美国药典-微生物检测

〈61〉非无菌产品的微生物检测：微生物计数检测法

生长促进试验和计数方法的适用性

概述

在供试品存在的情况下，必须确立检测微生物的试验能力。

如果引入了可能影响试验结果的在测试性能或产品方面的变更，则必须确认其适用性。

供试菌株的制备

使用供试菌株的标准化稳定悬浮液或者按照以下所述制备。使用菌种保存技术（种子批系统）以便用于接种的可萌发微生物从最初的主种子批不超过五代。按照表1中的描述，分别培养每种细菌和真菌供试菌株。

表1.供试微生物的制备和使用

用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液或pH7.2的磷酸盐缓冲液配制供试悬浮液；为使黑曲霉孢子悬浮，可将0.05%的聚山梨醇酯80加

入该缓冲液中。这些悬浮液需在2个小时之内使用，或存放在2o～8o条件下24小时内使用。作为制备并稀释黑曲霉或枯草杆菌营养细胞的新鲜悬浮液的替代方法，可制备稳定的孢子悬浮液，然后将适量的孢子悬浮液用于试验接种。稳定的孢子悬浮液可在2o～8o下保存，保存期经过时间验证。

阴性对照

为了确认试验的条件，用所选的稀释液替代供试品阴性对照。必须没有微生物的生长。

培养基的生长促进

对每一批已制备好的培养基和每一批从脱水培养基或根据描述的组分制备出来的培养基进行测试。

在部分/整个平皿内的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基和大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu) 表1中指定的微生物，每种微生物均使用单独一部分/整个平皿培养基。在平皿内的沙氏葡萄糖琼脂培养基中接种少量(不超过100cfu)表1中指定的微生物，每种均使用一个单独平皿的培养基。按照表１中描述的条件进行培养。对于固体培养基，所获得的生长与标准化接种体的计算值之间的差异因素不大于2。对于刚刚制备好的接种体，发生的微生物生长与用此前检验并批准过的培养基批次所得到的微生物生长相当。如果出现了与此前从上一个经过测试并通过的培养基批次获得的微生物生长相当、清晰可见的微生物生长，则液体培养基适用。

供试品计数法的适用性

样品的制备

样品制备方法取决于供试品的物理特征。如果以下描述的规程不能够被令人满意地证实，则必须开发一个适用的替代规程。

水溶性产品—溶解或稀释（通常制备1:10的稀释液）供试品，于pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，pH7.2的磷酸盐缓冲液或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中。如有必要，调整pH值为6至8。需要时，用相同的稀释剂作进一步稀释。

不溶于水的非脂肪性产品—将供试品（通常制备1:10的稀释液）悬浮于pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液，pH7.2的磷酸盐缓冲液或大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中。可以加入表面活性剂，如1g/L的聚山梨酯80，以帮助难以与水混合的物质悬浮。如有必要，调整pH值为6至8。需要时，用相同的稀释剂进一步稀释。

脂肪性产品—溶解于以过滤除菌的豆蔻酸异丙酯，或者将供试品与所需最少量的、经过加热的无菌聚山梨酯80或另一种非抑菌性的无菌表面活性剂进行混合，如有必要，可加热至不超过40o或者在特殊情况下不超过45o。仔细混匀，如有必要，在水浴锅里中维持该温度。加入充足数量、经过预热的所选择稀释剂，制成原产品的1:10稀释液。仔细混匀，同时维持该温度至形成乳化剂所必需的最短的时间。可以用所选择的含有适当浓度的无菌聚山梨酯80或者另一种非抑菌性的无菌表面活性剂的稀释液，来制备后续的系列10倍稀释液。

液体或固体悬浮微粒状—以无菌操作将供试品转移至一个膜过滤设

备或无菌容器中做进一步取样。使用每个待检容器中的全部内容物或规定数量的一定剂量。

贴剂——去除贴剂的防护面（“释放衬板”）并将它们放置在无菌玻璃或塑料托盘上，将有粘性的一面朝上。用适当的无菌多孔材料（如：无菌纱布）盖住粘性面，以防止贴剂粘在一起，并将10片贴剂转移到所选的含有灭活剂（如：聚山梨醇酯80和/或卵磷脂）的适量稀释剂中。振摇供试品至少30分钟。

