原核表达-经验教训
最近在做原核表达，包涵体。以前也做过，但经验不多。从园子里也学到不少。一点失败的教训以及纯化
过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正
1. 首先介绍一下背景。载体是novagen 公司的pET22b ，Amp 抗性。菌株是Invitrogen 的BL21 star DE 3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。
2. 第一次失败。第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。PCR ，酶切都正确。但没等测序结果出来就开始做了。失败了。曾在园子求助。后来证明是引物错误。我们实验室合成引物都要先发给purchasing office ，然后才由他们与公司交涉。这个office 的老太太把引物弄掉了一个碱基。 教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。
3. 第二次失败。后来重新构建，转化，诱导。第一次诱导时根本就没带。见附图（图片质量太差了，sorr
y ，下面几个帖会逐渐好转。我们都在失败中提高，进步，不是吗）
然后开始找闷头原因。周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18 h ！
我们都知道，带Amp 的E.coli 在含Amp 的平板上培养超过16 h 后，菌周围会长出小菌落，我们叫它卫星菌落。这是因为细菌在生长的时候，为了抵抗Amp ，会分泌B －内酰胺酶，而该酶会降解培养基中的Amp 。对Amp 产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp 就会慢慢减少。一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。当Amp 降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。所以当培养时间足够长后，培养基中的B －内酰胺酶就会积累到很高的浓度。转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp （而且我用的浓度是50 ug/ml ）。这样，就造成最后收集的菌中，大部分都是没有带质粒的菌了。
当然还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶，使得表达检测失败。
这两种推测都只是推测，但我觉得第一种情况应该引起我们的重视。在使用Amp 抗性的时候要格外注意。
amberly edited on 2007-03-12 03:45
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? 【招聘】深圳市妇幼保健院招聘公告
amberly
2007-03-06 08:18
谈，下一话题
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4. 第三次做诱导就格外小心了。首先，晚上12点我才接菌，到第二天早上就开始转接了。这次用的是100 ug/ul 的Amp 浓度。转接的时候是1:500稀释。（我不知道1:100行不行，一朝被蛇咬，十年怕井绳啊。在OD600达到0.8的时候诱导。 转接的时候做对照：IPTG 0 h ， 同时做诱导：2 h, 3 h
结果见附图。图注的大概意思： 从左到右的泳道依次是：阴性对照，诱导2 h ，诱导3 h ；由于我做的是包涵体，所以
前面点的都是沉淀，16，17点的上清。但这两个泳道太难看了。后面的胶会好一点，s
orry
主要结果有三：
A. 有表达，
B. 阴性对照也有表达，所以这个结果不是很convincing
C. 目的蛋白应该在30 kD ，但分子量显示是36 kD 左右（这个问题是个低级错误，接下来的帖子会指出）。
原因分析：
为什么阴性对照会有带？我想起表达毒性蛋白的protocol. 表达毒性蛋白的时候，由于DE3可能根本就不长，或者长得很慢，这时候我们会在培养基中加glucose 。当培养基中有其他首选碳源，如glucose 时，细菌会优先选择glucose ，而glucose 会抑制cAMP 的活性从而关闭乳糖操纵子。
为什么要加入glucose 呢？我们用的DYT 或者LB 培养基中含有丰富的tryptone 。后者可能含有微量的乳糖。所以虽然没有加IPTG ，其中的lactose 同样可能诱导蛋白的表达。这样毒性蛋白在加IPTG 前就开始表达了，杀死或者抑制了细菌的生长。
那么我的这个实验中，阴性对照出现的带是不是也是因为这个原因引起的呢？
为了验证，进一步做了实验，结果见下一贴。
amberly edited on 2007-03-06 09:45 论文版欢迎您！
? 【分享】2007主治医师考试相关专业部分试题
amberly
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2007-03-06 08:39
要验证阴性对照中的带是不是由于培养基中的微量lactose的，可以做如下实验，
A. 测培养基中乳糖含量；
B. 购买无乳糖培养基；
但是我不愿浪费时间在这上面。。。卖个关子哈
实际上，我做了如下的一组处理：
a. 阴性对照＋2％glucose
b. 阴性对照without glucose
c. 诱导2 h
d. 诱导3 h
这个处理其实存在设计上的错误。如果要得出严谨的结论，应该要加一个2％glucose的
诱导处理。这样，预期的结果就是：
a, 无目的条带，
b, 有目的条带，但不够多，
c, 有
d, 有
e, 2％glucose, 诱导，无目的条带或者仅有很浅的带。
很抱歉，e没有做。那天很久没用的两瓶glucose中的一瓶被污染了。。。
结果见附图。
图注的大概意思：
从左到右的泳道都是按a, b, c, d处理排列的。5－8以及13－16泳道是positive expre
ssion control。是pET15b携带b-galactosidase的一个构建。泳道1－8是全细胞蛋白电
泳；泳道9－12是取沉淀电泳；13－16是上清电泳。结果：
a. 有glucose的阴性对照无带（或非常浅）
