马铃薯腐烂茎线虫28SrDNA_D2_D3区序列分析

植物病理学报

A CTA PHY TO PA THO LOG ICA SI N ICA 39(3):254 261(2009)

收稿日期:2008 03 21;修回日期:2009 04 15

基金项目: 973 项目(2009CB119200);国家自然科学基金资助项目(30871627);国家 十一五 科技支撑计划(2006BAD08A14)通讯作者:彭德良,研究员,主要从事植物线虫分子生物学研究;E m ai:l dlpeng @caas .n et .cn

第一作者:于海英(1981-),女,吉林白城人,云南农业大学2005级硕士研究生,主要从事植物线虫学研究;E m ai:l yuhai y i ng1981@

163.co m 。

马铃薯腐烂茎线虫28S rDNA D2/D3区序列分析

于海英1,2,彭德良1,胡先奇2,黄文坤

1

(1中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京100193;2

云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室,昆明650201)

摘要:我国危害甘薯的马铃薯腐烂茎线虫rDNA IT S 基因片段长度存在A 型(900bp)和B 型(1100bp)2个类型,A 型腐烂茎线虫群体的IT S 片段比B 型群体少200bp 。为了进一步研究这2种类型群体的发育关系,本文用线虫通用引物D 2A 和D 3B 对来自国内的21个马铃薯腐烂茎线虫群体和1个韩国的马铃薯腐烂茎线虫28S rDNA D 2/D 3区进行了PCR 扩增,均产生大小一致的片段,长度约为780bp ,克隆、测序后用DN AM AN 5.2软件和M EG A 4软件进行分析比对,结果表明我国21个马铃薯腐烂茎线虫群体28S rDNA D 2/D 3区只有20余个碱基的差异,相似率达97.2%。基于U PGM A 构建的系统发育树很好地区分了马铃薯腐烂茎线虫A 型和B 型群体,展现出了群体的来源及发育关系。关键词:马铃薯腐烂茎线虫;D 2/D 3区片段;序列分析

M o lecu la r c lo n ing a nd sequ en ce s an a l y s is o f 28S rDNA D2/D3reg i o ns o f D ity len chus d es tru cto r o n sw ee t po ta to in Ch ina YU H a i y i n g 1,2,PENG D e liang 1,HU X i a n qi 2,

HUANG W en kun 1

(1The S t a te K ey L abora t o ry fo r B i o l o gy o f D isease and Insect Pe sts ,In stitute o f P lan t P ro tec tion ,Ch i

nese A cade m y o f A gr i cult ural Sc i ences ,Be iji ng 100193,Ch i na ;

2

K ey L abo ra t o ry o f A g ricultura l B iodive rsit y and Pe sts Con tro ,l

M i n istry of Educa tion ,Y unnan A g r i cultural U n i v ersit y,K un m ing 650201,Ch i na)

Ab stra ct :Tw o types of r D NA I TS (Type A,900bp and Type B,1100bp)w ere de m onstrated to ex ist in D ity lenchu s destructor populations on s w eet po tato i n Ch i n a .The D 2/D 3reg i o ns o f 28S r D NA fro m 22popu lation s ofD.destructo r w ere a m p lifi e d w it h un iversal pri m er pairsD 2A and D 3B .A ll 22populations y ie l d ed one sing l e frag m ent about 780bp .Sequence ana l y sis and align m ent w ere conduc ted by usi n g the so ft w are M EGA 4and DNAM AN5.2and a ll22sequencesw ere sub m itted at t h e G enB ank .The results show ed t h at se quence d ifference s of D 2/D3reg i o n w ere only in a fe w sites ,and t h at t h e si m ilarity w a s 97.2%.Tw o types cou l d be disti n g uished i n t h e phy l o g enetic tree by usi n g UPGM A m ethod .The evo l u tionary re lationship be t w een t w o types and t h e o rig i n o fD ity lenc hu s spec i e sw ere d iscussed .Key w o rd s:D ityle nchus destructo r;D 2/D3expan si o n segm en ts ;sequences analy sis

中图分类号:

S435.31 文献标识码:A 文章编号:

0412 0914(2009)03 0254 08

马铃薯腐烂茎线虫(D ity lenchu s destructo r )是我国重要的进境植物检疫性有害生物[1]