接种和稀释

加入足量的微生物悬浮液到按上述规定制备的样品及对照品（不含检测物）中，以获得一个不多于100 cfu的接种体。接种体的悬浮液体积应当不超过被稀释供试品体积的1%。

为证明供试品有可接受的微生物回收率，必须使用已制备样品的最低可能稀释倍数来进行检测。如果由于抗菌活性或低溶解度而无法做到这一点时，必须进一步开发合适的规程。如果样品对生长的抑制不能避免，可以在中和、稀释或过滤后加入等量的微生物悬浮液。

抗菌活性的中和/去除

用制备好的样品按接种和稀释项下的描述稀释，并按供试品微生物的回收率规程培养，将从中回收的微生物数量与从对照品中回收的微生物数量进行比较。

如果生长被抑制（以大于2的因素减少），那么修改特定的计数测试规程以确保结果的有效性。规程的修改可以包括，例如：

1. 稀释剂或培养基体积的增加；

2. 将某个特定或通用的中和剂加合到稀释剂中；

3. 膜过滤；或

4. 综合以上措施

中和剂——中和剂可以用于中和抗菌剂（见表2）的活性。最好在灭菌前将它们加入到所选的稀释来论证它们的功效和无毒性。

表2.对干扰物质的常用中和剂/方法

如果没有找到合适的中和方法，则可以假定未能分离所接种有机体的原因是供试品杀灭微生物活性。这个信息帮助指出此物品不太可能被特定微生物种群污染。然而，有可能供试品只抑制这里所列出微生物中的某些，而并不抑制未包括在供试菌株之中其他微生物或者后者对其不具代表性的那些微生物。然后，用与微生物生长和具体接受标准相适应的最高稀释倍数进行试验。

供试品中微生物的回收

膜过滤—使用标准孔径不超过0.45 μm的膜过滤器。过滤器材质的类型按以下标准选择，即细菌保留效能不被待检测样品的成分所影响。对于所列出的每个微生物，单独使用一个膜过滤器。

将按照样品的制备、接种、稀释和抗菌活性的中和/去除项下描述所制备的适当数量的样品（最好相当于1克产品，在cfu数量预计较大时，可减用量）转移至膜过滤器，立即过滤，并用适量的稀释剂冲洗膜过滤器。

为确定总好氧微生物计数（TAMC），将滤膜转移至大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的表面。为确定总酵母菌和霉菌联合计数（TYMC），将膜转移至沙氏葡萄糖琼脂培养基的表面。按表1中规定培养这些平皿，进行计数。

平板计数法—每种培养基至少进行两次平板计数法，并使用计数结果的平均值。

倾注平板法—在直径为9cm的平皿中，加入按样品的制备、接种、稀释和抗菌活性的中和/去除项下的描述所制备的样品 1 mL以及15～20 mL大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基加入至平皿，此两种培养基的温度均保持在不超过45o。如果使用较大的平皿，琼脂培养基的量也相应地增加。对于表1中所列出的每一个微生物至少要使用两个平皿。

按表 1 中的指示培养这些平皿。取每培养基计数的算术平均值，计算在最初的接种体中的菌落数（cfu）数量。

表面铺展法—对于直径为9cm的平皿，倾入15～20 mL、温度约为45o的大豆酪蛋白消化物琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基至每个平皿中，静置凝固。如果使用较大的平皿，琼脂的数量也需相应地增加。干燥平皿，例如，在层流柜或恒温箱里。对于表1中列出的每个微生物，至少使用两个平皿。将已称量好的体积不少于0.1 mL、按照样品的制备、接种、稀释和抗菌活性的中和/去除项下的规定所制备的样品，铺展在培养基的表面。按照倾注培养法项下的规定进行培养和计数。

最大可能数（MPN）法—MPN法的精密度和准确度低于膜过滤法或平板计数法。所获得的霉菌计数的结果尤其不可靠。由于这些原因，MPN法被保留用于当没有其它可行方法情况下的总好氧微生物计数。如果该方法的使用有据可可循，则按如下进行。

