杆状病毒表达蛋白
杆状病毒表达蛋白
1 donor vector的构建
1.1 外源基因的连接
1.2 转化
1.2.1 取10μL连接产物放入100μL感受态细胞中。
1.2.2 冰浴30min。
1.2.3 42℃，90s。
1.2.4 马上放入冰浴中，2min。
1.2.5 加入800μL LB培养基，37℃，150rpm摇1hr。（LB 37℃预热）
1.2.6 取200μL涂Amp+LB平板。
1.2.7 37℃，恒温培养箱，倒置培养12-16hr。
1.3 鉴定
1.3.1 挑取10个单菌落于Amp+LB培养基中，37℃，225rpm，摇过夜。
1.3.2 小量提取质粒，操作步骤见附录2。
1.3.3 用SalI及XbaI双酶切鉴定连接结果。
1.3.4 取1ml菌液测序。
1.4 菌种的保存
1.4.1挑取单菌落于1-2ml Amp+LB培养基中。
1.4.2 37℃，225rpm摇至平稳期。
1.4.3 0.85ml细菌培养物+0.15ml灭菌甘油，混匀。
1.4.4 -80℃保存。
2 转座
2.1 转座反应
2.1.1 将DH10Bac放入冰中备用。
2.1.2 轻轻混匀，取100μL DH10Bac细胞于遇冷的15ml圆底灭菌管中。
2.1.3 加入下列质粒DNA并轻混匀。
pFastBac TM construct 1ng(5μL)
pFastBac TM control 1ng
PUC19 control 50pg
2.1.4于冰中放置30min。
2.1.5 42℃，热激45s，不要摇动。
2.1.6 马上放入冰浴中，2min。
2.1.7 加入900μL室温LB培养基。
2.1.8 37℃，225rpm摇4hr。
2.1.9准备一系列10倍稀释的细菌培养物（10-1、10-2、10-3），每板加入100μL的稀释菌液。（平板为：50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet、100μg/ml Bluo-gal、40μg/ml IPTG）。
2.1.10 37℃，倒置培养48hr，挑取白斑进行分析。
2.2 鉴定
2.2.1 挑取10个克隆于新鲜配制的LB平板中，画线，37℃倒置培养过夜。
2.2.2 挑取单菌落于LB液体培养基中，LB液体培养基含有50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet。
2.2.3 Bacmid DNA的提取，提取方法见附录3。
2.2.4 Bacmid DNA的PCR鉴定
由于Bacmid DNA中含有M13的正向及反向引物序列，在转作子两端，所以可以用M13来扩增鞭毛蛋白基因。
M13 Forward :5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3
M13 Reverse :5-CAGGAAACAGCTA TGAC-3
反应的条件为：93℃ 3min，（94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 5min）×25-35个循环，72℃ 7min。
2.2.5 取5-10μL PCR产物，0.7%琼脂糖电泳检测片段的大小，正确的片段大小为4000bp。
3 Bacmid DNA转染sf9昆虫细胞获得杆状病毒
3.1 sf9昆虫细胞的培养（见附录4）。
3.2 Bacmid DNA 转染sf9昆虫细胞
3.2.1 在6孔板中，每孔铺9×105个细胞，加入2ml含有抗生素（50u/ml的青霉素，50μg/ml 的链霉素）的sf-900II SFM培养基。
3.2.2 27℃至少培养1hr。
3.2.3 在灭菌管中混合Cellfectin及DNA。
将1μg DNA在100μL的sf-900II SFM培养基中稀释；将Cellfectin上下颠倒混匀5-10次，取出6μL，用100μL的sf-900II SFM培养基稀释；将稀释的DNA及Cellfectin混合，温和混匀，室温放置15-45min。
3.2.4 移去细胞中的培养基，加入2ml sf-900II SFM培养基洗涤，弃去洗涤液体。
3.2.5 在DNA：Cellfectin混合物中，加入800μL的sf-900II SFM培养基，温和混匀，加入细胞中。
3.2.6 27℃，培养5hr。
3.2.7 移去DNA：Cellfectin混合物，加入2ml含双抗的sf-900II SFM培养基。
3.2.8 27℃培养72hr，直到看到杆状病毒的标志。
如果转染效率高，72hr后就可看到细胞病变，如果转染效率不高，4-5天后才能看到。
转染后的细胞病变：
3.2.10 500×g离心5min除去细胞及碎片。
3.2.11 将上清转移至新的灭菌15ml snap-cap管中，加入2%的胎牛血清，4℃避光保存，即为P1病毒。
4 杆状病毒的扩大培养
4.1 在转染当天，准备sf9细胞，铺在6孔板中，每孔铺2×106个细胞，室温培养1hr。
4.2倒置显微镜观察细胞，确认是否已经贴壁。
4.3 加入适当量的P1病毒。加入量计算方法为：
转入病毒的量=MOI（pfu/cell）×细胞数量/病毒滴度（pfu/ml）
P1病毒的滴度的范围在1×106---1×107 pfu/ml，MOI一般取0.05-0.1。
4.4 27℃，5%CO2培养箱中培养48hr。
4.5 48hr后，（视杆状病毒的构建情况，决定收集时间）收集病毒于15ml snap-cap管中。4.6 500g离心5min。
4.7 将上清收集于新的15ml snap-cap管中，即为P2病毒。
4.8 4℃，避光保存。
5 杆状病毒滴度的测定
5.1 4%低熔点琼脂糖培养基的配制
5.1.1 微波炉加热或者70℃水浴,溶化4%低熔点琼脂。当低熔点琼脂溶化后，将下列物品放入水浴中：
空的100ml无菌瓶
Sf-900(1.3×)培养基
5.1.2 待低熔点琼脂溶化后，马上将低熔点琼脂、无菌瓶及Sf-900(1.3×)培养基放入超净台。
5.1.3 将30ml Sf-900(1.3×)培养基及10ml 4%低熔点琼脂放入100ml无菌瓶中，温和混匀。
5.1.4 准备好后，于40℃保存。
5.2 蚀斑试验
5.2.1在转染当天，收获sf9细胞，并准备30ml细胞悬液，调整细胞密度为5×105/ml，于6孔板中每孔铺2ml细胞。
5.2.2 室温放置1hr，让细胞贴壁。
5.2.3 1hr后，用倒置显微镜观察细胞贴壁的状态，应该有50%细胞贴壁。
