氨基酸分析
2.2.56氨基酸分析（1）（见注解）
氨基酸分析是指利用方法对蛋白质，多肽和其他药物制剂进行氨基酸组成或含量的分析。蛋白质和多肽一般是氨基酸残基以共价键的形式组成的线性大分子。蛋白质或多肽中氨基酸的序列决定了其分子的性质。蛋白质普遍是由大分子以折叠的方式形成的特定构象，而多肽则比较小，可能只有几个氨基酸组成。氨基酸分析方法可以用于对蛋白质和多肽的量化，基于氨基酸的组成来确定蛋白质或多肽的类型，支撑蛋白质和多肽的结构分析，评估碎片肽段，并检测可能存在于蛋白质或多肽中的不规则氨基酸。并且在氨基酸分析之前必须进行将蛋白质或多肽水解为个别氨基酸。伴随着蛋白质或多肽的水解，氨基酸分析的过程和其他药物制剂中氨基酸的游离是一致的。通常我们采用易于分析的方法来测定样品中的氨基酸成分。
设备
用于氨基酸分析方法通常是基于色谱分离氨基酸的方法设定的。当前的方法是利用自动化色谱仪进行分析。氨基酸分析仪通常是一个能够产生梯度的低压或高压的液相色谱仪，并在色谱柱上分离氨基酸。除非样品在柱前进行了衍生化，否则这些仪器必须具备柱后衍生化的能力。检测器使用的是紫外可见光检测器或荧光检测器。此外，还需具有一个记录仪器（例如，积分仪），用于转化检测到的信号及用于定量测定。而且，这些仪器是专门用于氨基酸分析使用的。
一般预防策施
在氨基酸分析中，分析师关注的一个重点是背景的污染。高纯度的试剂是必要的（例如，低纯度的盐酸的使用在分析中会产生甘氨酸污染）。分析试剂通常是每隔几周更换一次，并且仅使用HPLC级别的溶剂。所用试剂使用之前必须用过滤器将溶剂中可能潜在的微生物和外来材料污染过滤除去，保持溶剂贮存器出于密封状态，并且不可将氨基酸分析仪放置于光照条件下。
实验室的操作规范决定了氨基酸分析的质量。仪器应放置在实验室的空旷区域。保持实验室的卫生干净。根据维修计划，及时清洁和校准移液管，将移液吸头放置在相应的盒子中，分析师不得用手处理移液管。分析师需要穿戴一次性的乳胶手套或同等质量的其他手套。限制测试样品瓶开启和关闭的次数，因为飞灰可以提高甘氨酸，丝氨酸和丙氨酸的浓度。
良好的仪器状态是氨基酸分析结果可接受的一个关键步骤。在日常使
用过程中，必须每天检查是否漏液、检测器和灯的稳定，色谱柱分离个别氨基酸的能力。定期清洗或更换所有仪器的过滤器和其他需要维修的项目。
参考标准物质
氨基酸分析的可接受标准是商业上可用，通常是包含一水化合物的氨基酸。在确定氨基酸组成时，蛋白质或多肽的标准进行材料的分析与控制作为验证整个过程的完整性。高纯度的牛血清白蛋白可用作蛋白质标准。
仪器的校准
氨基酸分析仪的校准通常包括氨基酸的分析标准：如混合氨基酸的浓度，确定影响因子和每个氨基酸的检测范围。每个氨基酸的标准浓度都是已知的。在校准时，分析师将氨基酸标准物在预期的线性水平条件下稀释至几个不同的分析浓度。然后，重复检测可以分析的每个检测浓度。每个获得的氨基酸峰面积和已知浓度的标准物质浓度进行线性绘图。所得的结果显示给定氨基酸的峰面积和浓度呈线性关系从而帮助分析师确定氨基酸的浓度范围。分析师准备的氨基酸样品必须在分析范围内（例如，线性范围），以获得准确可重复的结果。
根据4-6个氨基酸标准水平，由标准每nmol氨基酸的平均峰面积或峰高计算每个氨基酸的响应因子。包含响应因子的校准文件是需要准备并使用在测试样品中每个氨基酸浓度的计算中。这个计算是通过给定nmol浓度氨基酸确定的相应因子分裂给定氨基酸的峰面积。常规分析中，单点校准可能已经足够，可是校准文件需要经常更新以及通过分析控制来测试样品，以确保它的完整性。
重复性
日立L-8900全自动氨基酸分析仪简易标准操作规程重点讲义资料
日立L-8900全自动氨基酸分析仪标准操作规程 一. 目的 为规范日立L-8900全自动氨基酸分析仪的基本操作、维护保养、异常处理程序，防止人为操作失误，确保氨基酸分析仪正常运转，特制定本程序。 二. 适用范围 本程序适用于日立L-8900全自动氨基酸分析仪。 三．责任 1. 本程序的实施者为氨基酸分析仪操作者，各实验室负责人对本程序的实施情况进行监 督。 2. 日常运行及维护、定期维护、定期点检及保养由氨基酸分析仪操作者负责。 四. 内容 1．联机 （1）打开电脑。 （2）打开L-8900主机电源。 （3）双击桌面的图标，进入1-1画面，双击图标，进入程序。 1-1 （4）在菜单栏中依次点击和，出现1-2画面，单击
联机。大约两分钟，初始化完毕。中Uninitialized 变成Idle，图1-2变成了图1-3，各个组件可以进行控制了。初始化完毕后，分离柱的温度逐渐上升，分离柱的温度会升到50℃。如果打开反应柱的柱温控制，则温度大约20分钟升到135℃。 1-2
1-3 2、手动各组件控制操作 （1）泵1和泵2 点击，出现2-1的画面。设置泵1，流量0.1ml/分钟，B6 100%。点击 打开泵1。泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。
2-1 点击，出现2-2的画面，设置泵2，流量0.1ml/分钟，R3 100%。点击 打开泵2。泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。 2-2 （2）自动进样器 点击，出现2-3的画面，设置Sampler Wash不少于3次。