,在我国主要分布于河北、山东、北京等地,主要危害甘薯,是甘薯生产上重要的病害之一。线虫形态特征的重叠交错和形态的多样性使得传统的形态学鉴定

变得困难,随着分子生物学技术的飞速发展,分子诊断成为植物线虫研究的新途径[2]

。

物种的多样性最本质的体现在核酸的结构差异上,对核酸的分析可使我们了解物种进化历史的精确信息。在真核生物中核糖体RNA 包括大小

3期于海英,等:马铃薯腐烂茎线虫28S rDNA D2/D3区序列分析

亚基,核糖体小亚基的序列被广泛应用于分子系统发育的研究,尤其是关于生物体也包括线虫的深层进化关系的研究[3]。目前,通过对整个线形动物门中不同分类群体的核糖体小亚基序列的研究,为线虫的分子系统发育关系的研究提供了较全面且可靠的方法[4],但是有关大亚基在线虫分类中的研究相对很少。

线虫中核糖体大亚基一般指的是28S RNA基因,28S r D NA是核糖体大亚基r RNA的转录基因,序列中既有保守区又有可变区。在进化过程中, 28S r D NA中的D区序列片段一直被认为是丰余的结构,因为这些片段不会妨碍核糖体的功能,但是D区序列片段也可以用来解释基因片段中的部分变异,特别是D3区常常用于研究不同地理来源的不同线虫种样品间的序列多样性[5]。近年来, 28S r D NA D2/D3区大量的应用于许多物种的研究,在属、种的分类及亲缘种的鉴定等方面发挥了重要作用[6,7],并且在线虫中也开展了广泛的研究。28S的D3序列可以很好地将4种常见根结线虫(M el o i d ogyne hap l a、M.a rena ria、M.inco gnita、M.j a vanica)区分开[8];28S r D NA D2/D3序列用于研究垫刃目的根腐线虫(Pra tylenchus),潜根线虫(H irschm anniella)、根结线虫(M e l o i d o gyne)、穿孔线虫(Rado pho lus)、螺旋线虫(H elico tylenchus)和盘旋线虫(Ro tylenchus)的系统发育关系[9~12]; L i等[13]对香蕉穿孔线虫r R NA基因的D2/D3区序列进行了分析比对,Jiang等[14]也成功地利用28S r D NA D2/D3区特征将伞滑刃线虫属部分种群进行区分,可见28S r DNA D2/D3区带有的系统发育信息,可为线虫系统发育比较和鉴定提供重要的依据。

本实验室已经对来源于国内21个马铃薯腐烂茎线虫群体和1个韩国马铃薯腐烂茎线虫群体的r DNA I TS进行了研究,扩增出942bp和1130bp 2个大小不同的片段,经克隆、测序和序列比对后发现I TS区存在很大差异,根据片段的大小将马铃薯腐烂茎线虫分为A型群体和B型群体,A型群体的I TS扩增片段明显比B型群体少了约200 bp,说明马铃薯腐烂茎线虫的不同群体间很可能出现了分化现象[15,16],设计构建并筛选出A型、B 型马铃薯腐烂茎线虫2对特异性引物D dS1/D dS2和D dL1/D dL2,分别扩增出A型马铃薯腐烂茎线虫、B型马铃薯腐烂茎线虫群体的特异片段252bp 和485bp;引入D3A/D3B作为内标,设计出一步双重PCR检测技术[16];本研究的目的是研究马铃薯腐烂茎线虫A型和B型群体在核糖体DNA28S 上的差异,分析系统发育的关系。因此,对22个马铃薯腐烂茎线虫群体28S r DNA的D2/D3区域进行了序列扩增和分析,并且建立了系统发育树进行亲缘关系分析。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的22个群体中21个马铃薯腐烂茎线虫群体分别采自安徽、北京、山东、江苏、河北、河南、吉林和内蒙古的甘薯病区,另有一个从韩国进口大蒜上获得的茎线虫群体(表1)。用贝曼漏斗法从寄主植物中分离得到线虫,在显微镜下挑取活力较强的线虫200条左右,放在灭菌的指形管中用0.05%青霉素和0.05%氯霉素(青霉素!氯霉素= 1!1)消毒30m i n,再用灭菌水漂洗3次,然后接到长满半裸镰刀菌的培养基上,在25?温箱中黑暗培养45d,得到大量纯化好的线虫后放入4?冰箱中保存[17]。