5.2.4 在sf-900II SFM中将病毒稀释8个浓度梯度（10-1—10-8）。取0.5ml病毒放入4.5ml培养基中，稀释为10-1，然后从10-1浓度的病毒中取0.5ml病毒放入4.5ml培养基中，稀释为10-2，依此类推。
5.2.5 将6孔板中的培养基移去，马上加入1ml病毒稀释液。
5.2.6 培养1hr后，马上将放在40℃水浴的平板培养基放入超净台。
5.2.7 将病毒液取出，马上将2ml的平板培养基放入。（动作要快，以免培养基凝固）。
5.2.8 室温放置10-20min。
5.2.9 将培养基放于27℃，5%CO2培养箱中培养。
5.2.10 在转染第四天时，用sf-900II SFM培养基配制1mg/ml的中性红溶液，抽滤除菌。5.2.11 将1.5ml的1mg/ml的中性红溶液加入1
6.5ml的sf-900II SFM培养基中配制中性红溶液，混匀，然后放入40℃水浴中。
5.2.12 将4%的低熔点琼脂溶解，放入40℃水浴中，5min。
5.2.13取6ml 4%的低熔点琼脂加入中性红溶液中，40℃水浴保存。
5.2.14 迅速将配好的低熔点琼脂中性红溶液，按每孔1ml，加入6孔平板培养基中。
5.2.15 待凝固后，于27℃，5%CO2培养箱中继续培养3-6天。
5.2.16 在转染后第7-10天时，用细胞培养级别的水配制1mg/ml的中性红溶液2。
5.2.17 每孔加入0.5ml的1mg/ml的中性红溶液2，室温培养1-2hr。
5.2.18 小心用移液器取出多余的染液，计数。
5.3 病毒滴度的计算方法
选择蚀斑数在3-20个的孔，病毒滴度的计算公式为：
滴度（pfu/ml）=每孔蚀斑数×稀释倍数×1/ml接种量
一般情况下，从杆状病毒中获得的病毒滴度为：
P1：1×106----1×107
P2：1×107----1×108
如果得到的P1＜1×106或P2＜1×107，需要重新构建保种。
6 杆状病毒的纯化
6.1用弯头吸管吸出一个清晰的蚀斑，放入1.5ml的灭菌管中，加入500μL sf-900II SFM完全培养基，漩涡混匀。
6.2 加入100μL的agarose plug solution，混匀。
6.3 27℃，5%CO2培养箱中培养72hr。
6.4 用15ml snap-cap管收集培养基，约2ml。
6.5 500×g离心5min。
6.6 将上清转移到一新的15ml snap-cap管中，4℃避光保存。
7蛋白的表达
7.1 在24孔板中接6×105 cells/well，贴壁至少30min。
7.2 30min后，移去培养基，马上用新鲜的生长培养基清洗，加入300μL的新鲜培养基。7.3 加入不同MOI的病毒（1，2，5，10，20）。
7.4 27℃，5%CO2培养箱中培养。在不同的时间收集细胞（24hr,48hr,72hr,96hr）。
7.5 预冷的PBS(pH7.4)缓冲液洗涤细胞数次。除尽残留液体，再加入500μL预冷的细胞裂解液(含有1×Protease inhibitor cocktail)，用橡皮刮刮下细胞收集至eppendorf管内，置冰浴裂解45min，每50μL细胞裂解物分装至一个eppendorf管中，置于-20℃或者-80℃贮存备用或直接用于表达情况分析。
重组病毒中和抗体滴定（改良法）
分离被检血清，56℃灭活30 min 后，在96 孔细胞培养板中将血清作连续倍比稀
释，从1∶2 至1∶256，每个稀释度作4 个重复，每孔50.0μL；用DMEM 将测好TCID50 的PRRSV 稀释为200 TCID50，并加入终浓度为20%的新鲜猪血清，然后将其加入所有加有被检血清的培养孔中，每孔50.0μL，37℃ 5 % CO2 培养箱中作用1 h，再于每孔中滴加2~5×105
个/mL 的Marc-145 细胞悬液100.0 μL，轻轻摇匀后，
放回培养箱中继续培养4~6 d，观察细胞病变情况，按Reed-Muench 两氏法计算被检血清中抗PRRSV 的特异性中和抗体的滴度。同时设有血清毒性对照、标准阴、阳性血清对照以及病毒对照和正常细胞对照。
EBVLMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建
EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表 达载体的构建 【摘要】目的构建EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法逆转录聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸（SOE）技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 的DNA 序列进行连接，构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack CMV 质粒上，在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy1的同源重组，构建融合基因Z2A真核表达载体pAd Z2A。经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAd Z2A。结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切，电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb 两条DNA条带，测序鉴定结果表明序列正确；从感染重组腺病毒vAd Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体，为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。 【关键词】疱疹病毒4型人潜伏膜蛋白2A 基因BZLF1 基因融合表达载体 ［ABSTRACT］ObjectiveTo construct Z2A recombinant adenovirus vector and study the effect of Z2A expression on EBV associated tumor. MethodsBoth LMP2A and BZLF1 cDNA were cloned from B958 cell line by RT PCR, and the fusion gene (LMP2A linker BZLF1) was
杆状病毒表达蛋白