2-3 （3）分离柱柱温箱 点击，出现2-4画面，设置柱温50℃，设置ON，打开柱温箱。柱温箱打开后，背景颜色由灰色变为黄色。 2-4 （4）反应柱柱温箱 点击，出现2-5画面，设置柱温135℃，设置ON，打开柱温箱。柱温箱打开后，背景颜色由灰色变为黄色。 2-5
技术标书(全自动氨基酸分析仪)
全自动氨基酸分析仪招标书（2010-11-2） （NSYB 10-09） 根据工作需要，上海交通大学农业与生物学院需要购置壹套全自动氨基酸分析仪，现将技术及商务要求列举如下。 1技术要求 1)应用： 用于实验室检测,农业育种,土壤中游离氨基酸分析等科研工作 2)技术指标及性能要求： * 1. 落地式，具有更强的功能，更好的性能，更少的故障率，更快捷的维护维修2. 功能 * 2.1.1 蛋白水解标准净分析时间：≤30分钟；快速分析：≤20分钟 快速生理体液分析时间≤70分钟 * 2.1.2 保留时间重现性：≤CV0.3% (精氨酸)Arg * 2.1.3 峰面积重现性：≤CV1.0%（甘氨酸，组氨酸）Gly-His * 2.1.4 检出限：3 pmol（信噪比=2，天冬氨酸）Asp 2.2 氨基酸分析仪主机 * 2.2.1 分析柱：4.6mm × 60mm，3 μm专用离子交换树脂 2.2.2 进样泵：压力：0~ 20Mpa 流速：0.000~ 0.999mL/min (增量：0.001ml/min) 2.2.3 标配漏液传感器、在线脱气装置 2.2.4 含制冷单元的自动进样器： 进样方式：直接进样样品容器体积：1500μL 样品瓶数量：200个进样量：0.1~ 100μL * 2.2.4 反应单元：采用反应柱技术 反应柱规格：4.6mm ID × 40mm 温度设定：50~ 140℃ * 2.2.6 采用氨氮排除技术，可令结果更准确，图谱更清晰。 2.2.7柱温箱方式：半导体制冷加热温度设定：20~ 85℃ 2.2.8分光光度计:凹面衍射光栅闪跃波长：570nm，440nm (700nm参比) 2.3 数据分析管理系统
四种常见蛋中的氨基酸成分对比分析
四种常见蛋中的氨基酸成分对比分析 陈巧玲,郑艺梅，王兵丽，张泽宏 （闽南师范大学生物科学与技术学院，福建漳州 363000） 摘要：采用氨基酸自动分析仪检测样品，得出土鸡蛋、鸭蛋、皮蛋、洋鸡蛋均含有17种水解氨基酸。必须氨基酸与总氨基酸比值为鸭蛋%>洋鸡蛋%>土鸡蛋%>皮蛋%，必须氨基酸与非必须氨基酸的比值为鸭蛋>洋鸡蛋>土鸡蛋>皮蛋。根据FAO/WHO 提出的理想蛋白质条件，可知这四种蛋品均属于理想蛋白质范畴。氨基酸总含量分别为土鸡蛋%>鸭蛋%>洋鸡蛋%>皮蛋%。鸭蛋、皮蛋、土鸡蛋、洋鸡蛋的第一限制氨基酸分别为苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸、缬氨酸。因此根据分析结果，可以在日常饮食中根据食物的优缺点合理搭配饮食，实现营养最大化。 关键词：蛋；氨基酸；营养分析 Determination of amino acid in four kinds of eggs using amino acid analyzer CHEN Qiao-ling, ZHENG Yi-mei, Wang Bi-li, ZHANG Ze-hong (School of Biological Science And Biotechnology, MinNan Normal University，Zhangzhou 363000, Fujian China) Abstract:This paper finded out that 17 kinds of amino acid were content in the four kinds of eggs by using amino acid auto-analyzer. Essential amino acid /Total amino acid of this four kinds of eggs were duck eggs %>eggs %>farm eggs %>preserved % and the essential amino acid /nonessential amino acids of this four kinds of eggs were duck eggs >eggs >farm eggs >preserved eggs high quality?protein as their essential amino acid /Total amino acid and essential amino acid /nonessential amino acids numerical value close to the reference value of WHO/FAO model. The total content of amino acid were duck eggs % >eggs % >farm eggs % >preserved eggs %. The first limiting amino acids of duck eggs\ preserved eggs\ farm eggs\ eggs were threonine\ isoleucine\ methionine& cysteine\ valine.
