第八章 核酸分子杂交技术

第八章核酸分子杂交技术

主要用途：①核酸定性或定量检测；②基因克隆、突变及其表达研究；③疾病的临床诊断。

第一节核酸杂交概述及基本原理

一、核酸杂交概述

?1961年Hall等建立核酸杂交技术，探针与靶序列溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体；

?60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素(NC)膜上的DNA序列奠定了基础；

?70年代末期到80年代早期，分子克隆技术的出现，各种质粒和噬菌体DAN载体系统的构建，使特异性DNA探针的来源变得十分丰富；

?80年代中期，PCR技术的发明与核酸分子杂交有机的结合，又使得核酸分子杂交技术的灵敏度大大提高；

?90年代，基因芯片技术的出现使得一次性对大量样品序列进行检测和分析成为可能，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、

检测效率低等不足。

核酸的结构：一级结构：核苷酸的排列循序，稳定键为磷酸二酯键；

二级结构：双螺旋结构，稳定键为氢键、碱基堆积力、疏水键；

高级结构：染色体

二、核酸变性

核酸变性(nucleic acid denaturation)：在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构

的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。

?化学键变化：维持双螺旋稳定的氢键和疏水键发生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。

?化学结构变化：DNA变性改变了其空间结构，不涉及到其一级结构的改变。

DNA的变性因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成为变性的条件。

如加热；极端的pH；有机试剂(甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等)

变性DNA的性质：变性能导致DNA的一些理化性质及生物学性质发生改变

①溶液黏度降低---DNA双螺旋是紧密的“刚性”结构，变性后代之以“柔软”无规则单股线性

结构，DNA黏度明显下降。

②溶液旋光性发生改变---变性后DNA分子的对称性及局部构型改变。

③紫外吸收增加---DNA变性后，DNA 溶液的紫外吸收增强，双链DNA＜单链DNA＜单核苷酸。变性DNA的增色效应

增色效应(hyperchromic effect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。

?DNA分子在250-280nm 波长具有吸收紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。

?增色效应可以作为DNA变性的指标。

?不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性，其260nm的吸光度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围大多在20-30%之间。

解链曲线：通常利用DNA变性后在波长260nm处吸光度(A260)的增加来监测DNA变性的过程。如果以温度对A260的关系作图，所得的曲线称为解链曲线。典型DNA变性曲线呈S型。

融解温度(Tm)：在热变性过程中，紫外吸收值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度。

Tm的特点：①爆发式：热变性是在变性温度范围内突发的跃变过程，很像结晶达到熔点时

的融化现象，故名融解温度。②狭窄性：变性温度范围很小。

Tm的影响因素：DNA分子大小和碱基的组成；溶液的离子强度；pH值；变性剂。

⑴DNA分子大小和碱基的组成：

不同来源DNA间的Tm存在差别，在溶剂相同的前提下，这种差别主要是由DNA本身

下列两方面的性质所造成的：DNA的均一性；DNA的(G+C)含量。

DNA的均一性有2种含义：

①DNA分子中碱基组成的均一性：如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段，与天

然DNA比较，其Tm值范围就较窄。因前者变性时氢键断裂几乎可“齐同”进行。

②待测DNA样品组成的均一性：如样品中只含有一种病毒DNA，其Tm值范围较窄，若混

有其它来源的DNA，则Tm值范围较宽。

DNA的(G+C)含量：在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于DNA分子中的(G+C)的含量，(G+C)含量越高，G-C碱基对越多，Tm值越高。因为G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱

基对只有2对氢键，DNA中(G+C)含量高显然更能增强结构的稳定性，破坏G-C间氢键需

比A-T氢键付出更多的能量。

Tm与(G+C)含量的关系：Tm与DNA中(G+C)含量存在着密切相关性

Tm值与碱基对组成的经验公式：Tm = 69.3 +0.41(G+C)%

小于20bp的寡核苷酸的Tm计算公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)