杆状病毒表达蛋白 1 donor vector的构建 1.1 外源基因的连接 1.2 转化 1.2.1 取10μL连接产物放入100μL感受态细胞中。 1.2.2 冰浴30min。 1.2.3 42℃，90s。 1.2.4 马上放入冰浴中，2min。 1.2.5 加入800μL LB培养基，37℃，150rpm摇1hr。（LB 37℃预热） 1.2.6 取200μL涂Amp+LB平板。 1.2.7 37℃，恒温培养箱，倒置培养12-16hr。 1.3 鉴定 1.3.1 挑取10个单菌落于Amp+LB培养基中，37℃，225rpm，摇过夜。 1.3.2 小量提取质粒，操作步骤见附录2。 1.3.3 用SalI及XbaI双酶切鉴定连接结果。 1.3.4 取1ml菌液测序。 1.4 菌种的保存 1.4.1挑取单菌落于1-2ml Amp+LB培养基中。 1.4.2 37℃，225rpm摇至平稳期。 1.4.3 0.85ml细菌培养物+0.15ml灭菌甘油，混匀。 1.4.4 -80℃保存。 2 转座 2.1 转座反应 2.1.1 将DH10Bac放入冰中备用。 2.1.2 轻轻混匀，取100μL DH10Bac细胞于遇冷的15ml圆底灭菌管中。 2.1.3 加入下列质粒DNA并轻混匀。 pFastBac TM construct 1ng(5μL) pFastBac TM control 1ng PUC19 control 50pg 2.1.4于冰中放置30min。 2.1.5 42℃，热激45s，不要摇动。 2.1.6 马上放入冰浴中，2min。 2.1.7 加入900μL室温LB培养基。 2.1.8 37℃，225rpm摇4hr。 2.1.9准备一系列10倍稀释的细菌培养物（10-1、10-2、10-3），每板加入100μL的稀释菌液。（平板为：50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet、100μg/ml Bluo-gal、40μg/ml IPTG）。 2.1.10 37℃，倒置培养48hr，挑取白斑进行分析。
杆状病毒表达系统简介
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。 1、杆状病毒的生物学特性 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用： ①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。 ②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。 昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。 近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae 的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。 杆状病毒基因组的结构和功能研究 杆状病毒基因组为双链环状 DNA分子。DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。 目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角
杆状病毒介绍
杆状病毒 关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒 杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA 插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式： 一种为包含体病毒(occluded virus，OV)， 另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。 它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。
定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法
定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法 摘要 本发明提供一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法，该方法利用重组昆虫杆状病毒感染昆虫细胞后会干扰宿主细胞的生长和复制，通过酸性磷酸酶法检测细胞的数量实现定量测定重组昆虫杆状病毒滴度。该方法灵敏度高，准确性好，所需试剂廉价易得；操作简便，技术容易掌握；耗时较短，效率更高。 说明 定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法 技术领域 [0001] 本发明涉及病毒滴度测定，具体地，涉及一种定量测定重组昆虫杆状病毒滴度的方法。背景技术 [0002]自从80年代初发现杆状病毒科核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polh)的强启动子特性后，Smith and Summer [Smith GE, MD Summers and MJ Fraser.Production ofhuman beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expressionvector.Mol Cell Biol.1983; 3 (12): 2156-2165]首次建立了杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System, BEVS)。杆状病毒表达系统已成为当今基因工程领域四大表达系统之一，与大肠杆菌、酵母哺乳动物细胞表达系统相比，BEVS在以下四个方面具有特殊的研究价值:(I)作为超高效的真核基因表达系统，生产有用的目的蛋白； [2]作为基因工程病毒杀虫剂，提高害虫防治效率；(3)研究杆状病毒基因组的结构和功能；(4)研究真核基因的表达调控机制。杆状病毒表达载体系统已成为研究各种原核蛋白和真核蛋白的非常有效和广泛使用的工具[李卫国，王厚伟，牟志美，石连辉.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望.山东农业大学学报(自然科学版).2003，34(1): 134-138]。 [0003] 检测病毒滴度的方法有终点稀释法和空斑法。终点稀释法是常用检测病毒滴度的方法，具有简便、快速的特点。它是将病毒进行梯度系列稀释后感染细胞，通过检测50%组织细胞感染量(TCID5tl)来判定病毒滴度。空斑技术最早是由Dulbecco建立[DulbeccoR.-Production of plaques in monolayer tissues by using single particles ofanimal virus.Proc Nat Acad Scil952; 38 (8): 747-752], Hink 和Vial 后来把这项技术应用于杆状病毒的研究工作。空斑法是将适量病毒感染细胞后，病毒在感染的细胞内复制、增殖并释放出游离病毒粒子，这些游离病毒粒子由于受到琼脂糖固定培养基的限制，只能感染邻近的细胞。经过几个感染周期以后，这些被感染的细胞均死亡而不被中性红染色，周围的活细胞则被染成红色，于是在最初被病毒感染的细胞周围形成一个无色透明区域，即空斑。通过计数空斑的数量即可判定病毒滴度。
腺病毒重组系统
腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则5 4.2.2 共转化方法5 4.2.3 预期结果5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6 4.4.1 细胞铺板6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常用技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10 5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14
5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表达26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体 Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对 BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白 cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应 CsCl Cesium Chloride 氯化铯 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜 DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇 EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭 FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清 Hr Hour 小时 ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复 Kan Kanamycin 卡那霉素 kb Kilobases 千碱基对 KDa KiloDaltons 千道尔顿
杆状病毒表达系统00000001
昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白 ●杆状病毒表达系统介绍 ●杆状病毒蛋白表达系统的优势 ●杆状病毒表达载体系统（BEVS） ●杆状病毒表达宿主细胞 ●表达优化条件 ●翻译后修饰对蛋白表达的影响 ●高通量表达 ●总结
杆状病毒介绍 1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状 DNA病毒。 2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态： 一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另 一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。 3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。 4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。 5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。 6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。
杆状病毒生命周期 ●早期（0‐6h PI） ?核衣壳迁移到细胞核 ?病毒DNA释放 ?开始早期基因表达 ●晚期（6‐24h PI） ?更多DNA复制 ?新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质 ?的过程中得到囊膜蛋白 ?产生新的出芽病毒 ●极晚期 Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia ?出芽病毒减少 ?核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs ?MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形 成包含体病毒。 多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。
杆状病毒表达系统及其应用进展
