DNA凝胶回收.
AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒
本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至8 μg DNA(70bp-10Kb,回收率为60-85%。琼脂糖凝
胶在温和的缓冲液(DE-A溶液中熔化,其中的保护剂能防止线状DNA在高温下降解,然后在DE-B溶液
的作用下使DNA选择性结合到膜上。纯化的DNA纯度高,并保持片断完整性和高生物活性,可直接用于
连接、体外转录、PCR扩增、测序、微注射等分子生物学实验。
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
Cat. No. AP-GX-4 AP-GX-50 AP-GX-250
制备次数 4 preps 50 preps 250 preps
制备管 4 50 250
2 ml离心管 4 50 250
1.5 ml离心管 4 50 250
Buffer DE-A 6 ml 2×33 ml 2×165ml
Buffer DE-B 3 ml 33 ml 165 ml
Buffer W1 2.8 ml 28 ml 135 ml
Buffer W2 concentrate 2.4 ml24 ml2×72 ml
Eluent 1 ml 5 ml 25 ml
说明书 1 1 1
Buffer DE-A:凝胶熔化剂,含DNA保护剂,防止DNA在高温下降解。室温密闭贮存。
Buffer DE-B:结合液(促使大于70bp的DNA片段选择性结合到DNA制备膜上。室温密闭贮存。
Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate:去盐液,使用前,按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇(用100%乙醇或95%乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。
Eluent:洗脱液,室温密闭贮存。
二、注意事项
1. Buffer DE-A(含有β-巯基乙醇、Buffer DE-B和Buffer W1含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套
和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水
或生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。
2. 在步骤1中,将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间(线型DNA长时间暴露在高温条件
下易于水解,从而提高回收率。勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下,减少紫外线对DNA
造成的损伤。
3. 在步骤2中凝胶必须完全熔化,否则将严重影响DNA回收率。
4. 将Eluent或去离子水加热至65°C,有利于提高洗脱效率。
5. DNA分子呈酸性,建议在2.5 mM Tris-HCl,pH 7.0-8.5洗脱液中保存。
三、实验准备
1. 第一次使用前,Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。
2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。
3. 准备75°C水浴。
4. 使用前,检查Buffer DE-B是否出现沉淀,若出现沉淀,应于70°C温浴加热熔化并冷却至室温后再
使用。
四、操作步骤
1. 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量(提
前记录1.5 ml 离心管重量,该重量作为一个凝胶体积(如100 mg=100 μl体积。
2. 加入3个凝胶体积的Buffer DE-A,混合均匀后于75°C加热(低熔点琼脂糖凝胶于40°C加热,间
断混合(每2-3 min,直至凝胶块完全熔化(约6-8 min。
* Buffer DE-A为红色溶液。在熔化凝胶的过程中,可以帮助观察凝胶是否完全熔化。
3. 加0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B,混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时,需再加
入1个凝胶体积的异丙醇。
* 加Buffer DE-B后混合物颜色变为黄色,充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。
步骤4-6可以选择负压法或离心法。
A. 负压法
4A. 正确连接负压装置,将DNA制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤3中的混合液,转移到制备管中,开启并调节负压至-25-30英寸汞柱,缓慢吸走管中溶液。
5A. 加500 μl Buffer W1,吸尽管中溶液。
6A. 加700 μl Buffer W2,吸尽管中溶液。以同样的方法再用700 μl Buffer W2洗涤一次。
* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
* 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除,消除对后续实验的影响。
7A. 将制备管置于2 ml离心管(试剂盒提供中,12,000×g离心1 min。
B. 离心法
4B. 吸取步骤3中的混合液,转移到DNA 制备管(置于2 ml (试剂盒内提供离心管中,12,000×g
离心1 min 。弃滤液。