⑵溶液的离子强度：离子强度较低时，Tm值较低，而且解链的温度范围也较宽。这是由于

溶液中离子与DNA分子中磷酸基团形成离子键，需要较高温度才能使DNA变性。

⑶pH值：pH值影响氢键的形成。pH值在5-9范围内，Tm值变化不明显。

当溶液pH值小于4时或大于11时，均不利于氢键的形成，DNA容易变性。

⑷变性剂：干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值。

常用的变性剂有甲酰胺、尿素、甲醛等。

三、核酸复性

核酸复性(nucleic acid renaturation)：指变性DNA在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。

退火(annealing)：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。

核酸复性的影响因素：温度和时间；DNA浓度；DNA分子大小和复杂度；离子强度。

⑴温度和时间：一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复

性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低

温(如4℃以下)，复性几乎是不可能的。

⑵DNA浓度：DNA复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核”，“成核”速度与DNA

浓度的平方成正比，溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大。

⑶DNA分子大小和复杂度：DNA分子越大，复性速率越慢；DNA分子越复杂，复性速率也越慢。

⑷离子强度：增加盐浓度可加快互补链合成双链的速度，因为盐能中和DNA单链中磷酸基

团的负电荷，减少互补链静电排斥作用。

四、核酸分子杂交

核酸分子杂交(molecular hybridization)：两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条

RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。

?杂交的本质：就是在一定条件下使互补核酸链实现复性

?利用探针(probe)与靶DNA杂交，可识别靶DNA中的特异核苷酸序列

第二节核酸探针

一、核酸探针的类型

核酸探针(nucleic acid probe)：是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用

特殊方法检测的已知被标记的核酸分子。

选择探针的最基本的原则：①高度特异性；②探针的来源是否方便；③制备探针的难易程度。

核酸探针的类型：基因组DNA探针；cDNA探针；RNA探针；人工合成的寡核苷酸探针。

⑴基因组DNA探针：

来源：这类探针来源于某种生物的基因组，多为某一基因的全部或部分序列

制备方法：基因克隆的方法；聚合酶链反应(PCR)。

特点：①多克隆在载体中的DNA片段，可无限繁殖，取之不尽；②PCR制备探针简便和省时；

③相对RNA而言，DNA探针不易降解，标记方法也较成熟。

⑵cDNA探针：是指与mRNA互补的DNA分子。

特点：不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究。

⑶RNA探针：因为RNA分子大多以单链形式存在，几乎不存在互补双链的竞争结合，所以

RNA探针与靶序列的杂交效率较高，稳定性也高。另外RNA分子中不存在高度重复序列，

因此会减少非特异性杂交少，杂交后可用RNA酶将未杂交的探针分子水解去除，降低本

底的干扰。但RNA探针有易降解和标记方法复杂等缺点，限制了其广泛应用。

⑷寡核苷酸探针：

特点：①根据需要来合成相应的核酸序列，避免天然探针的缺点；②探针长度一般为10-50bp；③尤其适合点突变的检测④由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信

号较弱，但经过精心设计仍可设计出非常特异的寡核苷酸探针。

设计原则：①探针长度，一般要求在10-50bp；②G/C含量为40％-60％；③探针分子中应避免互补序列；④避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或-CCCC-；