按样品的制备，接种和稀释，以及抗菌活性的中和/移除这些项下的描述，制备一系列至少三个连续、每级稀释10倍的产品稀释液。从每个水平的稀释液中将1克或者1毫升的三等分的试样接种到三管装有9～10毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基的试管中。如有必要，加入表面活性剂，如聚山梨醇酯80或抗菌灭活剂到培养基中。因此，如果制备了三水平的稀释液，则会接种九个试管。

在30o～35o温度下培养所有的试管不超过3天。如果由于供试品的性质导致结果的读数很困难或不确定，则在相同温度下，在同样的肉汤培养基或大豆酪蛋白消化物琼脂培养基中在同样温度下放置1～2天再次培养，并且使用这些结果。从表3确定每克或每毫升供试品

中微生物的最大可能数。

表3 微生物的最大可能数值

结果和说明

当确认膜过滤法或平板计数法的适用性时，任何供试微生物的平均计数与在没有产品的情况下，从培养和稀释项下规定的对照组的数值差距必须不超过2。当确认最大可能数法的适用性时，从接种体得到的计算值必须是在从对照组取得结果的95%置信区间内。

如果上述标准不能用任何一种所叙述的方法符合检测有机体中的一种，那么使用最接近标准的方法和检测条件来检测该供试品。

供试品的测试

供试品的检测

膜过滤

使用能够将滤膜转移至培养基中的过滤设备。按生长促进测试和计数方法的适用性项下描述的、已经证明适用的方法制备样品，转移合适的量至两个膜过滤器中的每一个，并立即过滤。按照以下已经证明适用的规程清洗每个过滤器。

对于总好氧微生物计数的测定，转移滤膜中的一个至大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的表面。对酵母菌和霉菌联合计数的测定，转移另一个滤膜至沙氏葡萄糖琼脂培养基的表面。在温度30o～35o之间培养大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的平皿3～5天，并在温度20o～25o 之间培养沙氏葡萄糖琼脂培养基的平皿5～7天。计算每克或每毫升

供试品的菌落数（cfu）数量。

当检测贴剂时，分别将样品的制备项下描述的制备品数量的10%过滤通过两个无菌滤膜中的一个。为总好氧微生物计数将一个滤膜转移至大豆酪蛋白消化物琼脂培养基，以检测总好氧微生物计数，而将另一个滤膜转移至沙氏葡萄糖琼脂培养基，以检测总酵母菌和霉菌联合计数。

平板计数法

倾注培养法——使用已经证明适用的、在生长促进测试和计数方法的适用性项下描述的方法制备样品。对于每种培养基，为每个稀释水平准备至少两个培养平皿。在温度30o～35o之间，培养大豆酪蛋白消化物琼脂培养基的平皿3～5天，并在温度20o～25o之间，培养沙氏葡萄糖琼脂的平皿5～7天。选择总好氧微生物的数量不超过250个和总酵母和霉菌的数量不超过50的稀释平板进行计数。取每培养基计数的算术平均值，并计算每克或每毫升供试品的cfu数量。

表面铺展法——使用已经证明适用的、在生长促进测试和计数方法的适用性项下描述的方法制备供试品。为每种培养基和每个稀释水平准备至少两个培养平皿和不同程度的稀释液。对于培养和cfu数量的计算，直接按倾注培养法进行。

最大可能数法

使用已经证明适当的、在生长促进测试和计数方法的适用性项下描述的方法制备和稀释样品。在温度30o至35o之间时，培养所有试管3到5天。如有必要，则使用已经证实适合的规程再次培养。记录不

同稀释水平下显示出微生物生长的试管数。从表3中确定每克或每毫升供试品中微生物的最大可能数。

结果的说明

总好氧微生物计数（TAMC）被认为等于使用大豆酪蛋白消化物琼脂培养基所发现的cfu数量，如果在该培养基上发现真菌的菌落，则它们作为总好氧微生物计数的一部分来计数。总酵母菌和霉菌联合计数（TYMC）被认为等于使用沙氏葡萄糖琼脂培养基所发现的cfu数量，如果在该培养基上发现细菌的菌落，则它们作为总酵母菌和霉菌联合计数的一部分来计数。当细菌的生长导致总酵母菌和霉菌联合计数预计超过接受标准时，可以使用含有抗生素的沙氏葡萄糖琼脂培养基。如果通过最大可能数法进行计数，则计算出的数值就是总好氧微生物计数。