b. 无glucose的阴性对照有带，但整体来说比诱导的弱
c. 诱导的有带
d. 蛋白大小还是不对（其实是对的，我冤枉它了，请看后面的帖子）。
结论：培养基中确实很可能存在lactose。而且应该是造成阴性对照有表达的原因。
（缩略图，点击图片链接看原图）
amberly edited on 2007-03-06 09:06 论文版欢迎您！
? 【专帖讨论】SFDA再次征求《药品注册管理办法（征求意见稿）》意见
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2007-03-06 08:56
现在头疼的就是分子量的问题了。
首先，切胶做MS。见附图。那三个洞洞就是偶挖滴
根据公司的报告，这个蛋白就是我们要的蛋白。
然后就开始怀疑分子量marker了。
细心的战友可能发现了，我下面这个图marker其实跟上面几个图都是一样的，但标的
不一样了。这就是我说的低级错误：
我之前的图是按Tris-HCl buffer，12％的胶标的。但我跑的Bis-Tris胶，而且是MES b
uffer。而marker在这两种buffer（胶）中所代表的分子量是不同的。有兴趣的战友可
状态:离线以查看下帖中的pdf文件。
浅谈原核表达
浅谈原核表达的技巧 摘要：原核表达是表达外源基因常用的方法，具有操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点。本文作者根据自己的实践经验，总结了原核表达的一些技巧。 关键词：原核表达表达载体限制性内切酶 将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于生长和控制；易于培养，实验耗费少；可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒。原核表达是近年来表达外源蛋白常用的方法，本文根据自己的实践经验，着重谈谈对原核表达中的技巧问题。 一、原核表达一般程序 表达前准备-获得目的基因-构建含目的片段的表达载体（测序验证）-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析。 二、原核表达中各操作步骤的关键因素及技巧 1.表达前的准备要素：原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。正所谓“磨刀不误砍柴功”，经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验，可免去许多不必要的麻烦。 （1）对表达载体的分析 载体的选择：同样的载体，同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量起高，但另外一个就是做不出来，所以表达载体的选择非常重要，没有万能的载体。选择载体通常我们关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题：是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的有无，筛选报告基因的位置等。所选载体一定要保持原来的遗传背景（有些载体经过多次交换已变异）。选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如果为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择非融合表达。融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 翻译的起始位点：要表达目的蛋白，在该基因的5’端必须有一起始位点，现在大部分的表达载体都提供起始位点，起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化，一般情况下不需要自己再加，实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子，如无，还得根据自己的实际情况加上。 在起始密码子附近的mRNA二级结构：外源基因其始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键，尤其是在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用Primer Premier软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定，影响正常的翻译。 （2）对目的片段的分析 基因（或蛋白）的大小：原核表达的成功与否与所要表达的蛋白（或基因）大小有关，一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解。在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。如果蛋白较大，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签（如6×组氨酸标签）。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时要根据目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于抗原性也可以利用软件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在线软件，不过在分析之余也要认识到这是一种资料统计的结论，
原核蛋白表达常见问题解析