⑤借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较；

二、核酸探针的标记

理想的探针标记物应具有以下特点：①检测物要灵敏、特异、稳定、简便；②标记物与

探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值；③标记物对环境

污染小，对人体无损伤，价格低廉；④标记物对检测方法无干扰。

根据标记物的特性，核酸的标记探针可分为放射性同位素标记和非放射性标记两大类。

⑴放射性同位素标记：

常用标记探针的同位素有32P、35S、3H、125I。

32P：半衰期短(14.3d)，常用标记物为核苷三磷酸，释放的β粒子能量高，灵敏度很高，但分辨率不高。

35S：标记蛋氨酸及其取代核苷三磷酸的α位磷酸基中的氧，释放β粒子，灵敏度高，分辨率较高，核酸序列测定和原位杂交。

3H：半衰期长(4417d)，释放的β粒子能量低，使用较少。

125I：释放γ粒子，分辨率高，操作简单，安全防护要求较高，原位杂交。

同位素标记探针的优缺点：

优点：检测灵敏度极高，10-14-10-18g，特异性强，对各种酶促反应几乎无影响，不影响碱基配对。

缺点：放射性污染，半衰期限制，高活性对核酸的破坏。

同位素标记探针的方法：①缺口平移法(双链)；②随机引物法(单链)；③DNA探针的末端标

记法；④PCR标记DNA探针；⑤单向体外转录制备RNA探针。

DNA探针的末端标记---利用T4 DNA聚合酶标记3′- 端DNA探针

PCR标记DNA探针---标记率高，重复性好，简便快速，可大量制备。

⑵非放射性标记：

非放射性标记核酸探针的方法分为化学修饰标记法和酶促反应标记法。

?化学修饰法：简单、成本低、较通用。

?酶促反应标记法：灵敏度高，过程较复杂，成本较高。

常用的非放射标记物有辣根过氧化物酶、荧光素、生物素、光敏生物素、地高辛等。

①酶标记核酸探针：将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶(ALP)与变性后的DNA结合，生成酶标DNA分子。其中辣根过氧化物酶(HRP)易进入细胞内部，便宜，易观察，应用最广泛。常用标记方法是戊二醛交联法和过碘酸钠法。

②荧光素(fluorescein)：标记方法有直接法和间接法。

③生物素(biotin)标记核酸探针应用广泛，可替代同位素标记。用链亲和素系统检测。酶促标记法操作复杂，价格昂贵。光敏生物素(photobiotin)标记方法简单，价格适宜。

④地高辛(DIG)：标记于dUTP上，通过随机引物或缺口平移法引入DNA分子中。可长期保存，不受组织、细胞中内源性生物素的干扰，敏感性高，检测产物反差好，背景染色低。广泛应用于Southern印迹杂交、斑点杂交、菌落杂交尤其是原位杂交。

三、标记探针的纯化和检测

探针制备和标记时加入的dNTP是过量，除去游离标记物及其dNTP。

标记探针的纯化方法有凝胶过滤层析法和乙醇沉淀法。

凝胶过滤层析法---利用凝胶的分子筛作用

乙醇沉淀法---沉淀探针DNA

放射性同位素探针的检测可采用放射自显影或液闪计数法。

放射自显影：接触法；液体乳胶法；电镜自显影。

非放射性探针的检测：①偶联反应；②显色反应：酶促显色法；荧光法；化学发光法。

第三节核酸分子杂交技术

分子杂交(hybridization)：样品核酸变性处理，在低温条件下，加入标记的核酸探针，探针与样品互补序列形成杂交双链，通过显示标记物或其它方法来检测特定的核酸片段

按照杂交的反应条件分为固相和液相杂交两类：

①固相杂交：②液相杂交

?探针探针

?被测DNA(RNA) 被测DNA(RNA)

在固体支持物上杂交在液体中杂交

一、固相核酸分子杂交

固相分子杂交：是将待测的靶核苷酸链预先固定在固体支持物上，然后放入含有标记探针的杂交液中，进行杂交反应后，使杂交分子留在支持物上，故称固体杂交。固体杂交的优点：未杂交的游离探针通过漂洗可容易除去，膜上的杂交分子容易检测，还能防止靶DNA的自我复性，所以被广泛应用。

分子杂交技术一般过程

①探针制备及标记（同位素或非同位素）

②待测核酸样品制备（分离，纯化）

③杂交（液相，固相，原位杂交）

④杂交后处理（去掉非特异杂交分子）

⑤显示结果（显色，发光，放射自显影）

⑥结果分析

核酸分子杂交技术类型：

Northern印迹杂交流程图固相核酸分子杂交：

⑴Southern印迹杂交：DNA变性；中和；Southern印迹；预杂交；杂交；洗膜；检测

⑵Northern印迹杂交：Northern印迹(Northern blot)杂交是应用DNA探针检测特异mRNA

的另一种膜上印迹技术。是由Alwine于1977年建立的，后经Thomas等人改进。主要用

于分析mRNA分子大小及mRNA的转录情况。

Northern印迹杂交与Southern印迹杂交比较：

①RNA提取过程中需特别注意RNA酶的污染

②所用的器材最好与Southern印迹实验的分开使用

③RNA变性的方法：不能用碱变性，因为碱会水解RNA的2…-羟基基团，在变性剂的

存在下进行电泳，防止RNA分子形成发夹式的二级结构，以保持其单链线形状态

④印迹前将含变性剂的凝胶用水冲洗掉，再印迹、杂交

⑤如果测定RNA片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物

切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印

⑶斑点杂交(Dot-blot)