5B. 将制备管置回2 ml 离心管,加500 μl Buffer W1,12,000×g 离心30 s ,弃滤液。
6B. 将制备管置回2 ml 离心管,加700 μl Buffer W2,12,000×g 离心30 s ,弃滤液。以同样的方法
再用700 μl Buffer W2洗涤一次12,000×g 离心1 min 。
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除,消除对后续实验的影响。
7B. 将制备管置回2 ml 离心管中,12,000
×g
离心1 min 。
8. 将制备管置于洁净的1.5 ml 离心管(试剂盒内提供中,在制备膜中央加25-30 μl Elue nt 或去离子水,室温静置1 min 。12,000×g 离心1 min 洗脱DNA 。
* 将Eluent 或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。
五、流程图
计算凝胶体积
加3倍凝胶体积 Buffer DE-A ,温浴75°C 熔化凝胶
加含0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B
加500 μl Buffer W1
加700 μl Buffer W2 加700 μl Buffer W2
加25-30 μl Eluent 或去离子水含有目的DNA 凝胶
熔化结合
洗涤
洗脱
六、常见问题分析
主要问题原因建议
1 琼脂糖凝胶未完全熔化时目
的片段只有部分结合到膜
上,导致其余的片段在后续
洗涤过程中丢失以及出现制
备管堵塞现象,最终影响回
收效率。在切胶时尽可能去除不含目的片段的琼脂糖,确保buffer DE-A的正确用量。在熔胶过程中要仔细检查确保无固体琼脂糖残留,间隔性的对样品进行摇晃促进凝胶的充分熔化。
2 小于400bp的片段未加异
丙醇务必确保已加入1倍凝胶体积的异丙醇(100%。
1. 目的片段结
合量低
3 电泳缓冲液pH值过高,影
响目的片段的结合
建议加入10μl 3M NaAC中和。
2. 结合的DNA 片段过早的被洗脱Buffer W2中未加无水乙醇
或者乙醇浓度不是95 -
100%的
确保加入正确的乙醇量。每次使用后应拧紧瓶盖,以
免乙醇挥发,降低回收率。
回收率低
3. 洗脱效率低最后一次Buffer W2洗涤完后不要将制备管放于负压装置上抽得过干。
洗脱液或者去离子水65°C预热以及增加洗脱前静置
时间至5min,都可提高洗脱效率。
选用合适浓度的琼脂糖凝胶电泳,上样量不超过制备
管的最大结合量(8μg。
后续酶促反
应不理想
1. 盐污染
2. 乙醇污染
3. 琼脂糖残留
4. 洗脱产物中含有ssDNA 确保用Buffer W2洗涤2次。
在最后一次Buffer W2洗涤后可将制备管离心时间由原来1min增加至2min。
切胶时尽可能去除不含有DNA片段部分的凝胶以便于对琼脂糖的处理,确保琼脂糖块在Buffer DE-A中完全熔化。
将洗脱产物95℃加热2min,慢慢冷却至室温,使单链DNA重新退火即可。
琼脂糖凝胶电泳
DNA琼脂糖凝胶电泳 跑胶即走电泳，是DNA 和protein 最基本的定性定量方法。一般是琼脂糖胶或page 胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA 用丙烯酰胺凝胶。 一、基本原理 当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。 由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。该公式指球形颗粒所受的阻力。代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。 带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*t d为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。 在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。 二、琼脂糖凝胶电泳 通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定是采用琼脂糖凝胶(做支持物)电泳法进行的。用琼脂糖分离线性DNA时，其迁移率与该物质分子质量的关系密切，而与结构和碱基组成无关。这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。此方法除了可以分离线性DNA外，还可以分离、分析细菌质粒的闭环DNA和开环DNA，以及分子质量不等的RNA片段。一般实验室采用的琼脂糖凝胶的浓度为0.3%——2%。不同的凝胶浓度，可以分离不同长度的DNA片段。具体见表格： 琼脂糖凝胶 /% m/V 分离线性DNA片段的范围 /kb 0.3 50---60 0.6 1----20 0.7 0.8---10 0.9 0.5---7.0 1.2 0.4----6.0 1.5 0.3---3.0
(完整word版)DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤
一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。 影响核酸分子泳动率的因素主要是： 1、样品的物理性状 即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。 对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。 DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA ＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。 2、支持物介质 核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵
E.Z.N.A Gel Extraction Kit 琼脂糖凝胶回收试剂盒 中文 说明书
琼脂糖凝胶回收试剂盒E.Z.N.A Gel Extraction Kit 适合于D2501-**,D2500-**&D2502-** 准备工作 1. 浓缩的SPW Buffer需用乙醇按如下稀释: D2500-00&D2501-00&D2502-00 加入20ml 100%的乙醇; D2500-01/02&D2501-01/02&D2502-01/02 每瓶加入100ml 100%的乙醇; 注意:稀释后的DNA Wash Buffer需室温保存;所有步骤必须在室温下进行. 操作方案 配制琼脂糖EB凝胶,电泳以分离DNA片段.任何类型或等级的琼脂糖都可以使用. 我们强烈的推荐使用新鲜的TAE/TBE电泳缓冲液.不要重复使用电泳缓冲液,旧的电泳缓冲液PH会增加而降低DNA的回收产量; 2. 电泳足够时间后,在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来.并尽量去除多余的凝胶. 注意:DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30秒,同时在紫外灯下操作的时候一定要戴保护眼镜. 3.称取空离心管的重量,切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量,求出凝胶块的重量,近似地确定其体积.一般情况下,凝胶的密度为1g/ml,于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算:凝胶薄片的重量为0.2g 则其体积为0.2ml;加入等倍凝胶体积的Binding Buffer,把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化,其间每隔2-3分钟混匀一次; 重要提醒:在凝胶完全溶解之后,注意凝胶-Binding Buffer混合物的pH值.如果其pH值大于8的话,DNA的产量将大大减少.观察混合物的颜色,如果是橙色或红色,则要加入5μl 浓度为5 M,pH为5.2的醋酸钠,以调低其pH值.经过这一调节,该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色.一般情况下,使用新鲜的电泳缓冲液,凝胶-Binding buffer混合物的PH值的不会升高; 4.转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTM DNA柱子,并把柱子装在一个干净的2ml收集管内,室温下,10,000×g离心1min,弃去液体. 一个HiBind DNA柱子最多可容纳700μl的溶液,如果DNA-琼脂糖混合物的体积大于700μl,可先转移700μl溶液至柱子,离心完后,将余下的溶液继续加上柱子上.但是每一个HiBindTM柱子最多可以结合25~30μg DNA.如果预期产量较大,则把样品分别加到合适数目的柱中. 5. 将柱子重新套回收集管中,加300μl Binding Buffer至HiBind DNA 柱子中;室温下,10,000×g离心1分钟,去弃滤出液;这一步相当关键,不要忽略此步. 6.将柱子重新套回收集管中,加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中,室温下,10,000×g离心1分钟,去弃滤出液;注:SPW Wash buffer在使用前必须按瓶子标鉴要求用无水乙醇进行稀释. 7. 将柱子重新套回收集管中,重复加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中,室温下,10,000×g离心1分钟, 弃去滤出液;,将空柱子重新套回收集管中,10,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体. 这步可以去除柱子基质上残余的乙醇,不要省略此步―――对得到好的DNA产量是十分重要的. 8. 把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上,加入30~50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上,10,000×g离心1分钟,离心管中的溶液就是纯化的DNA产物,保存于-20度. 如果再洗脱一次的话可以把残余的DNA洗脱出来,不过那样的浓度就会较低. DNA的产量及质量:把纯化产物的样品稀释一定的倍数后,分别在260nm和280nm下测其光吸收值,回收得到的DNA的浓度可按以下公式来计算: DNA浓度=光吸收260×50×稀释倍数μg/ml长度大于500bp的片段通常能纯化得到80%的产量. 而50bp~500bp的带则可达到55%~80%的回收率.(光吸收260/光吸收280)的比率是核酸纯度的一个标记.如果此值1.8,则意味着核酸的纯度>90%.另一方面,如果纯化产物的产量较低时,可以用琼脂糖EB电泳估算产物的浓度.载体
琼脂糖凝胶电泳分离DNA与聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质原理方法上有什么异同