综述与专论 生物技术通报 BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N 2010年第10期 杆状病毒表达系统及其应用进展 韦永龙 李轶女 张志芳 沈桂芳 (中国农业科学院生物技术研究所,北京100081) 摘 要: 杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,20世纪80年代被开发为表达载体以来,由于其真核表达环境等优点,受到了广泛的重视和研究,短短不到30年的时间里,杆状病毒表达体系的重组载体构建技术,筛选技术得到了很大程度的改进和简化,成为与大肠杆菌、酵母、哺乳动物相并列的四大表达体系之一。在表面展示,类病毒颗粒表达,哺乳动物基因转移,RNA 干扰等方面取得了重要的成果。就杆状病毒表达系统的发展及其应用作一个综述。 关键词: 杆状病毒 BEVS 表达 Advances i n Research and Application of Bacul ovirus Expression Syste m W ei Y onglong L i Y i nv Zhang Zhifang Shen G uifa ng (B i o tec hnology Research Instit ute ,CAAS,B eijin g 100081) Abstrac:t Bacu l ov iruses are ob li g ate l e t ha l pathogens o f arthropodas .They have been h i gh l y va l ued and w ide l y stud ied si nce be i ng explo ited as a expression vector i n 1980s ,for t he ir exce llen t advantag e i nclud i ng eukaryotic express i on env iroment .In l ess t han 30years ,g reat advances have ach i eved i nvolv i ng reco m b i nant baculovirus constructi on and sc reeni ng .T hus ,t he bacul ov irus expressi on vec tor syste m (BEV S)has beco m e one o f the f our m ost popular expression syste m co m prisi ng bacte ri um ,yeasts ,m a mma li an ce lls and bacu loviruses .T he BEV S has been used i n surface d isplay ,v irus li ke particles producti on ,m a mm a lian ce lls gene de livery ,RNA i nterfe r ence ,etc .The deve l op m ent and applica tion o f the BEV S i s reviewed i n this arti c l e . K ey words : Bacu l ov irus BEVS Express i on 收稿日期:2010 04 26 基金项目:国家自然科学基金项目(30770279),国家!863?计划项目(2006AA10A119)作者简介:韦永龙,硕士,研究方向:分子病毒学;E ma i :l w ei yonglong @126 com 通讯作者:沈桂芳,教授,E m ai:l gf sh2008@caas net c n 杆状病毒是一种DNA 双链病毒,基因组约 80-160kb 之间。杆状病毒是节肢动物门的专性寄生病毒,目前已报道有600种以上的昆虫被杆状病毒所感染,包括鳞翅目、膜翅目、双翅目等7个目[1] 。根据包涵体的形态和病毒诱导的细胞病理学特征,杆状病毒分为核多角体病毒属(nucleopolyhedr ovirus ,NP V ) 和颗粒体病毒属(g r anulov ir us ,GV )[2] 。杆状病毒表达系统(baculov ir us e xpression vector syste m,BE VS )是一个利用杆状病毒作为载体,在昆虫培养细胞或虫体中表达外源蛋白的真核表达系统。具有安全性高,真核修饰环境,容量大,表达量高等特点,自Sm it h GE 等于1983年利用A c NPV 成功表达外源蛋白以来,经过不到30年的发展,杆状病毒表达系统已经成为当今基因工 程四大表达系统(杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物 细胞表达系统)之一。 杆状病毒基因组较大,不易通过常规酶切连接载入外源基因,所以通常是将外源基因连接到转移载体上,此类转移载体含有病毒的两个同源臂,一个或多个杆状病毒启动子,将外源目的基因插入到启动子下游之后,与杆状病毒重组,获得重组病毒,将重组病毒纯化,感染昆虫细胞或虫体,外源基因随着病毒的复制的而获得表达。 1 重组杆状病毒的构建和纯化 最早的重组病毒构建使用的是野生病毒,当病毒与转移载体发生重组之后,病毒的多角体蛋白基因受到破坏,不能形成多角体,感染这种重组毒株的
杆状病毒
杆状病毒多角体病多角体病毒，颗粒体病毒，质型关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型毒病毒粒子呈杆DNA病毒，感染节肢动物得杆状病毒就是一类在自然界中专一性以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大DNA DNA分子，状，基因组为双链环状之间。目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应180 Kb小在90～多种杆状病毒，600 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽 然已发现用于害虫防治。DNA杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链但进行分子生物学研究得不到20种。复制后组DNA，其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。分子，大小为80～160 kbDNA装在杆状病毒得核衣内，后者具有较大得柔韧性，可容纳较大片段得外源用作外源基因表达载体得杆其中，DNA得理想载体。插入，因此就是表达大片段。该NPV)(nuclear polyhedrosis virus，状病毒，目前仅限于核型多角体病毒呈多角得包含体病毒，1~5 m病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约体形状。核型多角体病毒有两种形式：，，OV)一种为包含体病毒(occluded virus BV)。