细胞传代实验报告(新)

细胞传代培养

一.实验目的

初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的

应用打下基础。

二、原理

从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生

长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观

察

活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以

与

体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经

济，

因此成为生物学研究的重要手段。

细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为

原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分

散

后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传

代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受

温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操

作是细胞培养成败的关键。

三、材料和试剂

1、细胞：293细胞株

2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）

3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精

灯等

四、操作步骤

1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。

2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。

3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入

培养箱中消化几分钟

4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代

5.根据确定的比例来取需要的量（剩余的细胞拿来做细胞计数），加入4ml左右的培养液

6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱

7.收拾整理超净台

附：消化液配制方法：

称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存，

用前可在37℃下回温。

10x pbs配方：na2hpo4(14.2g) kh2po4(2.32g) nacl(80g) kcl(2.02g) (调至ph=7.4）

五、实验结果

传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2天左右就在瓶内形成单层，

达到七八成满。这时需再次传代

六、讨论与反思

无菌操作中的注意事项

在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙

醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台灭菌。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前和

加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，

加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火

上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯

的周围进行。

每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长

致密时即可传代。

多做，熟能生巧篇二：细胞生物学实验传代培养

一、【实验目的】

1、了解动物细胞传代培养的基本原理。

2、掌握动物细胞传代培养的基本操作，并对hela细胞进行传代培养。

二、【实验原理】

hela 是henrietta lacks的简称，henrietta lacks 是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名

字，在她死后，该细胞走被广泛散发到各研究机构，并无限次地繁殖分裂下去。

培养细胞的特性：

贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。

悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细

胞。

每代贴附生长细胞的生长过程：

1、游离期细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈

圆球形。10分钟一4小时

2、贴壁期细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。

3、血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正

电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，

悬浮细胞再与吸附有促贴

壁因子的附着。

4、潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。

5、对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

6、停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂

细胞传代方法

1、悬浮生长细胞传代

离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：

悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，用吸管直接吹打形成细胞悬液再传

代。

2.悬浮生长细胞传代（hela细胞）

此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，

进行传代。

3、贴壁生长细胞传代

采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。

细胞培养用液的配制

1、d-hanks原液试剂配方

氯化钠 80.0g 磷酸氢二钠（na hpo ·2h o） 0.6g 氯化钾 4.0g 磷酸二氢钾 0.6g 三蒸

水 1000ml

2、d-hanks工作液试剂配方

d-hanks原液 100ml 三蒸水 896ml 0.5% 酚红液 4ml 3、消化液：

胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞

骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋

白酶是一种黄白色粉末，用无ca2+、mg2+的pbs缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。

用滤器过滤除菌。

胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用

完全培养基的组成

基础培养基 80％一95％

血清 5％一20％（一般加10％）

碳酸氢钠 2.0 g/l 青、链霉素各100卑位／毫升

血清质量好坏是实验成败的关键。

常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量

最好。

优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消

除补体活性）：56 ℃，30 分钟

血清的消毒：过滤除菌

三、【实验材料】

实验用具：离心管（2支），移液枪（每个台面一把），枪头，吸管（4根），培养皿（每组

2个）

实验药品：0.25％胰酶，d－hanks，1640培养基

四、【实验操作】

1. 用75%乙醇擦手，取离心管一个，打开超净台（照明、风机），把离心管置于架子上。

然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。取尖吸管、吸量管各一支，套好吸球，放置在专用

的架上。

2．从冰箱中取出0.25％胰酶、d－hanks、培养基。可以把胰酶和d－hanks的瓶盖打开或

者拧松。

3.取待传代的细胞，用尖吸管弃去旧的培养基，加入d－hanks。轻轻摇动后将hanks弃掉。

4.用尖吸管吸取适量胰酶加入，加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜，轻轻摇动。2－5分

钟后迅速将消化液吸出。消化时间长短是实验成败的关键，宁可短消化，不能过消化。否则细

胞会变死。在倒置显微镜下观察，当细胞质回缩，胞间间隙加大为消化适宜。

5．取培养基加入细胞，反复轻轻吹打培养皿壁，制备细胞细胞悬液。吹打的部位均匀，从

上到小，从左到右，顺序进行吹打，保证各个部位的培养细胞均能吹打

到，成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛，尽

量不要出现气泡，以免损伤细胞。

6．至所有细胞从培养皿底部脱落下来，然后吸取至离心管中。1000 rpm离心5分钟。（无

需准确计数时离心可略）

7．细胞离心毕，尖吸管弃去上清，吸取培养基适量，加入离心管，将细胞重悬、吹匀。（无

需准确计数时离心可略）

8．吸量管吸取适量培养基1.5ml加入新的培养皿中。细胞悬液0.5ml加入新的培养皿中，

培养密度为1×105－×106/ml。显微镜下观察，摇匀，放入37度c02培养箱孵育。

9．待培养基（本身为红色），当ph值降低，培养基呈偏淡红色时，一般2天以后，将旧的

培养基吸掉，更换新鲜培养基继续培养。

五、【实验现象】

培养基：rm1640培养基＋10%胎牛血清

六、【实验讨论】

注意事项

1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火

焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

2．每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生

长致密时即可传代。

3．如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞

，

如果必须挽救，可加含有抗生素的bss或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗

菌素，并经常更换培养基等篇三：原代细胞培养实验报告

实验：细胞培养

1.实验目的

初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应

用打下基础。

2.实验原理

从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、

繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，

并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互

为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生

物学研究的重要手段。近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工

程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。细

胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培

养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一

个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积

次数就是细胞的代数。

细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温

度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细

胞培养成败的关键。

3.实验用品

3.1 材料和标本乳兔、hela细胞(人宫颈癌细胞) 3.2 器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、