琼脂糖凝胶电泳分离DNA与聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质原理方法上有什么异同？DNA电泳一般使用的都是琼脂糖凝胶电泳，电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。 蛋白质电泳（一般指SDS-PAGE）一般使用的都是聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳的驱动力靠与蛋白质结合的SDS上所携带的负电荷。 所以相同点就是样品都是带负电荷的，从负极向正极移动，移动的距离都和样品的分子量有关。而且这两个电泳体系可以互相交换使用。进行大分子蛋白质电泳时，可以考虑换用琼脂糖凝胶，因为该体系孔径大。相反，如果需要精确到各位数碱基的DNA电泳也可以使用聚丙烯酰胺凝胶系统，因为使用该系统可以将相差一个碱基的两条DNA链分开。 不同点首先是样品不同。这个就不用多说了。其次是结果的观察方法不同。DNA 电泳普遍使用EB做染料，在紫外灯下观察；而蛋白电泳使用的考马斯亮蓝染色，还需要经过脱色步骤，不过观察起来比较简单。还有就是胶体系的差别，DNA 电泳通常是一胶跑到底，而蛋白质电泳则会有分离胶和浓缩胶之区别。 电泳中样品移动的本质确实是样品所携带的电荷。但是，区分这些条带直接可以用分子量而无需使用电荷数，是因为这些样品的电荷/分子量比都是恒定的了。以DNA分子为例，它在电泳中的移动是靠其骨架中磷酸所携带的负电荷来实现的，而这个磷酸分子又是每一个核苷酸中都有的，所以DNA分子所携带的负电荷数是由其核苷酸总数决定的。而且，DNA分子中核苷酸的组成动辄成百上千，在如此大的分子量面前，讨论单个核苷酸之间分子量的差别就显得毫无意义。这样，DNA分子中负电荷的量就可以用DNA的分子量来代替，反过来，DNA的分子量也就可以用DNA分子所携带的电荷来代替（一句话，DNA分子的电荷/分子量比是恒定的）。 这在蛋白电泳中（特别是SDS-PAGE中）是一样的。在SDS-PAGE中，SDS 将蛋白质变性成直线分子并紧密包裹于其上，使得其所携带的电荷与蛋白分子量成了一定的比例，剩下的就和核酸电泳一样了。 至于为什么核酸的横着跑，蛋白竖着跑，个人认为最大的问题是蛋白制胶的过程导致的。蛋白制胶由于使用了两种不同的凝胶系统，所以需要一个水平的分界面。这个分界面在配胶的过程中是依靠异丙醇在重力作用下的压力下形成的。所以，一并就竖着跑了～～
凝胶回收
AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至8μg DNA（70bp-10Kb），回收率为60-85%。琼脂糖凝胶在温和的缓冲液(DE-A 溶液)中熔化，其中的保护剂能防止线状DNA 在高温下降解，然后在DE-B 溶液的作用下使DNA 选择性结合到膜上。纯化的DNA 纯度高，并保持片断完整性和高生物活性，可直接用于连接、体外转录、PCR 扩增、测序、微注射等分子生物学实验。 一、试剂盒组成、贮存、稳定性 2ml离心管1.5ml离心管说明书 Buffer DE-A：凝胶熔化剂，含DNA 保护剂，防止DNA 在高温下降解。室温密闭贮存。 Buffer DE-B：结合液（促使大于70bp 的DNA 片段选择性结合到DNA 制备膜上）。室温密闭贮存。 Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。 Buffer W2 concentrate：去盐液，使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇（用100%乙醇或95%乙醇），混合均匀，室温密闭贮存。 Eluent：洗脱液，室温密闭贮存。 二、注意事项 1. Buffer DE-A(含有β-巯基乙醇)、Buffer DE-B 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。 2. 在步骤1 中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线型DNA 长时间暴露在高温条件下易于水解），从而提高回收率。勿将含DNA 的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。 3. 在步骤2 中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响DNA 回收率。 4. 将Eluent 或去离子水加热至65°C，有利于提高洗脱效率。 5. DNA 分子呈酸性，建议在2.5 mM Tris-HCl，pH 7.0-8.5 洗脱液中保存。 三、实验准备 1. 第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。 2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。 3. 准备75°C水浴。 4. 使用前，检查Buffer DE-B是否出现沉淀，若出现沉淀，应于70°C温浴加热熔化并冷却至室温后再使用。 四、操作步骤 1. 在紫外灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5 ml 离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100 mg=100 μl 体积）。 2. 加入3 个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C 加热（低熔点琼脂糖凝胶于40°C 加热），间断混合（每2-3 min），直至凝胶块完全熔化（约6-8 min）。 * Buffer DE-A 为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。 3. 加0.5 个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA 片段小于400bp 时，需再加入1 个凝胶体积的异丙醇。
质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告
