氨茶碱的血药浓度测定实验报告

氨茶碱的血药浓度测定及药动学参数计算

一、【目的】掌握血清中氨茶碱血药浓度的紫外测定法，掌握血清中茶碱提取法，验证氨茶碱的动力学模型，掌握二房室动力学模型的参数计算方法。用有机溶剂将血清中的氨茶碱提出，用紫外测定法根据标准曲线测出氨茶碱浓度，用残差法运用计算机进行数据处理、曲线描绘及参数计算，从而验证氨茶碱动力学模型，使大家对药动学研究有一初步的了解。

二、【原理】氨茶碱为临床常用平喘药，由茶碱与乙二胺缩合而成，在体液中可分离出茶碱。在酸性条件下，可用有机溶剂从血清中提出茶碱，并同时沉淀血清蛋白，再用碱液把茶碱从有机溶剂中提出（见图1）。测量λ274和λ298处的吸光度（A274为茶碱和本底，即溶剂、血清的吸光度，A298为本底的吸光度）。茶碱的吸收度为△A = A 274 A 298，使用UV1601双波长分光光度计测定（见图2）。

图1．茶碱的抽提过程

图2

氨茶碱经静脉进入血液，随血液循环进行组织分布，达到平衡后转入消除相。时量曲线呈二房室动力学模型，公式为C = Ae -α

t +Be -β

t ，曲线由分布相C a = Ae -α

t 和消除相C b =Be -β

t

两部分组成，其对数表达式分别为log C a = (-αlog e) t + log A 和log C b = (-βlog e) t + log B （见图3），在对数坐标上由于分布相较早趋近于零，故可先在时量曲线终末段直线回归法求出消除相对数表达式log C b = (-βlog e) t + log B ，然后用差数法求出C a = C - C b ，再次运用直线回归法求出分布相对数表达式log C a = (-αlog e) t + log A ，最终得到所有的参数A 、α、B 和β，从而得到时量曲线C = Ae -α

t +Be -β

t 。

取 血 试 管

酸 性 分 离 管

碱 性 分 离 管

血液 NaOH

抽提液

血清

含茶碱的上层液

图3．二房室模型的时量曲线

三、器材：玻璃试管、离心管、注射器、吸管、离心机、微量进样器、UV1601双波长分光光度计。药品与试剂：氨茶碱标准液，0.1 N HCl ，0.1 N NaOH ，异丙醇：氯仿抽提液(5：95)。动物：家兔，体重2.5～3 kg 。

四、【方法步骤】

1． 动物实验：给药、不同时段取血，测定一系列血药光密度（ΔA t ）

取健康家兔一只，用二甲苯涂擦兔耳以扩张血管，静脉注射肝素750IU/kg 抗凝，取空白血约0.5ml 。经4min 后一耳缘静脉注射氨茶碱(2分钟内注射完)，另一耳缘静脉在不同时段取血，取血时间（x ）如表2。2500转/分离心5分钟分离血清，各管均取血清0. 25 ml 于试管中，加0.1 N 盐酸溶液0.1 ml 、抽提液2.5 ml ，振摇混合，2500转/分离心10分钟，吸取氯仿液(下层)2 ml 置另一试管中，加入0.1 N NaOH 溶液2ml ，振摇混匀，2500转/分离心10分钟，吸取碱液(上层)，以空白血为参比，测定一系列ΔA t ，结果填入表2的第一和第二列。

操作流程如图4：

图4．ΔA t 操作流程

消除相log C ex = (-βlog e) t + log B

分布相log C r = (-αlog e) t + log A

2.标准管加样

取试管5支，依次加入0.1mg/ml的茶碱标准液20、40、60、80和100 μl，然后各管加入0.1 N NaOH溶液使总容积为4 ml，则浓度依次为0.5、l.0、l.5、2.0、2.5 μg/ml，测定各管△A，填入表1。

五、【数据处理】

（1）利用Excel求药物光密度（Y）与浓度（X）之间的回归关系Y = A’+ B’X

表１．标准管加样

标准管号 1 2 3 4 5

茶碱标准液(ml)0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

0.1N NaOH 溶液

3.98 3.96 3.94 3.92 3.9

（ml）

茶碱浓度X（μg/ml）0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

光密度Y （△A）0.039 0.077 0.116 0.160 0.198 回归方程Y=0.0802X-0.0023

Excel模板已经做好，仅需要在标准直线工作表中的第二列填入相应的△A值，Excel 便自动绘出茶碱光密度——浓度回归直线（见图5），并标明其表达式Y = A’ + B’X，给出相应的统计参数截距A’=-0.002、斜率B’=0.080和相关系数R’=1.000 。

图5

（2）计算不同时段血药浓度，求时量曲线C = Ae-αt +Be-βt及药动参数

不同时间点x(min)及其相应血药光密度（ΔA t）已经填入了表2的第一和第二列，在Excel模板“血药浓度计算”工作表中已预先拷入了表2，则相应血药浓度Ct (μg/ml)和血