原核蛋白表达常见问题解析 1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？ 在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为 包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的 培养基等方法获得更多的可溶蛋白。 2、跨膜蛋白为什么很难表达？ 跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前 众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个 原因： 跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式 的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与 信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞 一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌 这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可 能完成的任务。 另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水 性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于生物 自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。 3、如何选择蛋白表达宿主菌？
4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？ 答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切胶 回收三类。 1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化 获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白， 亲和纯化的方便快捷。 2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。 （1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去 工具酶。此方法能快速得到蛋白。 （2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。 3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方 法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏 度较高。 5、表达得到的蛋白是有活性的么？ 答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性 的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯 化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形 成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。
原核表达条件优化
原核表达条件优化 影响E.coli中蛋白表达量的因素除载体启动子结构以外，还有质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素[58]。由于Vector NTI suitor7.0软件模拟表达，可知mRNA结构和密码子的偏爱性两个影响因素不会造成表达困难，所以本实验的工作主要针对载体拷贝数、载体稳定和宿主菌的生长状态。 本实验中重组表达质粒PrP-pET-32a（+）不稳定的原因可能是PrP对E.coli BL21（DE3）具有细胞毒性。pET-32a（+）来源于pBR-322，pBR-322源于ColE1。ColE1、pBR-322 、pET-32a（+）都失去了分配功能区par。而天然质粒具有功能区par，可以保证质粒在每次细胞周期中准确的进行分离，并均等的分配到子代细胞中去。功能区par对质粒PrP-pET-32a（+）的稳定性是不可缺少的[4]。缺少功能区par的pET-32a （+）质粒在每次细胞周期中随机分配到子代细胞中去，无细胞毒性时约98% E.coli BL21（DE3）会带有质粒（见《pET System Manual》34页）。表达有细胞毒性蛋白的E.coli BL21（DE3）不具有生长优势，而且随细菌培养时间的增加β-内酰氨酶将逐渐释放到溶液中去，破坏溶液中的AMP。【β-内酰氨酶功能强大，细菌培养稀释1000倍以后还能破坏几乎所有的AMP（见《pET System Manual》33页）】。这样本不具有生长优势的表达菌又失去了选择压力，造成大部分新生细菌无质粒，表现为表达困难。本实验证实约60%以上的细菌无质粒。 鉴于以上原因，本实验将融合蛋白Trx-PrP C27-30表达分成两个阶段，前一个阶段为质粒生长阶段，主要保证质粒的稳定性和提高质粒的拷贝数；后一个阶段为融合蛋白表达阶段，待细菌生长达饱和以后，诱导融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达。 在温度、AMP浓度、培养基等诸多影响质粒PrP-pET-32a（+）稳定性的因素中，以温度影响最为明显。实验结果显示，37℃条件下约60%以上的细菌无质粒PrP-pET-32a（+），25℃条件下失去质粒PrP-pET-32a（+）的细菌在约10%以内。其他条件不变，AMP浓度在100 ug/ml以上细菌质粒PrP-pET-32a（+）基本稳定。随AMP浓度增加平板上的菌落逐渐变小，表明AMP可抑制细菌生长。不同培养基对
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将
载体与表达系统