日立L-8900全自动氨基酸分析仪简易标准操作规程
日立L-8900全自动氨基酸分析仪简易标准操作规程 -CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
日立L-8900全自动氨基酸分析仪标准操作规程 一. 目的 为规范日立L-8900全自动氨基酸分析仪的基本操作、维护保养、异常处理程序，防止人为操作失误，确保氨基酸分析仪正常运转，特制定本程序。 二.适用范围 本程序适用于日立L-8900全自动氨基酸分析仪。 三．责任 1. 本程序的实施者为氨基酸分析仪操作者，各实验室负责人对本程序的实施情况进行监 督。 2. 日常运行及维护、定期维护、定期点检及保养由氨基酸分析仪操作者负责。 四. 内容 1．联机 （1）打开电脑。 （2）打开L-8900主机电源。 （3）双击桌面的图标，进入1-1画面，双击图标，进入程序。 1-1
（4）在菜单栏中依次点击和，出现1-2画面，单击 联机。大约两分钟，初始化完毕。中Uninitialized 变成Idle，图1-2变成了图1-3，各个组件可以进行控制了。初始化完毕后，分离柱的温度逐渐上升，分离柱的温度会升到50℃。如果打开反应柱的柱温控制，则温度大约20分钟升到135℃。 1-2
1-3 2、手动各组件控制操作 （1）泵1和泵2 点击，出现2-1的画面。设置泵1，流量分钟，B6 100%。点击 打开泵1。泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。
2-1 点击，出现2-2的画面，设置泵2，流量分钟，R3 100%。点击 打开泵2。泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。 2-2 （2）自动进样器 点击，出现2-3的画面，设置Sampler Wash不少于3次。
氨基酸自动分析仪
氨基酸自动分析仪 1.实验目的 ①了解氨基酸自动分析仪的分析原理； ②掌握氨基酸自动分析仪的操作技巧。 2.实验原理 测定原理是利用样品各种氨基酸组分的结构不同、酸碱性、极性及分子大小不同，在阳离子交换柱上将它们分离，采用不同pH值离子浓度的缓冲液将各氨基酸组分依次洗脱下来，再逐个以另一流路的茚酮试剂混合，然后共同流至螺旋反应管中，于一定温度下（通常为115～120℃）进行显色反应，形成在570nm有最大吸收的蓝紫色产物。其中的羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色产物，其最大吸收在440nm。这些有色产物对570nm、440nm光的吸收强度与洗脱出来的各氨基酸的浓度（或含量）之间的关系符合比耳定律，可与标准氨基酸比较作定性和定量测定。 3.实验仪器与耗材 实验仪器： 耗材： 4．实验步骤 ①样品处理： 测定样品中各种游离氨基酸含量，可以除去脂肪杂质后，直接上柱进行分析。 测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解，使蛋白质完全变成氨基酸后才上柱进行分析。 ②样品分析：经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量根据所用自动分析仪的灵 敏度来确定。一般为每种氨基酸0.1μmol 左右（水解样品干重为0.3mg 左右）。测定必须在pH5～5.5、100℃下进行，反应进行时间为10～15min，生成的紫色物质在570nm 波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在440nm 波长下进行比色测定。做一个氨基酸全分析
一般只需1h 左右，同时可将几十个样品一起装入仪器，自动按序分析，最后自动计算给出精确的数据。仪器精确度在±1～3%。用阳离子交换柱分离及测定氨基酸所的如下图 自动分析仪氨基酸分离图谱 5.结果计算 带有数据处理机的仪器，各种氨基酸的定量结果能自动打印出来，否则，可用尺子测量峰高或用峰高乘以半峰宽确定峰面积进而计算出氨基酸的精确含量。另外，根据峰出现的时间可以确定氨基酸的种类。 6.说明 ①显色反应用的茚三酮试剂，随着时间推移发色率会降低，故在较长时间测样过程中应随时采用已知浓度的氨基酸标准溶液上柱测定以检验其变化情况。 ②近年出现的采用反相色谱原理制造的氨基酸分析仪，可使蛋白质水解出的17 种氨基酸在12min 内完成分离，且具有灵敏度高（最小检出量可达1pmol）、重现性好以及一机多用等优点。
氨基酸序列推导
氨基酸序列推导 1.请指出天冬氨酸分别在（1）pH 1.0, (2)pH 3.0 ,(3) pH 6.0 ,(4) pH 11.0 时占优势的净电荷形 式（分别用“+”“-”“0”表示）。 2.将含有Gly, Ala , Glu ,Lys ,Arg , His 的溶液点在滤纸条的中央，用 pH 6的缓冲液浸湿，放入 电场中，请问（1）哪些氨基酸移向正极？（2）哪些氨基酸移向负极？（3）哪些氨基酸停留在原处或接近原处？ 3.下述每组混合物分别在正丁醇-醋酸-水系统进行纸层析，指出每组中各组分的相对迁移率（假定水 相的pH 为4.5 ，用“ >”表示）：（1）.Val和Lys,(2).Phe 和Ser,(3).Ala、Val和 Leu, (4).Tyr、Ala 、Ser和 His 。 4.将含有Asp (pI=2.98),Gly (pI= 5.97),Thr (pI= 6.7),Lys (pI=9.74)的pH为3.0 的柠檬酸溶液， 加到预先用相同缓冲液平衡过的阳离子交换树脂柱上，随后用逐渐增加NaCl浓度的相同缓冲液洗脱，问这四种氨基酸的洗脱顺序？ 5.将Lys ,Arg ,Asp ,Glu ,Tyr ,Ala的混合溶液在高pH 时，加到阴离子交换树脂柱上，用连续递减 pH值的溶液洗脱，请预测这些氨基酸的洗脱顺序。 6.已知一个八肽的氨基酸组成为：Asp, Ser ,Gly ,Ala ,Met ,Phe 和Lys2 ，又作了一系列分析结果 如下：（1）FDNB反应后可得到DNP-Ala,(2)胰凝乳蛋白酶水解后，得到一个四肽，其组成为：Asp, Gly, Lys, Met，此四肽的FDNB反应后得到DNP-Gly。