宏基因组实验计划

宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划

起草人：李浩宇

宏基因组学研究方向及意义

研究：环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。

发掘：环境应激和应答基因的多态性。

探究：多态性基因的功能。

实验大体步骤：

I.环境样品的采集：

1）避免人源污染，采样的器具都要高温灭菌，采样过程中要戴手套。

2）样品的迅速处理保存。有条件最好用液氮冷冻运输，没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品，迅速用预冷缓冲液(多为PBS)重悬，离心收集沉淀。分装成小份，冻存于液氮或者‐80 ℃冰箱中，避免反复冻融。

3）如果后续用间接法提取总DNA 的话，此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，一般适用于水样。

II.DNA提取方法的选择：

总DNA 的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。

直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA。

间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。

直接提取法的优缺点：直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等) 总DNA 的试验中。其最大的优点在于得率高，在某些环境样品总DNA 提取实例中，比间接提取法高数倍至数百倍。造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DNA；二是许多微生物与基质形成复杂的结构，间接提取法不易对其进行分离。在样品较珍贵时多采用此法。其缺点同样明显，所得DNA 的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保留下来，使得所得DNA 呈现黄褐色甚至黑色。

可以考虑MoBio 和Epicentre的DNA提取的商业试剂盒(主要用于提取土壤样品)。

间接提取法的优缺点：间接提取法则既可以用来提取固相样品总DNA 也可以用来提取液体样品总DNA。在提取液体样品(如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤的方式浓缩。与直接提取法刚好相反，其最大的优点在于提取DNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DNA 时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。其缺点是DNA 得率低。

土壤DNA 直接提取法：

(1) 从超低温冰箱中取出保存样品(5 g)；

(2) 于室温融化；

(3) 加入13.5 ml CTAB 抽提缓冲液和50 μl 蛋白酶K 贮存液；

(4) 离心管于37oC 225 rpm 水平振荡30 min；

(5) 加入1.5 mL20%SDS；

(6) 65oC 水浴2 h，每隔15 min 轻轻颠倒数次；

(7) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，转移至一个新的50 ml 离心管中；

(8) 沉淀中再加入4.5 ml 提取液和0.5 ml 20%SDS，轻轻涡旋至混匀；

(9) 浸入液氮中冷冻3 min 后，于沸水中煮沸3 min；

(10) 室温6,000g 离心10 min，收集上清液，与上次上清液合并；

(11) 重复(8)、(9)、(10)一次；

(12) 将三次提取所获上清液与等体积的苯酚：氯仿(1:1 v/v) 混合，摇匀后于4 ℃12,000g 离心10 min；

(13) 将上层水相转移至一新的50 ml 离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，混匀后于4 ℃12,000g 离心10 min；

(14) 再次转移上清至一新的离心管中，加入0.6 倍体积的异丙醇于室温沉淀1 h；

(15) 室温12,000g 离心20 min；

(16) 收集沉淀，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；

(17) 向离心管中加入1 ml TE，于4 ℃放置过夜，分装保存于‐20 ℃。

实验过程中的注意事项及一些技巧：

(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔，避免剧烈震荡(试剂盒提取除外)。

(2) 用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉，避免机械剪切。

(3)酚氯仿抽提时，中间相一定不要吸到，宁可多丢弃一些。

(4) 异丙醇沉淀时不要放在低温，0.7 倍体积室温沉淀足够了。

(5) DNA 溶解时可以放在4℃静置过夜，次日离心取上清去除多余杂质。

(6) 水平震荡可以用左右摇晃的震荡器。

水样DNA 间接提取法：

(1)抽滤的方式浓缩采集到的水样。

(2)采取差速离心取得水样中的菌体。

(3)取得微生物后进行裂解提取。

此方法还在查证中，具体前期对样品的处理方法还在整理中。

例如：用多少的水样进行浓缩，差速离心的转速选择。

会不会有DNA的丢失等等。

Epicentre推出了宏基因组DNA分离试剂盒（Metagenomic DNA Isolation Kit for Water）,能从水样中分离已随机剪切的，可直接用于fosmid克隆的DNA片段。