载体与表达系统 0001--pIRES --BD Co--真核表达--yshu3507 0002--pECFP-C1--BD Co--真核表达--yshu3507 0003--pShuttle--/--/--victoh 0004--pSBR322--/--/--chujun_hust 0005--pcDNA3.1(+)/CAT--invitrogen--真核表达--wangjun2002274 0006--pQEx--Qiagen--原核表达--wangjun2002274 0007--pIVEX2.3--Roche--体外转录翻译--wangjun2002274 0008--pIRES-EGFP--/--/--luoqingli2003 0009--pET-28a（+）--Novagen--原核表达--wangjun2002274 0010--pSUPER Vector--oligoengine--siRNA--zyh961171 0011--pET-32a(+)--novagen--原核表达--Crazyvirus 0012--pBK-CMV--/--原核表达、真核表达--zrzhong6519 0013--pcDNA3.1/Zeo (+)--invitrogen--原核表达--Crazyvirus 0014--pcDNA3--invitrogen--真核表达--kras 0015--pfastbac1--invitrogene--昆虫表达--cox2wj 0016--pEGFP-C3--clontech--真核表达--smilely 0017--pSecTag2--invitrogen--真核表达--kenmed 0018--PYX212--/--真核表达--Gmail 0019--pET20b--Novagen--原核表达--Gmail 0020--pEGFP-1--BD BIO--转录调控--wyh 0021--pEGFP/U6 --/--siRNA--songbinn
原核表达条件优化
【专题讨论】原核表达条件优化！ 之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载 体，感觉很好用。Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年的历史。已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。 Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。 T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA 聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。 T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、 HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。 从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：pET-21(+)，pET-24(+)和 pET-23(+)。如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。 根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略： 1. 与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶 （glutathione S transferase, GST）、硫氧还蛋白 （thioredoxin, Trx）和N利用质A（N utilization substance
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体 标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。
原核表达
原核表达 一、原理 1、E . coli 表达系统 E . coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。 2、外源基因的诱导表达 提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。 不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。 二、材料 1、诱导表达材料 ( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基 酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2% 蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌 ( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。 ( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级） 0.1 ％溴酚蓝 10 ％甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料 1 ）酶溶法 （1）裂解缓冲液： 50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 ) 1 mmol / L EDTA 100 mmol / LNaCI （2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。 （3）10 mg / mL 溶菌酶。 （4）脱氧胆酸。 （5）1 mg / mL DNase I。 2 ）超声破碎法 ( 1 ) TE 缓冲液。 ( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液： 100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 ) 100 mmol / L DTT 4 %SDS 0.2 ％溴酚蓝 20 ％甘油
原核&真核表达载体构建
原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达； 带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子 在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起
原核表达步骤