一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳 二、实验原理： 1.质粒DNA的提取： 质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。 （1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理： 碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。 （2）四种溶液作用及原理： ①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。 ②Solution II的作用：提供碱性条件，pH高达12.6，使大肠杆菌瞬间裂解，促使染色体DNA和质粒DNA变性。所含离子型表面活性剂十二烷基酸钠（SDS）可使细胞膜、核膜发生破裂，充分溶解膜蛋白。同时，磺酸基与蛋白质形成复合物而变形沉淀。 ③Solution III的作用：为KAc-HAc缓冲液。该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基磺酸钠发生反应形成十二烷基磺酸钾，从而将与之结合的绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组DNA一起沉淀，与质粒分离开来；另外溶液III所含有的醋酸中和溶液Ⅱ的强碱性，使pH降至中性，因为长时间的碱性条件会打断DNA；基因组DNA一旦发生断裂，只要是50-100kb大小的片段，就没有办法再被PDS共沉淀，这样就跟质粒DNA共存了。而且在整个质粒DNA 的提取过程中，沉淀DNA时用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行都是为了用化学或物理手段将基因组DNA分子和蛋白质发生变性、在体系中的溶解度降低，较充分的分离提纯出实验所需的质粒DNA
凝胶回收试剂盒
DNA Gel Extraction Spin Protocol The DNA Gel Extraction Kit employs optimized reagents in combination with a convenient Miniprep column to purify DNA fragments from either TAE or TBE agarose gels (regular and low-melt), and impurities including proteins, other organic compounds, salts, et al. are discarded in the process. DNA fragments in a size range of 70 bp to 10 kb can be efficiently recovered. Depending upon the length of the DNA fragments, the recovery rate is approximately 60-85%. DNA fragments purified by this method are full-length with high biological activity. These fragments are suitable for all routine molecular biology applications, such as ligation, PCR, sequencing, etc. 1.Excise the agarose gel slice containing the DNA fragment of interest with a clean, sharp scalpel under ultraviolet illumination. Transfer the gel slice to an EP tube and weigh. In this application, the weight of gel is regarded as equivalent to the volume. For example, 100 mg of gel is equivalent to a 100 μl volume. 2.Add a 3× sample volume of Gel solubilization buffer (溶胶液). Heat at 50-55°C for 10 min until the gel is completely dissolved, Intermittent vortexing will accelerate gel solubilization. Note: If the solution becomes red (yellow for normal), add 10-30ul NaAc (3M, pH5.2) to adjust the color to yellow. 3.Transfer the solubilized agarose into a Miniprep column. Centrifuge at 12,000xg for 1 minute. Discard the filtrate. 4.Add 700 μl washing buffer. Centrifuge at 12,000xg for 1 min. Discard the filtrate. Note: Make sure that 100% ethanol has been added into washing buffer concentrate. Make a notation on the bottle label for future reference. 5.Add 500 μl washing buffer. Centrifuge at 12,000xg for 1 min. Discard the filtrate. 6.Place the Miniprep column back into the 2 ml microfuge tube. Centrifuge at 12,000xg for 2 minute. 