1.2 线虫DNA的提取

线虫DNA的提取参照Peng等[18]的方法进行,略有改动。挑取5~10头茎线虫放入装有10 L ddH2O的离心管中,在-20?的冰箱中冷冻,取出后,用75%酒精消毒的玻璃棒,在离心管中转动至冰融化,加入8 L的W LB(w o r m ly sis buffer),3 L蛋白酶K溶液(600 g/mL),10000r/m i n离心30s,-20?下冷冻30m i n,促进细胞裂解。然后将离心管取出,在65?下温育60m i n,以降解脱氧核糖核酸;95?反应10m in,使蛋白酶K失活;取出离心管后,10000r/m i n离心1m in,在-20?保存。然后取上清的悬浮液,进行PCR扩增。

1.3 PCR扩增

试验中采用线虫28S r D NA D2/D3区的通用引物D2A和D3B进行扩增[19],D2A:5# ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG 3#和D3B: 5# TCGGAAGGAACCAGCTACTA 3#,引物由上海宝生物公司合成。

255

植物病理学报39卷Tab le1 Th e o r i g i n o fD ity l e nchu s de s tru cto r po p u la ti o ns u sed i n the study

N u m ber o f populati on A bbrev i a ti on code

o f po pulation

O rig i n o f

po pulation

H o st IT S type

D2/D3sequence

leng th(bp)

A cce ss

nu m ber

1D dPy P i ngy in Shandong Sw eet po tato A780EU400635 2D d Nm N ei m engg u Sw eet po tato A780EU400633 3D d D x D ax i ng Be iji ng Sw eet po tato A776EU400625 4D dPg z P angg ezhuang B e iji ng Sw eet po tato A780EU400634 5D d M y1M i yun 1B eiji ng Sw eet po tato A780EU400631 6D d M y2M i yun 2B eiji ng Sw eet po tato A780EU400632 7D dB c B a i cheng Jili n Sw eet po tato A780EU400622 8D dSh Sihong Jiang s u Sw eet po tato B780EU400636 9D dT s T ong s han Ji angsu Sw eet po tato B780EU400639 10D d X y X iny i Ji ang su Sw eet po tato A780EU400640 11D d D h D inghu A nhui Sw eet po tato A780EU400624 12D dT h T aihe A nhu i Sw eet po tato A780EU400638 13D dSx S i x i an A nhui Sw eet po tato A780EU400637 14D dL l L u l ong H ebe i Sw eet po tato A780EU400628 15D dFn Fun i ng H ebe i Sw eet po tato A780EU400626 16D d Y x1Y ix ian 1H ebe i Sw eet po tato A780EU400641 17D d Y x2Y ix ian 2H ebe i Sw eet po tato A780EU400642 18D dC l Chang liH ebe i Sw eet po tato A780EU400623 19D d Z z Z huo zhou H ebe i Sw eet po tato A780EU400643 20D dL n L uannan H ebe i Sw eet po tato A780EU400629 21D dL y L uoy ang H enan Sw eet po tato A780EU400630 22D d K r K o rea G a rlic B780EU400627

每管中PCR反应混合液的总体积25 L:2.5 L10?PCR buffer、2 L dNTP M ix ture(2.5 mm o l/L)、0.75 L引物D2A(20 m o l/L)、0.75 L引物D3B(20 m o l/L)、0.2 LTaq DNA聚合酶(5U/ L)、2.5 L模板DNA、16.3 L ddH2O。PCR反应条件:95?4m i n;94?45s,50?30s, 72?2m i n,35个循环;然后72?10m i n。设计1个阴性对照,PCR反应混合液中不加模板DNA。反应完成后用1%琼脂糖凝胶电泳(100V,30 m i n)进行分析。

1.4 克隆、测序及分析

用DNA凝胶纯化试剂盒(Ta K a Ra,大连)纯化PCR产物,将纯化的产物与P GE M T Easy载体(Pro m ega)连接,并转化到大肠杆菌DH5 感受态细胞中,进行蓝白斑筛选,挑取白色的单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB培养液(1%T ryptone、0.5%Y east Ex tract、1%N aC l、p H=7.0)中,37?振荡(250r/m in)培养过夜,得到的菌液送上海生工测序,整理获得的序列,提交G enB ank获得相应的序列号。测序结果用Chro m as、DNAM AN和M EGA4.0软件进行分析比对,并且与G enBank 上公布的马铃薯腐烂茎线虫及其近源种的D2/D3序列进行比对,利用UPGM A方法构建茎线虫群体的系统发育关系树。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