（3）胰蛋白酶水解该八肽后得到两个三肽和一个二肽，三肽的组成分别为：Lys , Ala ,Ser和Phe , Lys , Gly。二肽经CNBr处理后产生Asp。请写出该八肽的氨基酸顺序。 7.某肽经CNBr处理得到三个肽段，其顺序分别为：Asn-Trp-Gly-Met; Gly-Ala-Leu; Ala-Arg-Tyr-Asn-Met, 用胰凝乳蛋白酶水解此肽也得到三个片断，其中一个为四肽，用6N的盐酸水解此四肽只得到Asp2和Met,问此肽的氨基酸排列顺序？ 8.根据下列数据推导出氨基酸的顺序：（1）完全水解得到Phe, Pro, Glu , Lys2, Met 。（2）用FDNB 处理得到DNP-Phe。（3）CNBr处理得到一个两肽和一个四肽。（4）胰蛋白酶水解得到两个三肽。（5）羧肽酶A或羧肽酶B处理都不能得到阳性结果。 9.一个由Ala, Cys, Lys, Phe和Ser组成的五肽，用TIPC分析，得到PTH-Ser；用胰蛋白酶水解得到 一个N端为Cys的三肽和一个N端为Ser的二肽；用胰凝乳蛋白酶水解上述三肽生成Ala 和一个二肽，写出该五肽的顺序。 10.从以下资料推出五肽的氨基酸序列：（1）含有Phe , Pro , Glu , Lys2（2）Edman 试剂处理得到 PTH-Glu （3）用胰蛋白酶、羧肽酶A和羧肽酶B处理都不能得到阳性结果。 1.（1）pH 1.0, +1；(2)pH 3.0 , 0；(3) pH 6.0, -1 ； (4) pH 11.0，-2 2. Glu 移向正极；Gly, Ala接近原处；Lys ,Arg , His移向负极 3. Val > Lys, (2).Phe > Ser,(3) Leu > Val > Ala,(4).Tyr > Ala > Ser > His 4. Asp、 Gly 、Thr、 Lys 5. Arg ,Lys , Ala ，Tyr , Glu ,Asp , 6. Ala-Ser-Lys-Phe-Gly-Lys- Met-Asp 7. Ala-Arg-Tyr-Asn-Met-Asn-Trp-Gly-Met-Gly-Ala-Leu; 8. 任一答案： Phe-Met-Lys-Glu-Lys-Pro Phe-Met-Lys-Glu-Pro-Lys Phe-Glu-Lys-Met-Pro-Lys Phe-Glu-Lys-Met-Lys-Pro 9. Ser-Lys-Cys-Phe-Ala,
18种天然氨基酸分析
18种天然氨基酸分析 迪马科技摘要 氨基酸组成测定是蛋白质组学、食品质量检测以及药品质量检测中的重要分析项目。本文分别以异硫氰酸苯酯、2,4-二硝基氟苯作为衍生剂对蛋白质水解液和游离氨基酸注射液进行衍生，使用Diamonsil AAA柱250×4.6 mm，5 μm，梯度洗脱进行分离，能够满足19种天然氨基酸的分析，各组分分离度较高、定量结果准确而稳定。 Abstract The amino acid determination is an important analysis project in proteomics, food and drug quality testing.The method determination of 19 nature amino acid in protein hydrolyzed solution and free amino acid injection, the derived reagent is phenyl isothiocyanate (PITC) and 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene. The column is Diamonsil AAA (250 × 4.6 mm, 5 μm), gradient elution, the results are accurate and stable. 引言 从化学角度讲，同时含有一个或多个氨基和羧基的脂肪酸均可称为氨基酸。自然界存在300多种氨基酸，但构成天然蛋白质的氨基酸只有20种，这20种氨基酸又称为天然氨基酸。天然氨基酸分析是食品、饲料和药品分析的重要项目。目前氨基酸分析常常采用这样两种方式：离子交换色谱分离-柱后衍生和柱前衍生-反相色谱法分离。后者以操作灵活、费用低廉而被广泛应用。在柱前衍生-反相色谱法分离中，异硫氰酸苯酯(PITC)和2,4-二硝基氟苯(DNFB)均可与一级胺、二级胺反应，是理想的柱前衍生剂。尽管天然氨基酸多达20种，但由于蛋白质水解过程中天冬酰胺和谷氨酰胺分别转化为天冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸则以胱氨酸形式存在，因而对于含蛋白食品、饲料等样品的氨基酸分析时，只需分析Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Cys-Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种氨基酸，PITC和DNFB均能与这些氨基酸生成稳定的衍生物。此外，DNFB还能对半胱氨酸进行衍生，对PITC衍生法是一个重要的补充，能够满足氨基酸注射液中涉及的19种氨基酸分析。 1 分析原理 对于含蛋白样品(饲料、动物组织等)，先对样品进行酸水解或碱水解处理，得到游离氨基酸
重组蛋白药物C末端不同长度氨基酸序列的质谱