1.将已经成功转有重组表达载体pET-28a-CYP83A1的表达菌 E. coli.BL21(DE3)在LB固体培养基（50μg/mL Kan）上划线接种培 2.挑取单菌落，接种于5mL的LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃，180r/min振荡培养过夜。 3.取500μL过夜培养的菌液转接入100mL新的LB液体培养基(50μg/mL Kan)中，37℃，190r/min振荡培养到菌液OD600 =0.6~0.8。 4.分组培养：实验组加入终浓度为1mmol/L的IPTG，对照组不加IPTG，37℃，190r/min诱导培养6h。 5.8000r/min离心2min，收集细菌，用1×PBS(0.01mol/L)缓冲液悬浮。 6.冰上超声波破碎，功率30w，工作5s，间歇5s，总时间2min。 7.4℃、12000r/min离心10min，分离上清与沉淀，取100μL上清与等体积的2×上样缓冲液混合；用200μL1×上样缓冲液悬浮沉淀，沸水浴5min后，对上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。
重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及SDS-PAGE分析 挑测序正确的单克隆接种到3mLLB（50μg·mL-1Kan）培养基中，振荡培养12h后，将菌液按1﹕100的比例加入到300mL LB（50μg·mL-1Kan）培养基中200r/min37℃振荡培养至OD600为0.5—0.6时，加入IPTG（使终浓度为1mmol·L-1）进行诱导表达，分别在37℃诱导4h，4℃保存备用。未加IPTG诱导的pET-28a-CsFOMT收集作为阴性对照。诱导全部完成后，各取50mL 菌液离心收集细菌，加入SDS上样缓冲液，悬浮混匀，100℃3min，12000r/min离心1min，取上清4℃保存备用。另取50mL菌液离心收集菌体后用1×PBS（PH7.4）将沉菌悬起，经过超声波细胞破碎（20mm的变幅杆，400W，超声2s，间隔5s，重复60次），10000r/min离心10min分离上清和沉淀，上清和沉淀样品中分别加入SDS上样缓冲液，混匀，沸水浴，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE（5%浓缩胶，12%分离胶），然后分析蛋白表达结果
基因工程知识点总结归纳(更新版)
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
如何做原核表达
如何做原核表达 人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质——胰岛素。随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等优点。虽然也有缺少糖基化和表达后加工等问题，当有了其它多种表达系统后，原核系统仍是我们合成外源蛋白的首选。 在网上看到有人把原核表达技术分成四个等级：初次尝试扫盲、乱棍打枣入门、系统优化中级和自成一体高手，觉得十分有意思。但是根据笔者自己的经验以及耳闻目睹的一些经历告诉我：做表达？那是谋事在人，成事在天。有时候你把克隆做出来了，双酶切鉴定没问题，测序没问题，可是就是看不到表达带。原因当然可以分析，实验也是可以改进，但是窜改一下戈尔泰的话：“成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。”在实验遇到瓶颈的时候要如何进行分析，找到问题的症结是我们的实验关键所在。在准备进行原核表达的时候需要考虑的因素很多，市面上可供选择的载体、菌株也很多，要如何进行正确的选择，找到适合自己的载体是十分重要的。所以，现在要对目前常用的一些载体进行介绍，让我们对其相关产品及其表达原理进行了解，以方便实验设计。 首先来一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的
分子生物学总结
SectionA 1 三个域：真细菌，古细菌，真核生物 2 组装中的主要作用力：非共价健作用力 SectionB 1 蛋白质纯化的分析方法 2
正电荷：天冬氨酸谷氨酸 负电荷：赖氨酸精氨酸组氨酸 极性：天冬酰胺谷氨酰胺苏氨酸丝氨酸半胱氨酸 非极性：脂肪族甘氨酸丙氨酸缬氨酸亮氨酸异亮氨酸甲硫氨酸脯氨酸芳香族苯丙氨酸酪氨酸色氨酸 Cys 二硫键 Gly 无手性 Pro 亚氨基酸 芳香族氨基酸最大吸收峰280mm 3 蛋白质的一级(决定蛋白折叠及其最后的形状的最重要的因素)：氨基酸脱水缩合形成肽链N端到C端共价键 二级：多肽链中空间结构邻近的肽链骨架通过氢键形成的特殊结构。 α转角 β螺旋氢键为主要作用力 三级：多肽链中的所有二级结构和其他松散肽链区域（散环结构）通过各种分子间作用力（非共价键为主），弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象。 非共价键 四级：许多蛋白分子由多条多肽链（亚基，subunits ）构成。组成蛋白的各亚基以各种非共价键作用力为主，结合形成的立体空间结构即为四级结构。非共价键 4 偶极：电子云在极性共价键的两原子间不均匀分布，使共价键两端的原子分别呈现不同的电性 兼性离子：具有正电荷（碱性），又具有负电荷（酸性）的分子 双极性分子：
Section C 1核酸的光学特性： 增色性：一种化合物随着结构的改变对光的吸收能力增加的现象 减色性：一种化合物随着结构的改变对光的吸收能力减少的现象 Reason: 碱基环暴露在环境中的越多，对紫外的吸收力越强 Absorbance（吸收值）：Nucleotide > ssDNA/RNA > dsDNA 核酸的最大吸收峰260mm(碱基有芳香环) 芳香族氨基酸最大吸收峰280mm A260/A280: 纯的dsDNA：1.8 纯的RNA：2.0 纯的Protein：0.5 2 Tm 值（熔解温度）：热变性时，使得DNA双链解开一半所需要的温度。 Tm=2x(A+T) + 4x(G+C) Tm值与DNA分子的长度，及GC的含量成正比 Annealing（退火）:热变性的DNA经过缓慢冷却后复性 快速冷却：Stay as ssDNA 缓慢冷却: 复性成dsDNA 3 脱氧核糖核酸与核糖核苷酸得到画法 4 支持双螺旋结构的两个实验：查戈夫规则X射线晶体衍射 5 双螺旋的内容： 双链之间的关系：DNA分子由两条链组成 双链反向平行(5’3’方向) 两链的碱基通过氢键互补配对，A:T; G:C。 