药浓度对数值y自动在第三和第四列求出血药浓度和二房室模型的药动参数，有以下几步：

表2．不同时段血药光密度（ΔA t）记录

x (min) ΔA t C t ( g/ml) y (log C)

Ct =( ΔA t - A' ) / B'*4/0.2y = LOG10(C

)

t

13 0.109 1.443

22 0.094 24.01 1.380

40 0.078 20.02 1.302

85 0.061 15.79 1.198

244 0.050 13.04 1.115

372 0.041 10.80 1.033

1）利用回归直线表达式计算每个ΔA t相应的血药浓度，绘制药时曲线，将浓度转换为对数坐标，找出远端呈直线分布的N个点，电脑拟合给出消除相曲线Cex=Be-βt [对数表达式为log Cb = (-βlog e) t + log B]，给出相应的统计参数截距log B、斜率-βlog e和相关系数r ,给出药动参数B = 17.7594和β=0.0013。由Cex=Be-βt算出Cex 的其余各点，并以红色空心圆点标示于图中（如图6），其数值即为表3中的红色数字。

图6．

表3．不同时段血药光密度（ΔAt）并残数法二室模型数值记录x (min) C t ( g/ml) Cex (μg/ml)Cr (μg/ml)

13 27.76 17.46 10.30

22 24.01 17.25 6.76

40 20.02 16.85 3.18

85 15.79

244 13.04

372 10.80

2）求分布相曲线C r = Ae-αt[对数表达式为 log Cr = (-αlog e) t + log A]。因为，Cr =C –Cex，所以用减法算出Cr曲线的各点可得出表3中的深蓝色数值，并以深蓝色三角方块标示于图7中。电脑拟合分布相曲线公式，分别给出统计参数截距log A、斜率-αlog e和相关系数r及分布相药动参数A=17.8660和α=0.0433（图7）。

图7

3）求时量曲线C = Ae-αt +Be-βt =17.866e-0.0433t +17.7594 e-0.0013t及二房室模型药动参数。

在Excel模板中计算链接导入已算好的药动参数A、α、B和β，将他们代入公式分别算出药动参数t1/2α、t1/2β、k21、k10、k12、V1、Vd和CL， D为初始给药剂量，需手工输入。得图8如下：

药动参数公

式

结果

A 17.8660 μg/ml α0.0433 min-1

B 17.7594 μg/ml β0.0013 min-1

t1/2α=1n2/α16.0002 min-1

t1/2β=1n2/β525.812 min-1

k21

=(Aβ+B

α)/(A+B)

0.0223 min-1

k10=αβ/k210.0026 min-1

k12

=α+β

-K

10

-K

21

0.0198 min-1

D=30.00 mg/kg

V c

=D/(A+B)

0.8421 L/kg [Z=β(A/α+B/β)= 18.3031 ] Vd = D/Z 1.6391 L/kg

C l=V c×k100.0022 L/kg/min

AUC =A/α+B/β13884.47

μ

g/ml·min

4)药-时曲线下面积（梯形法）

采血时间血药浓度

i t (min) C (μg/ml)(C i+1+

C i)

(t i+1-t i) product

0 0.00 35.63 63.38 13.00 823.95

1 13.00 27.76 51.77 9.00 465.94

2 22.00 24.01 44.04 18.00 792.72

3 40.00 20.02 35.81 45.00 1611.47

4 85.00 15.79 28.83 159.00 4583.64

5 244.00 13.04 23.84 128.00 3051.57

6 372.00 10.80 10.80

AUC = 13855.8709 ( μg/ml·min)

六、【注意事项】

1. 静注氨茶碱必须快速完成；取血时防止损伤血管壁；取血困难时可抹二甲苯扩张血管；防止外来氨茶碱污染血样（对侧取样）；紫外分光光度计使用前需预热30min并激发氢灯。

2.振摇混匀药液时防止溅出并准确加样。

3.样品离心前需配平。

4.测量时若更换波长，必须重新调节0和100％。

七、【结果讨论】

房室模型是抽象的数学模型，它的划分与解剖学部位或生理学功能无关。药物转运速率相同或相近的部位可划分为同一房室。房室模型可以分为一室模型、二室模型、多室模型。大多数药物在体内的转运和分布符合二室模型。即药物静脉注射入血后，首先快速进入血流量大的组织，如心、肝、肾、肺、脑等，然后缓慢地向血流量小的组织，如脂肪组织、静止的肌肉组织等转移。本次实验得出的数值及做出的曲线图证实了氨茶碱确实为二室模型分布。但是由于取血点过少，且取血时间未严格照方案掌握好，故曲线计算并不十分精确。最佳应为取血点设10个以上，先密后疏。梯形法和参数法算出的AUC面积大致相同。