★论著★ 重组蛋白药物C末端不同长度氨基酸序列的质谱分析* 李萍，赵永强，薛燕，刘锋，刘炳玉，何昆，王红霞 （国家生物医学分析中心，北京100850） 摘要目的：基于本实验室已建立的溴化氰裂解蛋白质C末端方法结合优化后的质谱检测技术，对C末端长度分别为2 37个氨基酸，相对分子质量在200 5000的8个重组蛋白药物进行检测。方法：（1）针对重组蛋白药物的不同状态（SDS－PAGE、干粉或溶液）分别进行C末端胶内或溶液裂解；（2）质谱检测，正离子方式，雾化气为氮气，碰撞气体为氩气。源温80?，锥孔电压50V，MCP检测器电压为2.15kV。结果：8个重组蛋白药物的C末端全部成功检测出，且基本为基峰。结论：建立的重组蛋白药物C末端测序联用方法应用于实际药物的检测具有很高的实用价值和学术意义。 关键词：溴化氰裂解；ESI－MS/MS质谱技术；C末端测序 中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：0254－1793（2011）06－1003－05 Mass spectrometry analysis of recombinant protein drugs with C－terminal amino acid sequence of different lengths* LI Ping，ZHAO Yong－qiang，XUE Yan，LIU Feng，LIU Bing－yu，HE Kun，WANG Hong－xia （National Center of Biomedical Analysis，Beijing100850，China） Abstract Objective：Based on the method established by cyanogen bromide cleavage of proteins C－terminal com-bined with the optimized mass spectrometry in our laboratory，detection of C－terminal lengths of2to37amino acids，relative molecular mass200－5000of the8recombinant protein drugs．Methods：（1）For different states of recombinant protein drugs（SDS－PAGE，dry powder or solution）to C terminal cleavage in gel or solution，respec-tively．（2）Mass spectrometry detection，positive ion mode，atomization gas was nitrogen，collision gas was argon，source temperature80?，cone voltage50V，MCP detector voltage of2.15kV．Results：All of C－terminal of the8 recombinant protein drugs successfully detected as the base peak．Conclusions：The established C－terminal se-quencing method of the recombinant protein was applied to the actual drugs testing，have high practical value and academic significance． Key words：cyanogen bromide cleavage；ESI－MS/MS technique；C－terminal sequenceing 随着基因工程和重组蛋白药物工程的发展，越来越多的重组蛋白药物不断研发并走向市场。为保证重组蛋白药物的质量，对数据的严谨性和涵盖范围的要求不断提高，国家食品药品监督管理局规定：重组蛋白药物报批必须提供包括N端、C末端、二硫键、肽质量指纹谱等有关一级结构确证的数据［1］。根据国内外文献报道，目前重组蛋白药物C末端测序方法主要有羧肽酶法、溴化氢裂解+羧肽酶法、化学法和串联质谱法，每种方法都有其局限性。迄今为止，重组蛋白药物C末端测序方法还没有成熟的，能够广泛应用的方法［2，3］。这为重组药物的报批带来了很大的困扰，因此建立重组蛋白药物C末端测序方法并应用于实际药物的检测中具有很高的实用价值和学术意义。 基于本实验室已建立的溴化氰裂解蛋白质C 末端方法结合优化后的质谱检测技术，克服电喷雾串联质谱对相对分子质量＜400或＞3000的肽段不易检测到或测序效果不好的缺陷，对C末端长度分 — 3001 — 药物分析杂志Chin J Pharm Anal2011，31（6）*科技重大专项－重大新药创制（批准号：2009ZX09501－031）资助项目第一作者Tel：（010）66931434；E－mail：lp@proteomics．cn
氨基酸含量分析法
新增附录 附录XX 氨基酸分析法 氨基酸分析法是指用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法。 根据氨基酸组成分析可以对蛋白质及肽进行鉴别，氨基酸分析法可用于确定蛋白质、肽及氨基酸的含量，及测定可能存在于蛋白质及肽中的非典型氨基酸。进行氨基酸分析前，必须将蛋白质及肽水解成单个氨基酸，具体水解方法由各品种项下规定。蛋白质及肽水解后，其氨基酸分析过程与用于其他药物制剂中游离氨基酸的分析过程相同。 本法包括四种柱前衍生法，分别为异硫氰酸苯酯（PITC）法、6-氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯（AQC）法、邻苯二醛（OPA）和9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC）法、2，4-二硝基氟苯（DNFB）法，以及一种茚三酮柱后衍生法。不同的品种应针对自身所含的氨基酸种类及各氨基酸的含量选择适宜的氨基酸分析方法并做相应的方法学验证。 由于本法衍生过程中衍生溶液量较少，且容易挥发，外标法极易出现较大的误差，建议采用内标法进行测定，内标的确定由各品种项下规定。在本法中，由于半胱氨酸或胱氨酸的衍生产物不稳定，因此对于含半胱氨酸或胱氨酸的样品衍生后应尽快测定，或者在衍生前对半胱氨酸或胱氨酸进行适当的处理，使其转化为稳定地产物（如磺基丙氨酸或半胱氨酸-硫代丙酸）后再衍生测定，具体方法由各品种项下规定。在测定过程中，可根据所用的仪器、色谱柱品牌、色谱柱的长度及要分离的氨基酸种类，对流动相的有机溶剂和洗脱梯度作适当调整以获得较好的分离度。 第一法 PITC柱前衍生氨基酸分析法 本法系根据氨基酸与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成有紫外响应的氨基酸衍生物苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸经反相高效液相色谱分离后用紫外检测，在一定的范围内其吸光值与氨基酸浓度成正比。本方法的线性浓度范围为0.025～1.25μmol/ml。 试剂（1）流动相A 0.1mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。（2）流动相B 乙腈－水（8：2）。 对照品溶液按各品种项下规定的方法制备。 供试品溶液按各品种项下规定的方法制备。 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6×250mm，5μm）；流速为每分钟 1.0ml；柱温为40℃；检测波长为254nm。各氨基酸峰间的分离度均应大于1.0。洗脱梯度如下：