正向：是将待检样(DNA、RNA 或细胞)直接点到膜上，烘烤固定

反向：是将探针固定

?斑点杂交不需电泳和转膜过程，整个操作过程简便、快速

?但结果无法判断核酸片段的大小，也无法判断样品溶液中是否存在着不同的靶序列

?多用作核酸定性或半定量分析，而且便于杂交条件的摸索

⑷菌落杂交

⑸微板酶联杂交

?DNA结合微孔板上包被的捕获探针与样品DNA的一条链进行杂交，检测探针则与

此链的另一区域进行杂交

?夹心杂交后，加入亲合素-辣根过氧化物酶结合物及其底物四甲基联苯氨，显色，测量吸光度

?根据吸光度值的大小对样品进行半定量分析

?捕获探针共价结合在微孔板上，不仅结合牢固而且结合量大，因而捕获能力很强

?捕获探针竖直地而不是平躺地“包被”在微孔板表面，因而与目的片段的杂交效率很高

?检测探针5?端、3?端均标记生物素，等量检测探针结合亲合素-辣根过氧化物酶的量增加

二、原位核酸分子杂交

原位杂交(In situ hybridization)：是以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织

切片中核酸进行杂交并对其检测的方法。它属于固相分子杂交的范畴，但有别于其它任何固

相核酸分子杂交技术。

原位杂交技术除了具有核酸分子杂交的特异性高的特点之外，并可精确定位，因此该技术已

广泛地应用于医学分子生物学的研究之中。其应用有以下几方面：①正常或异常染色体的基

因定位；②应用核酸探针与细胞内RNA进行杂交用于检测该组织细胞中特定基因表达水平；

③应用特异的病原体核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以检测有无该病原体的感染。

原位杂交材料：石蜡包埋组织切片；冰冻切片；细胞涂片；培养细胞爬片。

基本方法：①细胞或组织切片的处理：玻片清洗；组织和细胞的固定。

②增强组织的通透性和核酸探针的穿透性

③预杂交

④杂交

⑤杂交后漂洗

⑥结果检测

荧光原位杂交(FISH)是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。

主要包括：①生物素标记探针与荧光素标记的抗生物素抗体。

②地高辛标记的抗体与荧光素标记的抗地高辛抗体。

③氨乙酰基荧光(aminoacetylfluroence,AAF)-改良探针与抗AAF抗血清等。

上述的检测系统有直接法和间接法两种，后者灵敏度更高。

三、液相核酸分子杂交

①吸附杂交：磁珠吸附杂交；亲和吸附杂交；羟基磷灰石吸附杂交。

②发光液相杂交：能量的传递法；丫啶翁酯标记法。

四、核酸分子杂交实验条件的优化

探针的选择：检测靶序列上的单个碱基改变选用寡核苷酸探针；在检测单链靶序列选用与其

互补的DNA单链探针或RNA探针。长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核

苷酸序列和病原体；而100bp左右的探针适合原位杂交。

探针的标记方法：在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。

在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和价廉的HRP显示系统等。

探针的浓度：随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性

增加。膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5-10ng/ml和25-1000ng/ml，

而原位杂交中，一般各种标记探针，其用量均为0.5-5.0μg/ml 。

杂交最适温度：

·杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。若反应温度低于Tm 10-15℃，

碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少；最适复性温度比Tm低25℃。

一般情况下，在不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在65℃进行，当含50%甲酰胺时，

在42℃进行。

·Tm值与(G+C)含量、探针的长度、复杂性、杂交体系中离子强度及甲酰胺的含量有关。

下面的经验公式可以帮助较准确的估计Tm值：Tm=81.5℃+16.6IgM+0.41(G+C)%

-500/n-0.61(甲酰胺％)，其中M为Na+摩尔浓度，n为探针的复杂性(没有重复序列时，复

杂性即为探针的长度，单位为bp)。

·例一个长度为500bp的探针，(G+C)含量为55%，在含有5×SSC（0.75mol/L Na+）和50%

甲酰胺的杂交体系中，其Tm值为Tm=81.5+(-2.07)+22.5-1-30.5=70.4℃，

T=70.4-15~70.4-25=55.4~45.4℃；

·而对于寡核苷酸探针Tm值的估计，使用下列公式则更为方便：Tm=4℃×(G+C)+2℃×(A+T)。

反应时间：杂交时间短了，反应无法完成；长了引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。洗膜温度：杂交后的最终洗膜温度一般应低于Tm值5-12℃进行。