用线虫通用引物D2A和D3B对22个马铃薯腐烂茎线虫群体的28S r D NA D2/D3区进行PCR 扩增,结果表明:我国的21个马铃薯腐烂茎线虫群体和韩国的1个腐烂茎线虫群体的D2/D3区扩增片段长度基本一致,约为780bp(图1)。

2.2 序列测定与聚类分析

2.2.1 序列测定和比对 序列测定结果表明,我国21个马铃薯腐烂茎线虫群体和1个韩国马铃薯腐烂茎线虫群体的D2/D3区的序列长度均为780bp,

256

3期

于海英,等:马铃薯腐烂茎线虫28S rDNA D 2/D 3

区序列分析

Fi g .1 PCR a m p lifica tio n p ro du cts o f D2/D3reg i o n o f 28S r DNA

in D ity l e nchu s sp e c ies po pu l a tio n s

M :D L 2000D NA m arker ;L ane 1-22repre s ent PCR a m plif i ca tion produc ts o f populati on 1to 22(co de s see T ab .1).

将所测定的马铃薯腐烂茎线虫D 2/D 3区序列在G enB ank 上注册,得到了22个序列注册号(表1)。用DNAM AN 软件对这22个马铃薯腐烂茎线虫的D 2/D 3区序列进行比对,22个马铃薯腐烂茎线虫群体D2/D3区一致性达到97.2%,只在第101、131、234、280、281、337、351、357、408、432、464、475、528、571、588、618、659、688、701、728和750位的21个位点上有碱基的替换,没有碱基的插入和缺失(图2);其中D dK r 、D dSh 和D dTs 3个群体D 2/D 3区序列一致性大于99.5%(序列比对时以D dK r 为代表),D dNm 、D dLn 、D dLy 、D d M y2及D dY x25个群体的序列一致性大于99.5%(序列比对时以DdNm 为代表),说明马铃薯腐烂茎线虫群体间D 2/D 3区的序列一致性很高、差异性很小。2.2.2 聚类分析 将本研究中所涉及的22个马铃薯腐烂茎线虫群体的D 2/D 3序列与G enB ank 中下载的俄罗斯的马铃薯腐烂茎线虫(D.destruc tor )D 2/D 3序列(DQ 328727)、美国的茎线虫(D i tylenchus sp .)D2/D3序列(AY 589364)进行比对分析,用U PGM A 方法构建了系统发育树(图3)。从系统发育树上可以看出,茎线虫群体间的遗传距离很小,但是在亲缘关系上马铃薯腐烂茎线虫群体可以明显分为三大支系,按照I TS 区序列划分为A 型的马铃薯腐烂茎线虫群体聚为一类,按照I TS 区序列划分为B 型的马铃薯腐烂茎线虫群体聚为一类,美国的茎线虫(D ity lenc hus sp .)群体则聚为另一类。19个A 型马铃薯腐烂茎线虫群体(D dL l 、D dFn 、D dY x1、DdLn 、DdC l 、D dZ z 、DdY x2、D dLy 、D dD x 、Dd M y1、D d M y 2、D dPgz 、D dTh 、D dDh 、D dSx 、D d X y 、DdPy 、D dNm 、D dB c)组成的支系内,D dZ z 、DdC l 、DdFn 、D d M y1和DdD h 5个群体组

成1个亚群;3个B 型马铃薯腐烂茎线虫群体和俄罗斯马铃薯腐烂茎线虫群体(DQ 328727)则组成另1个亚群;而美国的茎线虫群体D ity lenc hu s sp.

(AY 589364)则与上述2个支系遗传距离较远。22个马铃薯腐烂茎线虫群体的D 2/D 3序列的聚类分析结果所推导的马铃薯腐烂茎线虫群体间的亲缘关系与I T S 区聚类分析所推导的亲缘关系是比较一致的。说明中国D dT s 、D dSh 马铃薯腐烂茎线虫群体与韩国群体D dK r 、俄罗斯群体D dR s 亲缘关系较近,而中国马铃薯腐烂茎线虫群体与美国马铃薯茎线虫群体的亲缘关系相对较远。