双链序列反向互补 各基团排列方式：糖-磷酸骨架DNA分子排列在外; 碱基对平面相互平行，排列在DNA分子的内部。 空间结构为：右手双螺旋结构 每转一圈~10个碱基对，每一圈长度33.2A 双链螺旋中形成大沟，小沟。 6 碱对DNA的影响：高pH值对DNA的影响比低pH值的要小。 高pH 值(pH>11)会改变碱基构象，使DNA变性（双链解旋，成单链）RNA的影响：高pH值，2’羟基会攻击磷酸二酯键，使其断裂，形成2’，3’-环式磷酸二酯键，从而使RNA分子断裂 7 共价闭合环状DNA (convalently closed circular DNA, cccDNA）。即通过共价键结合形成的封闭环状DNA分子。 8 超螺旋DNA（Supercoil DNA）:松弛型双链DNA进一步旋转后，再形成闭环结构时，就会形成DNA超螺旋结构 L=T+W 判断是否为超螺旋正负超螺旋 9 拓扑异构酶：暂时断裂DNA分子中一条或两条单链上的磷酸二酯键，改变DNA分子的连接数及拓扑状态。 功能：消除DNA复制和转录等过程产生的超螺旋。 细胞中，Ⅰ型酶与Ⅱ型酶的活性保持一种平衡状态。Ⅱ型酶的“使DNA超螺旋化”与
原核表达系统三大要素的选择及优化
原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。 在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。 1. 表达菌株 菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。 图1 大肠杆菌 原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。
2. 质粒载体 质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。
图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱 启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。 终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。 复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。表达载体通常会选用高拷贝的复制子，但过高的拷贝数会影响质粒稳定性和宿主生长。常用的高拷贝复制子包括pCoE1，pMBI(pUC)等。 融合标签：融合标签是与目的蛋白共同表达的一段多肽。较小的融合标签（如His-tag）一般不影响重组蛋白的结构和功能；较大的融合标签（如GST）可以帮助蛋白表达和折叠，提高蛋白溶解度。N端标签自身带有启动子和宿主偏好密码子，可以提高蛋白表达量，但提前中止的蛋白片段也会一并被纯化；C端标签则可保证只有完整的蛋白得到纯化。标签位置
真核表达载体
真核细胞常见表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug
真核生物与原核生物基因表达调控的区别
原核生物和真核生物基因表达调控特点的比较1.相同点:转录起始是基因表达调控的关键环节2.不同点:A.原核基因的表达调控主要包括转录和翻译水平 真核基因的表达调 控主要包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次B.原核基因表达调控主要为负调控,真核主要为正调控C.原核转录不需要转录因子,RNA聚合酶直接结合启 动子,由sita因子决定基因表的的特异性 真核基因转录起始需要基础特异两类转录因子 依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用 调控转录激活D.原核基因表达调控主要采用操纵子模型 转录出多顺反子RNA 实现协调调节 真核基因转录产物为单顺反子RNA 功能相关蛋白的协调表达机制更为复杂。真核生物基因表达调控的环节主要在转录水平 其次是翻译水平。原核生物基因以操纵子的形式存在。转录水平调控涉及到启动子、sita因子 与RNA聚合酶结合 、阻遏蛋白 负调控 、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰减子等。翻译水平的调控涉及SD序列、mRNA的稳定性 不稳定(5’端和3’端的发夹结构可保护不被酶水解mRNA的5’端与核糖体结合 可明显提高稳定性)、翻译产物及小分子RNA的调控作用。真核生物基因表达的调控环节较多 在DNA水平上可以通过染色体 丢失、基因扩增、基因重排、DNA甲基化、染色体结构改变影响基因表达。在转录水平主要通过反式作用因子调控转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与转录因子-DNA复合物的结合及转录起始复合物的形成。在转录后水平主要通过RNA修饰、剪接及mRNA运输的控制来影响基因表达。在翻译水平有影响起始翻译的阻遏蛋白、5’AUG、5’端非编码区长度、mRNA 的稳定性调节及小分子RNA。真核基因调控中最重要的环节是基因转录 真核生物基因表达需要转录因子、启动子、沉默子和增强子。葡萄糖存在 乳糖不存在 此时无诱导剂
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： （1）选择标志的编码序列； （2）可控转录的启动子； （3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)； （4）一个多限制酶切位点接头； （5）宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括： 一、试剂准备 （1）LB培养基。 （2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。 二、操作步骤 （一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 （二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。 （三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。