，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus它们在病毒感染中扮演得角色不同，包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形得食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋式，昆虫往往就是食入污染OV得多角体蛋白，它对病毒得水平感染起以下作用：①保护白晶体，即为29 000②保证 病毒颗粒在适当病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。，可使病毒、5)得位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10病毒 就是个体内细胞间得感染形式，由细胞芽颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV BV，进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。生出有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速，其中研究近几十年，最深入得就是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病xumù毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该 病毒就是杆状病毒科 Baculoviridae得原型，就是一种大得、带外壳得双链DNA 病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体得杆状病毒，主要就是来自家蚕得NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好得应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同得特征。 AcNPV得基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期 基因表达与极晚期基因表达。前两个阶段得基因表达早于DNA复制，而后两个阶段得基因表达则伴随着一系列得病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达得蛋白，它们就是多角体蛋白与P10蛋白：多角体蛋白就是形成包含体得主要成分，感染后期在细胞中得积累可高达30％~50％，就是病毒复 制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定与感染能力另一类高效表达得极晚期蛋白为P10蛋白，也就是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因与P10基因现在都已被定位与克隆这两个基因得启动子具有较强得启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想得外源基因插入位点。 1、杆状病毒基因组得结构与功能研究 以超螺旋方式被压缩包装DNA分子。DNA 杆状病毒基因组为双链环状 在杆状核衣壳(rod、shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料： 1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。 2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。 实验步骤： 一、昆虫细胞转染： 1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。 2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物： a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。 b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。 c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。 3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。 4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。 5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。 二、病毒贮液的制备： 1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。 2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量： 感染所需病毒贮液量(ml)= [MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)] 注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。 4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下： a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。 b. 每孔加入适量的P1贮液，27℃湿盒孵育48h。 c. 根均细胞病变情况（约48h后）收集各孔中的病毒上清液，500g离心5min取上清，即为P2病毒贮液。4℃避光保存。长期保存分装冻存于-80℃。 d. 制备了高效价的P2液后，按上述方法扩增P3贮液，用于高效表达。 三、病毒贮液初步鉴定 1. SDS-PAGE蛋白电泳：取P2或P3病毒贮液浓缩后上样（或直接上样）进行SDS-PAGE 蛋白电泳，初步根据分子量对表达蛋白进行鉴定。CAT-his融合蛋白分子量约为28KDa，nsp6-his融合蛋白分子量约为34KDa。 2. western blot：以小鼠抗his单克隆抗体鉴定在相应条带出是否有his标记。 3. 以CAT-ELISA检测试剂盒检测Bacmid/CAT对照的蛋白表达情况。方法详见CAT-ELISA 试剂和说明书。 结果 1. CAT-ELISA检测试剂盒成功检测出对照CAT质粒在细胞中的表达，同时可测于上清和细
应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白
