接种于添加不同生长调节剂的培养基上进行光照培养。接着进行继代培养和生根培养。培养基pH6.2,培养温度为(24±2)°C,光照为14小时/天,光照强度2.52×10-5-4.86×10-5mol.m-2.s-1。结果表明,红瑞木在启动培养阶段出现了严重的褐化现象,取其下部茎段作为外植体,有效地克服了褐化现象,褐化率仅为4.3%。MS+0.50mg·L-16-BA+0.10mg·L-1IBA培养基最有利于外植体芽的萌发。继代培养以MS为基本培养基,植株长势良好,但是丛生芽分化少。以M(MS培养基中的CaCl2·2H2O的浓度为1200mg·L-1)为基本培养基,植株生长健壮,丛生芽生长好且分化多。......(本文共计 峨眉四照花(Dendrobenthamia capitata var. emeinsis Fang et Hu.),隶属山茱萸科(Cornaceae)。被列入国家级濒危植物名录药用植物种群中。峨眉四照花也是峨眉山特有的观赏树种,集观叶、观花、观果于一身,具有较高的推广和应用价值。为了保护现有种质资源,减轻资源压力,本试验对峨眉四照花进行了离体快繁研究,为扩大种源,产业化生产峨眉四照花提供了理论基础和技术支持。也为开展四照花类其他植物的组织培养提供了经验。本试验以峨眉四照花为材料,对其组织培养技术进行了研究,初步获得了峨眉四照花的试管苗及其愈伤组织。研究的主要结果如下: 野外采集的外植体,以饱和漂白精溶液+吐温-80法处理10min,污染率较低,且植株褐化现象较轻。对于已污染的材料,进行了青霉素灭菌试验,400万单位/L的青霉素无菌水溶液处理峨眉四照花组培细菌污染苗40min效果最好。在培养基中添加抗氧化剂、抑制剂、吸附剂能有效的抑制峨眉四照花褐变的发生,本试验中以添加活性炭(AC)4g/L效果最好。以茎尖、茎段为外植体,对组织培养及其植株再生进行了研究,结果显示:峨眉四照花采取当年生半木质化嫩茎或茎尖为材料较好,有利于启动。初代最适培养基筛选中,以MS+6-BA1.0mg/L +GA1.5mg/L培养基为最适。茎尖的增殖培养试验中培养基MS+6-BA1.0mg/L+ZT0.5mg/L效果较好。峨眉四照花不同部位外植体,愈伤组织的诱导率也不同。愈伤组织诱导能力:茎尖〉茎段〉叶片。以MS+NAA0.5mg/L +6-BA1.0mg/L诱导愈伤组织成功率最高。愈伤组织转接继代培养,最佳愈伤组织继代培养基为:MS+KT0.1mg/L+NAA1.0mg/L。但愈伤组织诱导芽较困难。 以桃叶珊瑚带芽茎段为材料,研究不同消毒处理及浓度的激素浓度配比对外植体污染率和侧芽诱导的影响。结果表明:75%酒精处理60s+0.1%HgC2处l 理6min条件下,污染率最低为17.3%;最佳侧芽诱导激素浓度组合为6-BA2mg/L+NAA0.3mg/L,侧芽启动率可达49.4%,且对外植体侧芽的高生长也有较好的促进作用,