当规定微生物质量的接受标准给出时，可作如下解释：

101 cfu: 可接受的最大计数＝20；

102 cfu: 可接受的最大计数＝200；

103 cfu: 可接受的最大计数＝2000；

等等。

推荐的溶液和培养基在非无菌产品微生物学检查：指定微生物检查<62>中描述。

〈62〉非无菌产品的微生物检测：特定微生物检测

产品的检测

胆汁耐性革兰氏阴性菌

样品的制备和预培养—按照非无菌产品生物学检测：微生物计数检查法<61>章节中的描述，将不少于1克的供试品以1:10稀释来制备样品，但是使用大豆酪蛋白消化物肉汤培养基作为所选择的稀释剂，混匀，并在20o～25o时培养一段时间，此时间段足以使细菌复苏但不足以促进微生物的繁殖（通常2个小时而不超过5小时）。

确认微生物不存在的检测—除非另有规定，否则使用按样品的制备和预培养项下规定制备的、对应的1克该产品的制备品，接种至肠道菌增菌肉汤培养基Mossel。在温度30o～35 o下培养24～48小时。再次培养紫红色胆汁葡萄糖琼脂培养基平皿上。在温度30 o～35 o下培养18～24小时。

如果没有菌落生长，则供试品符合该检测的要求。

定量检测—选择和再培养—将在样品的制备和预培养项下规定的制备品和/或分别包含0.1克，0.01克，和0.001克（或0.1毫升，0.01毫升，和0.001毫升）该供试品的稀释液，接种于适量的肠道菌增菌肉汤培养基Mossel。在温度30o～35 o下培养24～48小时。在紫红色胆汁葡萄琼脂培养基的平皿上对培养物进行再次培养。在温度30 o～35 o下培养18～24小时。

说明—菌落的生长构成了阳性结果。记录产生阳性结果的最少量供试品和产生阴性结果的最大量供试品。从表2中大概确定细菌的数量。

表 2. 结果说明

大肠杆菌

样品的制备和预培养—按非无菌产品微生物学检测：微生物计数检查法<61>章节下的描述，将不少于1克的供试品以1:10稀释来制备样品，并使用10毫升或对应1克或1毫升的数量，接种于适量（按照检查方法的适用性项下的内容来确定）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基，混匀，并在温度30o～35 o下培养18～24小时。

选择和再次培养—摇动容器，转移1毫升大豆酪蛋白消化物肉汤培养基至100毫升的麦康基肉汤培养基，并在温度42 o～44 o下培养24～48小时。在温度30o～35o下，于麦康基琼脂培养基的平皿上再次培养18～72小时。

说明—菌落的生长表明可能有大肠杆菌存在，这由鉴定检测确定。如果没有该菌落存在或者鉴定检测呈阴性，则样品符合该检测要求。

建议的溶液和培养基

贮备缓冲溶液—将34 g磷酸二氢钾转移到一个1000mL的容量瓶内，溶解在500mL纯净水中，用氢氧化钠调整pH值为7.2±0.2，加入纯净水至刻度并混匀。分装在容器中，灭菌。在2o～8o温度下贮存。pH7.0磷酸盐冲液—制备纯净水与贮备缓冲溶液（800:1 v/v）的混合液，并灭菌。

在高压蒸汽灭菌锅内以经过验证的周期灭菌。

调整pH值，以使在灭菌后温度为25o时，pH值7.3±0.2。在高压蒸汽灭菌器内以经过验证的周期灭菌。

调整pH 值，以使在灭菌后温度为25o 时，

pH 值7.3±0.2。在高压蒸汽灭菌器内以经过验证的周期灭菌。

调整pH 值，以使在灭菌后温度为25o 时，pH 值5.6±0.2。在高压蒸汽灭菌器内以经过验证的周期灭菌。

调整pH值，以使在灭菌后温度为25o时，pH值5.6±0.2。在高压蒸汽灭菌器内以经过验证的周期灭菌。

调整pH值，以使在灭菌后温度为25o时，pH值5.6±0.2。在高压蒸汽灭菌器内以经过验证的周期灭菌。

调整pH值，以使在灭菌后温度为25o时，pH值7.2±0.2。加热