应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白 Ξ 罗廷荣1 源宣之2 金城俊夫2(1 广西大学动物科技学院,南宁530005;2 日本岐阜大学农学部兽医公共卫生学研究室) 摘要 本试验利用杆状病毒载体成功地表达狂犬病病毒糖(G )蛋白。从转染重组了日本动物用狂犬病 病毒疫苗株RC HL 株G 蛋白基因的转移载体和野生型杆状病毒DNA 的Sf 9细胞中,分离出2个重组杆状病毒克隆。应用印渍法和荧光抗体法(IFA )从重组杆状病毒感染的Sf 9细胞检出了狂犬病毒G 蛋白。Sf 9细胞表达的G 蛋白与狂犬病毒RC HL 株感染NA 细胞的G 蛋白的分子量一致。35个抗RC HL 株G 蛋白的单克隆抗体均与重组杆状病毒感染的Sf 9细胞反应,表明表达的G 蛋白的抗原性没有发生变异。表达的G 蛋白主要分布在Sf 9细胞的膜表面,形成类似环状的荧光,这种荧光与RC HL 株感染的NA 细胞的荧光相同。 关键词 狂犬病病毒;糖蛋白;重组杆状病毒 中图分类号 S 852165911;S 8521655 Expression of Glycoprote i n of Rab ies V irus Usi ng Baculov irus Vector L uo T ingrong 1 M inam o to N obuyuk i 2 K in jo To sh i o 2(1 Co llege of A n i m al Sciences and T echno logy ,Guangx i U n iv .,N ann ing 530005 2D ep artm en t of V eterinary Pub lic H ealth ,Facu lty of A gricu ltu re ,Gifu U n iversity ,Japan )Abstract In th is exp eri m en t w e have successfu lly exp ressed rab ies vivu s glycop ro tein (G p ro tein )u sing bacu loviru s vecto r .Tw o clones of recom b inan t bacu loviru s w ere iso lated from Sf 9cells ,in w h ich w as tran sfeted w ith DNA of w ild typ e bacu loviru s and bacu loviru s tran sfer vecto r in 2serted G p ro tein gene of RC HL strain u sed fo r p roducti on of an i m als rab ies vaccine in Japan .B y u s 2ing w estern b lo t and indirect i m m unofluo rescen t assay (IFA ),the G p ro tein of rab ies viru s w as detect 2ed from Sf 9cells w h ich w ere infected w ith recom b inan t bacu loviru s .T he G p ro tein in Sf 9cells ex 2p ressed by recom b inan t bacu loviru s show ed iden tical m o lecu lar w eigh t w ith that in NA cells infected w ith RC HL strain of rab ies vru s .T h irty five m onoclonal an tibodies (M A b s )again st G p ro tein of RC HL strain reacted w ith G p ro tein on the Sf 9cells infected w ith recom b inan t bacu loviru s ,indi 2 cating that an tigen ic variati on of the exp ressed G p ro tein has no t been found .M ajo rity of the exp ressed G p ro tein ex ists on the su rface of Sf 9cells ,fluo rescence of the Sf 9cells fo r m ed a ring like w hen it infected w ith recom b inan t bacu loviru s and w as dyed by IFA .T h is k ind of fluo rescence on the Sf 9cells w as the sam e as that on NA cells infected w ith RC HL strain of rab ies viru s u sing IFA . Key works rab ies viru s ;G p ro tein ;recom b inan t bacu loviru s 狂犬病毒的糖(G )蛋白有多种功能:刺激中和抗体的产生而诱导免疫保护、细胞融合性、与细胞表面受体结合、血球凝集和免疫溶解。近年来,根据不同的目的,狂犬病毒的G 蛋白基因已在不同的载体系统被表达,其中包括大肠杆菌系统、酵母系统、禽痘病毒和牛痘病毒载体系统。引人注目的是,第18卷 第4期V o l 118N o 14广西农业生物科学Journal of Guangxi A gric .and B i o l .Science 1999年12月 D ec .1999 Ξ第一作者:男,1962年生,博士,副教授。 收稿日期:19990402
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统
Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 试剂盒内容物： Introduction： Overview： Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位点特意转座子的表达框的质粒在Ecoli中扩增。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。 *一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅助质粒，在转染pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。 *一个控制表达的质粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染细胞后产生重组杆状病毒，表达β-葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。 Bac-to-Bac表达系统的优点： 使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点： *与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒少于两周 *减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率 *可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白 选择pFastBac菌体（Vector）： 大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。
指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提供指导： 1、克隆目的基因到pFastBac TM供体质粒的选择 2、转化pFastBac TM 结构到最高效的DH10Bac TM产生重组质粒 3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒 4、扩增滴定（Amplify and titer）杆状病毒株，使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白 重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。 Bac-to-Bac表达系统 表达系统的成分： 表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于Luckow1993年的方法，此系统利用了位点特意的专座子Tn7区简化和提高重组质粒DNA *系统的第一个成分是用来克隆目的基因的pFastBac TM菌株。基于pFastBac TM菌株的选择，表达基因被AcMNPV的PH或p10启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被Tn7 的左右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成一个微型的Tn7 *第二个主要结构是Ecoli的DH10Bac TM品系，用来作为pFastBac TM菌株的宿主。DH10Bac TM细胞包含带有微型-attTn7靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文）。一旦pFastBac TM表达质粒转入DH10Bac细胞，转化就会发生在pFastBac TM菌株的微型Tn7单位和微型-attTn7的靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。 如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组质粒DNA并将质粒DNA转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒，用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高效价的病毒株可以用来感染细胞，进行大规模的重组蛋白的表达。 杆状病毒菌株： 病毒菌株（杆粒），bMON14272(136KB)，在DH10Bac Ecoli中包括： *一个低拷贝的微型F复制子 *卡那霉素的抗性标记 *一个来自于pUC载体的编码LacZa肽的DNA片段，用来接触病毒转座子，Tn7（微型attTn7）已经被插入。插入的微型attTn7不会中断LacZa肽的阅读框。 杆粒在具有卡那抗性的大的质粒Ecoli DH10Bac中扩增，在显色物质如Bluo-gal 或X-gal和诱导剂IPTG 存在时，能补充染色体LacZ的缺失形成蓝斑（LacZ+） 辅助质粒：DH10Bac Ecoli也包含辅助质粒，pMON7124(13.2kb)，他编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供Tn7 转化功能。 图示Bac-toBac系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的基因的表达
2021年杆状病毒介绍
杆状病毒 欧阳光明（2021.03.07） 关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒 杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。核型多角体病毒有两种形式： 一种为包含体病毒(occluded virus，OV)， 另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。 它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒
的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该病毒是杆状病毒科Baculoviridae的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA 病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。本文主要介绍AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。 AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA 合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成