氨基酸分析
2.2.56氨基酸分析（1）（见注解） 氨基酸分析是指利用方法对蛋白质，多肽和其他药物制剂进行氨基酸组成或含量的分析。蛋白质和多肽一般是氨基酸残基以共价键的形式组成的线性大分子。蛋白质或多肽中氨基酸的序列决定了其分子的性质。蛋白质普遍是由大分子以折叠的方式形成的特定构象，而多肽则比较小，可能只有几个氨基酸组成。氨基酸分析方法可以用于对蛋白质和多肽的量化，基于氨基酸的组成来确定蛋白质或多肽的类型，支撑蛋白质和多肽的结构分析，评估碎片肽段，并检测可能存在于蛋白质或多肽中的不规则氨基酸。并且在氨基酸分析之前必须进行将蛋白质或多肽水解为个别氨基酸。伴随着蛋白质或多肽的水解，氨基酸分析的过程和其他药物制剂中氨基酸的游离是一致的。通常我们采用易于分析的方法来测定样品中的氨基酸成分。 设备 用于氨基酸分析方法通常是基于色谱分离氨基酸的方法设定的。当前的方法是利用自动化色谱仪进行分析。氨基酸分析仪通常是一个能够产生梯度的低压或高压的液相色谱仪，并在色谱柱上分离氨基酸。除非样品在柱前进行了衍生化，否则这些仪器必须具备柱后衍生化的能力。检测器使用的是紫外可见光检测器或荧光检测器。此外，还需具有一个记录仪器（例如，积分仪），用于转化检测到的信号及用于定量测定。而且，这些仪器是专门用于氨基酸分析使用的。 一般预防策施 在氨基酸分析中，分析师关注的一个重点是背景的污染。高纯度的试剂是必要的（例如，低纯度的盐酸的使用在分析中会产生甘氨酸污染）。分析试剂通常是每隔几周更换一次，并且仅使用HPLC级别的溶剂。所用试剂使用之前必须用过滤器将溶剂中可能潜在的微生物和外来材料污染过滤除去，保持溶剂贮存器出于密封状态，并且不可将氨基酸分析仪放置于光照条件下。 实验室的操作规范决定了氨基酸分析的质量。仪器应放置在实验室的空旷区域。保持实验室的卫生干净。根据维修计划，及时清洁和校准移液管，将移液吸头放置在相应的盒子中，分析师不得用手处理移液管。分析师需要穿戴一次性的乳胶手套或同等质量的其他手套。限制测试样品瓶开启和关闭的次数，因为飞灰可以提高甘氨酸，丝氨酸和丙氨酸的浓度。 良好的仪器状态是氨基酸分析结果可接受的一个关键步骤。在日常使
天津第三中心医院全自动氨基酸分析仪项目需求书
天津市第三中心医院全自动氨基酸分析仪项目需求书数量：一台 一、环境条件： 1.电源电压：220V±10%，50Hz。 2.温度：15～30℃。 3.湿度：25～85%。 二、全自动氨基酸分析仪功能要求及配置： （一）功能要求： 1.蛋白水解液及生理体液分析。 2.缓冲液、反应液试剂配方公开，可采用国产试剂。 3.色谱工作站，能够实现仪器的控制、数据采集和处理。能够实现系统的自动清洗，符合GLP/GMP规则，能够进行系统校验性试验、订制客户报告。 （二）配置要求： 1.蛋白水解液的标准分析系统。 2.生理体液分析系统。 3.色谱柱装填工具：1 套。 4.树脂。 5.光源灯：2个。 6.泵密封件：若干。 7.清洗密封件。 8.保护柱芯：若干。 9.电脑系统和打印机。 三、全自动氨基酸分析仪技术要求： （一）系统指标： 1.净分析时间：蛋白水解≤ 50 min； 生理体液90-180 min。 2.保留时间重现性：全部氨基酸平均≤0.5%CV。 3.峰面积重现性：全部氨基酸平均≤1.0%CV。 4.检测限：全部氨基酸平均≤10pmol。
5.分离度：平均≥1.2。 （二）分离柱:可自行填充。 1.柱温范围：室温～99℃。 2.温度稳定性：≤±1℃。 （三）自动进样器：带制冷单元。 1.进样体积：1～500 uL 2.样品位：≥80 （四）检测器： 1.检测波长：570nm，440nm。 2.反应器温度范围：40-140℃。 3.温度稳定性：≤±1℃。 （五）泵系统：具备梯度控制功能。 1.流速稳定性：RSD≤1.0%。 2.最大压力：≥19.6MPa。 3.压力波动≤0.1%。 （六）数据处理工作站： 1.硬件：CPU Pentium IV以上，内存≥1GB，硬盘≥120 GB，DVD刻录光驱，17寸液晶彩显。 2.操作系统：32位操作系统。 四、技术服务：在用户单位现场提供应用技术培训，符合用户指定安装，要求完善的售后服务，以确保临床使用。 五、售后服务：保修期两年，保证开机率95%以上（以365天计算），软件终身免费升级。提供10年以上备件供应。境内具备正规维修机构，出具相关法律文件。境内具备零备件保税库，出具相关法律文件。 六、投标价为免税美元价，按7.7比率折合人民币价格。
氨基酸分析仪实验指导
氨基酸分析仪实验 测试中心吕雪娟 一、实验目的 了解氨基酸分析仪的主要结构及工作原理，掌握氨基酸分析的过程，前处理方法。 二、原理 氨基酸分析仪的分析原理是基于各种a一氨基酸的酸碱性、极性及分子大小的差异，用阳离子交换树脂在柱上进行层析分离，用几种不同pH值和离子强度的缓冲溶液依次将它们洗脱，从柱子上分离和洗脱下来的各种氨基酸在反应柱中与茚三酮进行加热反应，反应产物用可见光分光光度计进行检测，根据检测信号的大小计算出各种氨基酸的含量。 氨基酸和茚三酮反应
氨基酸分析仪结构示意图 二、操作步骤 1.准备工作 1.1缓冲液和茚三酮溶液的配制及正确放置 1.2氮气压力调整 1.2.1打开氮气钢瓶阀，调节其压力至50－100KPa（0．5－1.0Kgf／cm2）。 1.2.2顺时针轻轻旋转氮气调节器，使压力读数为34-40KPa（0.35－0.4Kgf ／cm2）。 1.2.3脱气瓶中液体的更换 1.3放置自动进样器清洗瓶，向清洗瓶（C-1，1L）中盛上蒸馏水，放置于指定的位置并拧上盖子。 2.开稳压器 3.启动L－8800ASM应用程序 3.1系统初始化，OK 3.2打开Module Operation界面