超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。

2.3 试剂含有5％小牛血清的mem培养液、0.01mol／l pbs，0.25％胰蛋白酶一0.02％

edta混合消化液、75％乙醇。

4.实验方法

4.1 原代细胞培养

4.1.1 原理

细胞培养(cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使

其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，

广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物

技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体

时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、

幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

4.1.2 操作

①．取材

用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，

取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹

取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。

②．切割

用灭菌的pbs液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到

成1mm3左右的小块，再用pbs清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，

使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

③．消化、接种培养

吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％edta混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加

上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接

触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的mem培养基，用吸管吹打混

匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

4.1.3 结果

细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即

可形成单层。

4.2 传代细胞培养

4.2.1 原理

体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或

得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生

存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转

移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。

细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，

细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。

常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细

胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活

力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

4.2.2 操作

①．将长成单层的原代培养细胞或hela细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒

掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟。

②.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即

在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。③．将细

胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，

送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。

4.2.3 结果

一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单

层，需要再次进行传代。

4.3 器材及液体的准备和无菌操作的注意事项

4.3.1 器材和液体的准备

细胞培养用的玻璃器材，如：培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，120℃，

2小时干烤灭菌后备用；手术器材、瓶塞、配制好的pbs液用灭菌锅15磅，20分钟蒸气灭菌；

mem培养液、小牛血清、消化液用g6滤器负压抽滤后备用。

4.3.2 无菌操作中的注意事项

在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙

醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，

严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要

在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上

烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净

台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，

然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。

5．实验报告

(1).原代细胞和传代细胞培养有哪些区别?

(2).总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。 | 评论

求助知友 boydead | 五级采纳率28% 擅长领域：暂未定制

提问者对回答的评价：

谢谢

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细胞培养:血清

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2012-03-08 动物细胞培养:基本技术指南(第5版) 中英文版本可以也发给我一份吗？... 2011-10-27 动物细胞培养-基本技术指南（第五版）作者：英r.i.弗雷谢尼著，章... 2012-01-09 求动物细胞培养：基本技术指南（第5版）pdf版发给我一份吗？nasa10 (1)

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2011-12-21 求《动物细胞培养基本技术指南》第五版，弗雷谢尼著，电子版。 940... 1 更

多关于细胞培养:基本技术的问题>>

其他回答共2条

2008-09-13 10:24 200602115 | 五级

细胞培养

1.实验目的

初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应

用打下基础。

2.实验原理

从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生

存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使

我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多

复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，

耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发

生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的

应用，并取得了丰硕的成果。细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取

的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培

养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培

养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温

度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细

胞培养成败的关键。

3.实验用品

3.1 材料和标本乳兔、hela细胞(人宫颈癌细胞) 3.2 器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、

超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。

2.3 试剂含有5％小牛血清的mem培养液、0.01mol／l pbs，0.25％胰蛋白酶一0.02％edta

混合消化液、75％乙醇。

4.实验方法

4.1 原代细胞培养

4.1.1 原理

细胞培养(cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

4.1.2 操作

①．取材

用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。

②．切割

用灭菌的pbs液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用pbs清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

③．消化、接种培养

吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％edta混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的mem培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

4.1.3 结果

细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。

4.2 传代细胞培养

4.2.1 原理

体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。

常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

4.2.2 操作

①．将长成单层的原代培养细胞或hela细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟。

②.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即

在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。③．将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。

4.2.3 结果

一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。

4.3 器材及液体的准备和无菌操作的注意事项

4.3.1 器材和液体的准备

细胞培养用的玻璃器材，如：培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，120℃，

2小时干烤灭菌后备用；手术器材、瓶塞、配制好的pbs液用灭菌锅15磅，20分钟蒸气灭菌；mem培养液、小牛血清、消化液用g6滤器负压抽滤后备用。

4.3.2 无菌操作中的注意事项

在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。

5．实验报告

(1).原代细胞和传代细胞培养有哪些区别?篇四：实验五细胞的传代培养

实验5 细胞的传代培养

一、实验目的

熟练掌握动物细胞的传代培养法。

二、实验原理

哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。

三、仪器、材料与试剂

1仪器

co2培养箱，倒置显微镜，超净台

2材料

培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。

3试剂

完全培养基（rpmll640或dmem），0.25%胰蛋白酶，d-hanks液。

四、实验步骤

1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。

2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。

3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。

4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。

5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。

6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3ml hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。

8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。

9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10ml/大瓶，3-5ml/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于co2气体的进入，将培养瓶放回co2培养箱。

10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

五、注意事项

1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。

2.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生

长致密时即可传代。

3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的bss或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。