7.Transfer the Miniprep column into a clean 1.5 ml microfuge tube, evaporate the ethanol for several minutes at room temperature. 8.To elute the DNA, add 30 μl of Eluent(洗脱缓存液) to the center of the membrane. Let it stand for 3 minute at room temperature. Centrifuge at 12,000xg for 2 minute. Note: Pre-warming the Eluent at 65°C will generally improve elution efficiency. Note: Deionized water can also be used to elute the DNA fragments. 9. Store the DNA at -20°C。
DNA琼脂糖凝胶电泳原理
琼脂糖凝胶电泳进行DNA/RNA定量原理 DNA（RNA）定量分析可用紫外光谱分析，原理是DNA（RNA）分子在260 nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析，因为EB 作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致表示DNA （RNA）量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA(RNA)样品的完整性来进行，缺点是不太准。 琼脂糖凝胶的配制 根据所需凝胶的浓度秤取琼脂糖，加入相应电泳缓冲液中，用微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解，加入适量 EB 混匀，适当冷却后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，凝胶厚度不超过梳孔，如有气泡产生则用玻璃棒驱除，不能过早拔除梳子，应待凝胶完全凝结后才能拔除梳子。 3．P1、P2、P3的配制P1 的配制：在 800ml 去离子水中溶入 Tris 碱 6.06g， Na2EDTA?2H2O 3.72g，用 HCl 调整 pH 至 8.0，用去离子水调整容积至1升，每升P1内加入RNaseA100mg。 P2 的配制：在 950ml 去离子水中溶入 NaOH 8.0g，20％SDS 50ml，调整容积至 1 升。 P3 的配制：在 500ml 去离子水中溶入醋酸钾 294.5g，用冰醋酸调整 pH 值至 5.5，用去离子水调整容积至1升。 4．常用缓冲液： TE pH 7.4 10mmol/LTris?Cl （pH7.4） 1mmol/L EDTA（pH8.0）
PAGE胶蛋白微量回收试剂盒使用说明
PAGE胶蛋白微量回收试剂盒使用说明 货号：G7200 规格：20Assays 保存：所有试剂常温下运输，收到后所有试剂2-8℃保存，溶液B避免火源，溶液A在低温下容易形成沉淀，请在使用前30℃加热，以促进溶解。 产品组成： 产品名称规格 Buffer A10ml Buffer B60ml 干粉9.6g DTT40mg 使用前将干粉和DTT完全溶解于溶液A中，配完后4℃保存，每次使用时30℃加热，以促进溶解，混合好的溶液A尽量在一个月内使用完毕。 产品说明： SDS-PAGE不仅可用于检测蛋白质的相对分子质量，而且也是分离纯化蛋白质的重要工具之一，随着蛋白质技术的微量化，有必要从凝胶中回收蛋白质以用于制备抗体、免疫印迹、氨基酸组分分析或末端序列测定等，本产品就是专门为此用途开发的微量蛋白胶回收法，本产品适用于从考染，铜染或锌染中回收蛋白质，回收效率在50-80%，能够使用20次。 产品特点： 1.简单，不需要复杂而昂贵的仪器（如电洗脱仪）。 2.适用于变性胶（SDS-PAGE）和非变性胶（Native-PAGE）。
3.回收率一般在50-80%之间（跟蛋白质大小，洗脱时间相关）。 4.跟后续的实验兼容，包括1-D、2-D电泳和质谱测序等。 操作步骤： 1.用手术刀片将铜染或锌染的胶块中含有目的条带的部分胶切下，放入1.5mL的 离心管中，用相应的消除液将胶中蛋白质条带脱色到胶体接近无色，室温12000rpm （12830g），离心5min，尽量去除上清，保留胶体。 对于考染或其他考染方法，直接将不需要脱色液脱色的或经过脱色液脱色的胶块中含有目的条带部分切下，放入1.5mL的离心管中，用双蒸水洗两次，每次5min，再进行步骤2。 2.用研磨杆将离心管中的胶体研磨成细小的碎片，加入400μL的溶液A，在室温 条件下，脱色摇床上震荡过夜（16-18小时），期间取出，偶尔震荡几次。 3.室温12000rpm，离心15min，转移上清到另外一个2mL的离心管中，加入2mL 的预冷的溶液B，混匀，4℃放置30min。 4.室温12000rpm，离心15min，去除上清，再将离心管放置在通风厨中，待残 留的液体挥发干净。 也可以再次加入0.5mL的溶液B，震荡洗涤沉淀，4℃放置15min，再重复步骤4一到两次，这样得到的蛋白质更纯净。 5.选用合适的缓冲液溶解沉淀的蛋白质，以方便进行后续的电泳和质谱测序等实 验。 注意事项： 1.在保证完全切取到目的蛋白质后，尽量去除多余的胶片。 2.如果蛋白质的分子量较大，所加样的量较多，胶浓度比较大，可以适当延长温
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤
DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方 法步骤 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA 在碱性条件下（pH8 0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。… 一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。 三、实验材料 实验14提取的DNA样品， 四、器具及药品 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。 五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液（loading buffer）按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到
DNA回收试剂盒原理
DNA回收试剂盒原理 摘要：回收试剂盒的原理是在特定溶液环境下（高盐、低pH)使核酸吸附在固相介 质（一般是硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，洗脱得到纯的DNA片段。 回收试剂盒的原理是在特定溶液环境下（高盐、低pH)使核酸吸附在固相介质（一般是硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，通过改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE（低盐、高pH）中进行洗脱，可去除PCR反应中的dNTPs、引物、矿物油和聚合酶等及DNA样本中的其它杂质，得到的DNA片段可用于酶切、连接、测序、PCR反应模版等后续操作。 目前的回收试剂盒主要有离心柱型和磁珠型两种，离心柱型主要是通过将硅胶膜固定在离心管中，让含有核酸的溶液用离心力或者负压让液体通过硅胶膜，使核酸在特定溶液环境中吸附在硅胶膜上，经过洗涤、洗脱等步骤得到纯的核酸。目前大多数的生物试剂公司生产的回收试剂盒主要是采用该方法来回收核酸，这种方法操作简单、时间短。目前也有很多公司采用磁珠法来提取，不需要离心，可以用于自动化操作。 回收试剂盒可以从琼脂糖凝胶（TAE、TBE）、聚丙烯酰胺凝胶或酶切、PCR等产物中回收DNA片段，根据DNAP片段来源，按照DNA来源上可以分为PCR纯化回收试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒这三类。如果片段大小在50bp-50kb之间，且片段单一，可以采用 PCR纯化回收试剂盒，可以节约跑电泳的时间以及紫外对DNA的破坏，如果片段不是单一条带，可以采取琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，可以切取单一的条带来进行DNA片段的回收。如果需要回收片段更小的DNA片段，可以使用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒来进行。
DNA凝胶回收.
AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒 本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至8 μg DNA(70bp-10Kb,回收率为60-85%。琼脂糖凝 胶在温和的缓冲液(DE-A溶液中熔化,其中的保护剂能防止线状DNA在高温下降解,然后在DE-B溶液 的作用下使DNA选择性结合到膜上。纯化的DNA纯度高,并保持片断完整性和高生物活性,可直接用于 连接、体外转录、PCR扩增、测序、微注射等分子生物学实验。 一、试剂盒组成、贮存、稳定性 Cat. No. AP-GX-4 AP-GX-50 AP-GX-250 制备次数 4 preps 50 preps 250 preps 制备管 4 50 250 2 ml离心管 4 50 250 1.5 ml离心管 4 50 250 Buffer DE-A 6 ml 2×33 ml 2×165ml Buffer DE-B 3 ml 33 ml 165 ml Buffer W1 2.8 ml 28 ml 135 ml Buffer W2 concentrate 2.4 ml24 ml2×72 ml Eluent 1 ml 5 ml 25 ml 说明书 1 1 1
Buffer DE-A:凝胶熔化剂,含DNA保护剂,防止DNA在高温下降解。室温密闭贮存。 Buffer DE-B:结合液(促使大于70bp的DNA片段选择性结合到DNA制备膜上。室温密闭贮存。 Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。 Buffer W2 concentrate:去盐液,使用前,按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇(用100%乙醇或95%乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。 Eluent:洗脱液,室温密闭贮存。 二、注意事项 1. Buffer DE-A(含有β-巯基乙醇、Buffer DE-B和Buffer W1含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套 和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水 或生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。 2. 在步骤1中,将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间(线型DNA长时间暴露在高温条件 下易于水解,从而提高回收率。勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下,减少紫外线对DNA 造成的损伤。 3. 在步骤2中凝胶必须完全熔化,否则将严重影响DNA回收率。 4. 将Eluent或去离子水加热至65°C,有利于提高洗脱效率。
片段凝胶回收试剂盒(离心柱型).