3.3泵1流速设定----缓冲液的清洗，打开泵1的排液阀；清洗完毕，关闭泵1； 3.4泵2流速设定—一缓冲液的清洗，打开泵2的排液阀；清洗完毕关闭泵2； 3.5自动进样器流路和针头清洗,除气泡，重复此过程三次。 3.6泵的压力归零 4.分析程序 4.1选择应用程序 4.2选择分析方法 4.3输入待测样品的信息，编辑样品表，保存； 4.4打开数据采集监控画面 4.5选择样品表 4.6打开泵1和泵2 4.7按样品表顺序放置样品。 4.8单击监控屏幕下方的Start Series按钮，开始样品测试。 4.9开始结束后，关闭采集监控画面 4.10关闭L－8800ASM应用程序 4.11关电源 三、实验报告要求 1.实验原理及分析条件； 2.实验结果。
蛋白质序列分析常用网站-2018.8
蛋白质序列分析 蛋白质序列的基本性质分析是蛋白质序列分析的基本方面，一般包括蛋白质的氨基酸组成，分子质量，等电点，亲水性，和疏水性、信号肽，跨膜区及结构功能域的分析等到。蛋白质的很多功能特征可直接由分析其序列而获得。例如，疏水性图谱可通知来预测跨膜螺旋。同时，也有很多短片段被细胞用来将目的蛋白质向特定细胞器进行转移的靶标(其中最典型的例子是在羧基端含有KDEL序列特征的蛋白质将被引向内质网。WEB中有很多此类资源用于帮助预测蛋白质的功能。 基本理化性质分析： 信号肽预测： 在生物内，蛋白质的合成场所与功能场所常被一层或多层细胞膜所隔开，这样就涉及到蛋白质的转运。合成的蛋白质只有准确地定向运行才能保证生命活动的正常进行。一般来说，蛋白质的定位的信息存在于该蛋白质自身结构中，并通过与膜上特殊的受体相互作用而得以表达。在起始密码子之后，有一段编码疏水性氨基酸序列的RNA片段，这个氨基酸序列就这个氨基酸序列就是信号肽序列。含有信号肽的蛋白质一般都是分泌到细胞外，可能作为重要的细胞因子起作用，从而具有潜在的应用价值。 糖基化位点预测： 跨膜区分析：TMORED 蛋白质序列含有跨膜区提示它可能作为膜受体起作用，也可能是定位于膜的锚定蛋白或者离子通道蛋白等，从而，含有跨膜区的蛋白质往往和细胞的功能状态密切相关。 蛋白酶的结构功能进行预测和分析： 同源建模分析： 二级结构及折叠类预测：Predictprotein 特殊结构或结构预测：COILS MacStripe 疏水性分析：ExPASy的ProtScale 基于序列同源性分析的蛋白质功能预测： 至少有80个氨基酸长度范围内具有25%以上序列一致性才提示可能的显着性意义。类似于核酸序列同源性分析，用户直接将待分析的蛋白质序列输入NCBI/BLAST()，选择程序BLASTP就可网上分析。 基于motif、结构位点、结构功能域数据库的蛋白质功能预测 蛋白质的磷酸化与糖基化对蛋白质的功能影响很大，所以对其的分析也是生物信息学的一个部分。同时，分子进化方面的研究表明，蛋白质的不同区域具有不同的进化速率，一些氨基酸必须在进化过程中足够保守以实现蛋白质的功能。
氨基酸自动分析仪
氨基酸自动分析仪 氨基酸分析仪是进行氨基酸分离、衍生和检测的自动化分析系统，广泛用于制药、食品、饲料、农业、育种、医学研究、临床诊断和地质考察等领域。 仪器类别：仪器仪表 /成份分析仪器 /氨基酸分析仪 指标信息：分辨率：THR-Ser Ile-leu ≥98% 保留时间重现性：RSD≤0.5% (水解，所有峰) 峰面积重现性：RSD≤1% (水解，所有峰) 1．原理 测定原理是利用样品各种氨基酸组分的结构不同、酸碱性、极性及分子大小不同，在阳离子交换柱上将它们分离，采用不同pH值离子浓度的缓冲液将各氨基酸组分依次洗脱下来，再逐个以另一流路的茚酮试剂混合，然后共同流至螺旋反应管中，于一定温度下（通常为115～120℃）进行显色反应，形成在570nm 有最大吸收的蓝紫色产物。其中的羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色产物，其最大吸收在440nm。这些有色产物对570nm、440nm光的吸收强度与洗脱出来的各氨基酸的浓度（或含量）之间的关系符合比耳定律，可与标准氨基酸比较作定性和定量测定。
2．操作方法 ①样品处理： 测定样品中各种游离氨基酸含量，可以除去脂肪杂质后，直接上柱进行分析。 测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解，使蛋白质完全变成氨基酸后才上柱进行分析。 ②样品分析：经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量根据所用自动分析仪的灵 敏度来确定。一般为每种氨基酸0.1μmol 左右（水解样品干重为0.3mg 左右）。测定必须 在pH5～5.5、100℃下进行，反应进行时间为10～15min，生成的紫色物质在570nm 波长下 进行比色测定。而生成的黄色化合物在440nm 波长下进行比色测定。做一个氨基酸全分析 一般只需1h 左右，同时可将几十个样品一起装入仪器，自动按序分析，最后自动计算给出精确的数据。仪器精确度在±1～3%。用阳离子交换柱分离及测定氨基酸所的如下图 自动分析仪氨基酸分离图谱 3.结果计算 带有数据处理机的仪器，各种氨基酸的定量结果能自动打印出来，否则，可用尺子测量 峰高或用峰高乘以半峰宽确定峰面积进而计算出氨基酸的精确含量。另外，根据峰出现的时间可以确定氨基酸的种类。 4.说明 ①显色反应用的茚三酮试剂，随着时间推移发色率会降低，故在较长时间测样过程中应随时采用已知浓度的氨基酸标准溶液上柱测定以检验其变化情况。 ②近年出现的采用反相色谱原理制造的氨基酸分析仪，可使蛋白质水解出的17 种氨基酸在12min 内完成分离，且具有灵敏度高（最小检出量可达1pmol）、重现性好以及一机多用等优点。 5.应用举例
各种类型氨基酸分析仪性能比较一览表