第四节基因芯片

一、基因芯片的原理

基因芯片(gene chip)又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray)，将大量的基

因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片。该技术是建立

在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段。

二、基因芯片的制备

其分析步骤可分为：芯片的制备；样品处理；杂交反应；检测及数据处理。

样品的处理：

?样品的扩增：在标记和分析前对样品进行适当程度的扩增，以提高阅读灵敏度；

?待测样品的标记：多采用荧光标记方法，对于阵列密度较小的基因芯片可以用同位素检测法。

杂交反应：

?cDNA基因芯片与靶基因的杂交过程与常规的分子杂交过程基本相同；

?用于检测基因表达，较长的杂交时间，高的严谨性，高的样品浓度和低温度；

?用于突变检测，因要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。

结果检测分析：

?检测方法很多，如荧光显影法、质谱法、化学发光和光导纤维等。

?检测系统主要由信号产生、信号收集及传输、信号处理及成像三个部分组成。

?使用最广泛的是荧光显影法。

固相载体：固体片状材料主要有玻片、硅片和瓷片；固体膜性材料有硝酸纤维素膜、聚丙烯膜以及尼龙膜。分型：按固体支持物不同，基因芯片可分为：薄膜型、玻片型、微板型、集成电路型、微通道型等。

近年基因芯片技术结合微电极技术、微型聚乙烯酰胺凝胶技术、高速微通道技术制备出了电

子芯片、三维芯片、流过式芯片等新型芯片。

合成点样：

?点样探针：基因组探针、cDNA探针以及寡核苷酸探针；

?载体表面的活化主要是涂布多聚赖氨酸或者包被氨基硅烷偶联试剂，使载体表面带有羟基或者氨基等活性基团。

?合成点样过程：机械臂将不同探针样品定量(0.25～1.0μl)点样于预处理好的基板相应位置上，在基板上产生直径为100～150μm斑点，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。

?点样装置的不同分为：打印法合成点样及其喷印法合成点样；

?打印法的优点是探针密度较高，1平方厘米通常可打印2,500个探针。缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞。

?喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长。缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，1平方厘米通常只可喷印400个探针。

原位合成：基因芯片的原位合成法是基于组合化学的合成原理，它通过一组定位模板来决定

基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。

分子印章原位合成：分子印章技术(Molecular Stamps)是一种软光刻技术，分子印章是一种表

面有微结构的硅橡胶模板，该方法特点是分辨率、准确率以及产率高。

光引导聚合原位合成：光引导聚合技术(Light-directed synthesis)又称原位光刻技术，是应用

最广的原位合成技术，它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子；光引导聚

合技术是照相平板印刷技术与成熟且已自动化的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。

原位喷印合成：原位喷印合成(Ink-Jet Printing synthesis)，原理及其过程与喷墨打印类似，不

过芯片喷印头和墨盒有多个，其中墨盒中装的是四种碱基液体，喷印头可在整个芯片上移动，

并根据芯片上不同位点探针的序列需要，将特定碱基喷印在芯片的特定位置。该技术采用的

原理与传统的DNA固相合成相一致，无需特殊的化学试剂。

原位合成法与合成点样方式的比较

三、基因芯片技术在医学领域的应用

基因芯片技术的基本应用可以分为2个主要方面：

①定量分析(主要指测序和突变检测)；②定性分析(主要指对基因表达的研究)。

⑴基因表达水平的检测

⑵基因突变和多态性的检测

⑶基因芯片在药物筛选中的应用

⑷预防医学领域的应用

⑸基因芯片在疾病诊断中的应用：感染性疾病诊断；遗传性疾病的诊断

传统检测方法与基因芯片检测方法比较