此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物（包括革兰氏阳性菌）中提取40kb大小的DNA。提取的DNA可立即进行末端修复，并在乙醇沉淀洗涤后克隆到Epicentre的PCC1FOS 载体上。

优势：

1.无需化学剪切，琼脂糖块或大小选择。

2.无需纯化柱或酚/氯仿提取。

3.产量更高，从低丰度的微生物中回收DNA的概率更大。

4.Fosmid载体与DNA的克隆只需要90分钟。

下图为方法与流程：

粗提DNA 的纯化

采用直接提取法提取的总DNA 或多或少都含有腐殖质的存在。它的存在对后续的分子生物学操作会有影响，时常会导致PCR 扩增不出来，酶切困难，连接转化率低。需要进行纯化。纯化的方法包括：胶回收，柱纯化，电泳/电洗脱，梯度离心。

a 胶回收

胶回收最大的优点在于快捷，可以在很短的时间内完成。纯化后的DNA 往往能够满足PCR 要求。但其缺点在于，膜截留式的纯化方式难免会对DNA 分子造成机械损伤，使得DNA 弥散，完整度下降。如果后续的实验室分析16S r DNA，则这种纯化方式不失为一种好方法。

b 柱纯化

柱纯化相对于胶回收来说更为快速，十几分钟内可完成。与胶回收相比，其纯化效果要差一些。但通常情况下，纯化之后的DNA 也能够满足PCR 需求。这种方法也会造成DNA 分子的机械损伤，使得DNA 弥散，完整度下降。

c 电泳/电洗脱

电泳/电洗脱法相对于前两种有很多优点：其一，其价格低；其二，整个过程都很温和，能够保证DNA 的完整性；其三，纯化后的DNA 纯度较之前两种要好一些。但是其亦有些许不便：其一，过程耗时长，包括透析袋的准备，电洗脱，洗脱液的浓缩等；其二，DNA 损失量较前两种大，透析袋上会残留DNA。如果样品不是很珍贵，并且后续要进行Metagenomic 研究，这种方法不失为一种好方法。如果有脉冲场凝胶电泳系统，用此方法可以得到高纯大片段DNA，可以满足后续的metagenomic C/Fosmid 文库构建。

d 蔗糖/氯化铯密度梯度离心

如果实验室有超速离心机(100,000g 以上)，那么这种方法无疑也是一种好方法。与电泳电洗脱法相同，这种方法在连续介质中对DNA 及杂质进行分离，可以很好的纯化DNA。纯化得到的DNA 经过低熔点凝胶电泳切胶回收，可以得到高纯度大片段的DNA，可以满足后续的metagenomic C/Fosmid 文库构建。

纯化质量的检测

DNA 纯化完毕之后往往需要对纯化效果做一个初步的判断，主要包括两方面：其一，完整度判断；其二，纯度判断。

a 完整度判断

完整度判断同前所述，千万要记得的是加纯化之前的DNA 样品做对照。结果可以告诉我们纯化得率及完整度。同样，最好能跑脉冲场凝胶电泳。

b 纯度判断

纯度判断通常可以采用两种方法：分光光度计法和PCR 扩增法。分光光度计可以测定双链DNA 在260nm 处的吸收值及杂质在其他波长的吸收值。通过不同波长吸收值的比，可以对DNA 纯度做出判定。通常这种方法由于灵敏性较高，所以在存在杂质时误差较大。

III. 所提DNA 完整性检测

DNA 的完整性主要采用普通琼脂糖凝胶电泳进行指示。最好采用0.8% 琼脂糖凝胶电泳，低电压长时间跑。至少要用lambda DNA/Hind III 做marker，如果在23 kb 处有一条完整或略拖尾的带，则证明DNA 完整性尚好。如有条件，可以采用脉冲场凝胶电泳对提取DNA 的完整度进行分析。用脉冲场凝胶电泳分析时，除了上面提及的那个maker，至少还应该有完整lambda DNA (约48 kb)充当另一个maker。

以上为送测序前样品的采集，DNA的提取，验证等前期处理与方法的大致步骤与方法。

Illumina所进行的测序是由Genome Analyzer测序仪所完成的：

以上为Genome Analyzer技术的基本原理IV.在DNA提取，检验完成后送BGI进行后续测序。