各种类型氨基酸分析仪性能比较一览表 常规氨基酸分析是指20种蛋白水解氨基酸和40余种游离氨基酸的分析。氨基酸分析仪自1958年问世以来，不断借助现代化的硬件和软件更新换代，现已发展成为现代食品、饲料、生物技术、医药卫生和生命科学等行业氨基酸分析必不可少的自动化常规检测设备。 氨基酸分析仪按其分离和检测方法的不同可分为两大类型。第一类是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生光度法测定的经典方法（IEC）。此类方法于1972年获诺贝尔奖，是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法。第二类是所有基于反相色谱分离、柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相法（HPLC）以及阴离子交换分离直接安培法检测的离子色谱法（IC）。两类方法的特性比较见表1。 表1：氨基酸分析方法的分类和特性比较表[1]
说明：IEC离子交换色谱；PITC异硫氰酸苯酯；OPA邻苯二甲醛；FMOC 9-芴基甲氧羰酰氯；AQC 6-氨基-喹啉基-N-羟基琥贝酰亚胺-氨基甲酸酯；DABS-Cl 二甲基氨基偶氮苯磺酰氯 由表1可见，IEC标准方法优于HPLC非标准方法，且此类仪器为专用型自动氨基酸分析仪器。 国外氨基酸分析仪器中，基于I EC标准方法原理并按照国家计量法规规定迄今业已正式通过国家技术质量监督总局型式认证的，有日立公司的L-8800，安玛西亚公司的30系列和安米诺西斯公司的A200型三种氨基酸分析仪。尚待通过计量认证的有Sykam和Jeol。而提供HPLC型氨基酸分析仪器的外国厂家有沃特斯、安捷伦、岛津和戴安等。但此类仪器用做氨基酸分析仪器时，还须首先通过氨基酸分析的计量认证。上述三家IEC型仪器的性能和技术参数见表2。 表2：三种IEC型氨基酸分析仪主要性能和技术参数对比一览表[2]
各种标签Tag的核苷酸与氨基酸序列
V5-tag 5ˊGGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG 3ˊ G K P I P N P L L G L D S T 6 X His tag CAT CAT CAC CAT CAC CAT H H H H H H S-tag AAA GAA ACC GCT GCT GCT AAA TTC GAA CGC CAG CAC A TG GAC A GC KETAAAKFERQHMDS Flag-Tag GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG D Y K D D D D K
Myc-Tag GAG CAG AAA CTC ATC TCT GAA GAG GAT CTG HA-Tag TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCT VSV-G: TATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAG Thrombin recognises the consensus sequence Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser Sequence：CTG GTT CCG CGT GGA TCC 重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域。特别是体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。 美国GeneCopoeia的蛋白表达载体按照表达宿主的不同新推出3类，分别为表达宿主为 大肠杆菌，哺乳动物细胞的，以及慢病毒载体，宿主可以为哺乳动物细胞和原代细胞。 除了必要的复制和筛选的元件，协助表达和翻译的元件外，本文将各类载体分别按照功能标签的不同确定种类并将个标签的功能初步介绍如下： His6： His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某 一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。 使用His-tag有下面优点： 1.标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能； 2.His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯
全自动氨基酸分析仪的技术指标及特性
全自动氨基酸分析仪的技术指标及特性全自动氨基酸分析仪的技术指标及特性一、仪器配置 全自动氨基酸分析仪:包括自动进样器、泵、检测器、分析软件、带电子制冷功能的溶液存放单 元，所有缓冲液及茚三酮都有惰性气体隔离保护。溶剂输液单元有集成四通道真空脱气装置。分 析柱或反应器具有泄漏保护、压力过高保护性能。二、技术参数 1( 分析柱 电子恒温(制热或制冷) 温度梯度可编程 20?,99? 准确度 0.1? 安全保护过热保护 2( 自动进样器 进样模式100μl体积可变循环进样 进样体积可变; 1μl,5000μl，0.1μl增量重现性10μl 变体积进样时变异低于1% 温度控制 +5?(?1?),70?(电子恒温) 3( 分析时间 蛋白质水解产物 30分钟,50分钟，自动时间控制生理体液 90分钟,180分钟，自动时间控制 4( 缓冲泵(溶剂递送单元) 活塞双活塞 流速 0.01ml/min,2.00ml/min 压力波动低于0.1% 最大压力 40MPa (400bar，6000psi) 材料 PEEK 5 检测系统 检测波长 570nm, 440nm(可同时检测) 流动池体积8μl
检测极限茚三酮(可见光度计)10pmol 荧光光度计3pmol 6( 系统控制和数据处理软件 (2软件，4通道，2接口板) 用户可配置的工作站，用于数据采集和系统控制操作系统Windows 98以上，输出报告兼容Excel 软件有预置的不同格式的打印模板 根据美国药典(USP)和欧洲药典(ESP)标准自动地对峰参数和数值进行计算 根据预先设置，系统可多次自动进行基线校正测量过程中可以随时进行基线校正 故障诊断系统，可诊断缓冲压和流速的高低等异常可支持严格的GLP要求