DNA片段凝胶回收试剂盒(离心柱型)一、试剂盒组成、储存、稳定性 试剂盒组成保存5次 SE010试用装 50次 （SE011） 100次 （SE012） 500次 （SE014） 溶胶结合液BD室温4ml40ml80ml400ml 漂洗液W室温2.4ml24ml48ml120×2ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱液EB室温1ml5ml10ml50ml 吸附柱AC室温5个50个100个500个 收集管（2ml）室温5个50个100个500个 说明书室温1份1份1份1份 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 注意事项 1．第一次使用前在漂洗液W中按4：7的比例加入无水乙醇，如包装为24ml漂洗液W中，应加入42ml无水乙醇。加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入! 2．所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。使用前应该恢复到室温。 3．储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。 4．避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 二、原理简介 三博远志自用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，是经过大量实验得出的最佳制品，该试剂盒回收差异小、得率高、操作简便、质量稳定，三博远志PCR测序成功率高有试剂盒的功劳！可大量供货！ Sunbiotech DNA片段凝胶回收试剂盒，利用硅胶膜在低pH值高盐状态下可特异性吸附DNA，在低盐高pH值洗脱的原理，可从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA片段，可去除PCR反应中的dNTPs、引物、矿物油和聚合酶等及DNA样品中的其它杂质，得到的DNA片段可用于酶切、连接、测序、PCR反应模板等后续操作。 三、试剂盒特点 1．离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2．使用了优质溶胶液,不含传统溶胶液的碘化钠和高氯酸盐,不抑制回收后酶切、连接克隆等下游反应。 3．独特的溶胶液/结合液配方,将溶胶和结合两种功能统一,因此一个试剂盒可以运用于琼脂糖DNA 回收,也可以PCR产物清洁纯化,酶切产物纯化回收等多种功能。 4．快速、方便,不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。 四、注意事项（实验前必须首先阅读这部分！） 1.所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C或者类似离心机。 2.溶胶液/结合液中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染 皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或者生理盐水冲洗。 2.回收的DNA量和起始DNA的量，洗脱体积，DNA片断大小有关。一般回收的量为5-25μg，大小为 100bp-10kb的DNA片段，回收率可达85％－95％。更大或更小回收效率较低。特别是大于50kb或小于10bp效率更低。
琼脂糖凝胶电泳浓度与dna长度的确定
琼脂糖凝胶电泳：胶浓度与DNA长度的关系 2010年1月22日 1,527 views Biology 没有评论 胶回收DNA注意事项 ①切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部 回收。所以为了减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶 来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑 胶。这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。 ②主要还是DNA的浓度, 如果DNA浓度不够, 想胶小点也不可能。 ③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料 薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污 染。 ④利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的 片段可能有以下几个原因：胶块未完全溶解，可适当延长水浴 时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积太大，应先将 其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高
盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无水乙醇。 ⑤可以改用去离子水洗脱。但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH值，以增加洗脱得率。 ⑥洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收效率低的解决方案。 ⑦不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。 ⑧电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。 ⑨琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好；含目的片段的凝胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃；制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。 关于胶回收切胶的一点注意事项 1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。 2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。 3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。 4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker间的相对位置已知，根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如果觉得很难判断，可以直接在marker边点少
实验七dna的琼脂糖凝胶电泳
实验七DNA的琼脂糖凝胶电泳（4学时） 实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 核酸分子是两性解离分子，是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA 与等长的双链DNA的泳动率大致相同。 影响核酸分子泳动率的因素主要是： 1、样品的物理性状 即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。
对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。 DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。 2、支持物介质 核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成，其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。 琼脂糖凝胶适合分离长度100至60的分子，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段 （5bp-500bp）的分离效果最好。选择不同浓度的凝胶，可以分离不同大小范围的DNA分子。 3、电场强度 电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过4V/cm。而对于大片段电泳，甚至用电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。 4、缓冲液离子强度 核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时，会使DNA 污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。 在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。 缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。