3 讨论

本实验室详细研究了22个马铃薯腐烂茎线虫群体的r D NA I TS 序列特征,发现它们之间存在较大差异,因此将D dL l 、DdFn 、D dY x1、D dLn 、D dC l 、DdZ z 、D dY x2、D dLy 、D d D x 、DdM y1、Dd M y2、DdPg z 、D dTh 、DdD h 、D dSx 、DdX y 、DdPy 、D dNm 和DdB c 群体归为A 型马铃薯腐烂茎线虫;而D dK r 、DdSh 和D dT s 群体归为B 型马铃薯腐烂茎线虫,A 型群体比B 型群体少了约200bp 碱基

[16]

。

通过马铃薯腐烂茎线虫的22个群体D 2/D 3区多序列比较,构建的系统发育树反映了马铃薯腐烂茎线虫种群内的遗传发育关系,这2个支系内部群体间的遗传距离很小,但2个支系间还是有一定的距离,可以明显区分腐烂茎线虫的A 、B 2个型,说明国内马铃薯腐烂茎线虫群体不仅在I TS 区产生了较大的差异,并且在28S r D NA 的D 2/D 3区也产生了差异,这种差异能在相对保守的D 2/D 3区体现出来,为证明马铃薯腐烂茎线虫这2个类型群体间发育关系提供了一个有利的信息,有可能A

257

植物病理学报39

卷

Fig.2 M u lti p l e a ligm e nts o f D2/D3reg i o n o fD ity len chu s d es truc to r 258

3期于海英,等:马铃薯腐烂茎线虫28S rDNA D2/D3区序列分析

Fig.3 Phy l o g e ne tic tre e o fD ity len chu s po pu la ti o n s us ing UPGM A m e tho d Co de s see T ab l e1. D.R S represented t he D ity lenchu s po pu l a tion from R ussi a; D.W Y 2004repre sen t ed the W Y 2004populati on o fD itylenchus from Am er i ca.Bo o tstrap rep licati o ns w ere5000.

型和B型是马铃薯腐烂茎线虫的2个致病型,当然这仍然需要进一步的生物学和寄主范围的测定才能确定。

从G enB ank下载的茎线虫属的2个其它种群序列是为了更好地说明国内腐烂茎线虫群体的来源及进化关系。从数据分析结果来看,国内的腐烂茎线虫B型群体与俄罗斯的马铃薯腐烂茎线虫群体及韩国的群体在一个组群内,亲缘关系最近;而国内的A型群体则与之表现出了一定的差异。在国内茎线虫分布的地区A型群体占大多数,分布较为广泛,而B型群体基本上分布在离贸易口岸较近的地区,不排除从国外入侵的可能性。

A型群体中DdZ z、D dC l、DdFn、DdM y1和DdD h群体分别来源于河北省、北京市和安徽省并且形成一个组群,河北省和北京市在地理位置上最接近,因此在组群中来源于河北省的D dZz、D dC l、DdFn群体和来源于北京的D d M y1群体具有最近的亲缘关系,而安徽省距离这2个地区较远,所以来源于安徽省的D dDh群体则与它们亲缘关系相对较远,这说明亲缘关系的远近在一定程度上体现了群体所在地理位置的远近,在长期的进化过程中由于地理位置接近及自然界中频繁的杂交和偶然

259

植物病理学报39卷

性的杂交逐渐形成了相似的分子遗传特征,从系统发育树上可以清楚地看到群体的扩展趋势及来源。

本研究探讨了利用28S r DNA的D2/D3区序列构建的系统发育树在马铃薯腐烂茎线虫A型和B型群体鉴定中的意义,这2个型群体间在I TS区和D2/D3区均产生了差异,可以将马铃薯腐烂茎线虫划分为2个不同的类群,说明中国境内马铃薯腐烂茎线虫可能有2个不同的来源。但系统发育树只是一个分子遗传树,除了对马铃薯腐烂茎线虫分子水平上的性状分析外,还需要进行生物学、生理生态性状、形态特征和行为性状等多方面的分析。本实验室前期的研究表明,r D NA I T S区序列存在很大差异,利用这些差异已经设计出种群特异性引物[16],本研究揭示出的种群间D2/D3序列的差异将为检测马铃薯腐烂茎线虫不同地理种群提供新的方法。目前,在同一个地区是否同时出现马铃薯腐烂茎线虫A型和B型群体,不同来源的A 型群体和B型群体是处在复杂的种群融合阶段还是种群分离阶段,有待于更加深入的研究。

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责任编辑:于金枝

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