高效液相色谱检测技术及其研究现状

吉林农业大学

植物化学技术进展

课程论文

题目名称: 高效液相色谱检测技术及其研究现状学生姓名：黄磊

院系：食品科学与工程学院

专业年级： 2016级农产品加工及贮藏工程

指导教师：张晶职称：教授

2016年 12 月 18 日

高效液相色谱检测技术及其研究现状

黄磊

(吉林农业大学，吉林省，长春市，邮编2888号)

摘要：高效液相色谱具有高选择性、准确的特点，使用起来简洁方便。本文主要介绍了高效液相色谱的使用原理，使用方法，应用范围以及研究进展。

关键词：高效液相色谱；应用范围；研究进展

High performance liquid chromatography and its research status

Huang Lei

(Jilin Agricultural University, Jilin Province, Changchun City, zip code No. 2888)

Abstract:high performance liquid chromatography (HPLC) has high selectivity and accuracy. This paper mainly introduces the principle, usage, application scope and research progress of HPLC.

Key words: high performance liquid chromatography; application scope; research progress

高效液相色谱(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)也叫高压液相色,是在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的新型分离分析技术。鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点,至今,已在生物工程、制药工业、食品工业、环境监测、石油化工等领域获得广泛的应用。

1.基本理论

人们对色谱基础理论进行不懈的研究,提出了众多的理论。其中比较著名的有: 1.塔板理论。在1941年由Martin和Synge[1]提出,该理论将色谱过程比拟为蒸馏过程,把色谱柱看成是由一系列平衡单元—理论塔板所组成。在每一个塔板高度内,组分在流动相和固定相之间的分配平衡能瞬间达成;2平衡色谱理论。在1940年由Wilson[2]提出,该理论认为在整个色谱过程中,组分在流动相和固定相之间的分配平衡能瞬间达成; 3.双膜理论。Funk[3]等人把流动相和固定相看成是两块相互紧密接触的平面薄膜,整个传质阻力为流动相膜的传质阻力和固定相膜的传质阻力所构成,组分在界面接触处达到

分配平衡。4.速率理论。该理论认为组分在流动相和固定相之间有限的传质速率是影响色谱区域谱带扩张的主要因素,而轴向扩散的影响可以忽略;5.纵向扩散理论。由Amundson[4]等人通过大量实验提出,该理论认为在色谱过程中,组分在流动相的轴向扩散是影响色谱区域谱带扩张的主要因素,而有限的

传质速率对区域谱带扩张没有影响;制备分离的色谱模型和分析分离的模型相似,但在具体操作中两

者的指导思想却有着本质的不同。在制备分离中,人们总是希望在尽可能短的时间里得到尽可能多的纯组分。欲得到负载必须以分离效果为代价,即在保持最低分辨率的前提下,使柱子超载以得到最大的物料通过量。而分析分离中在最短时间里得到最大的分离效率则是人们希望得到的[5]。制备分离选择的是高柱效、高柱容量的色谱柱,而且使色谱柱在超载状态下工作。所谓超载,通常将理论塔板数下降10%时柱容量[6]。较为理想的制备条件的选择包括上柱量,容量因子,选择性以及柱效[7]。

2. HPLC影响因素的选择

2.1 固定相的选择

液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合固定相(或在惰性载体表面涂上一层液膜)、离子交换树脂或多孔性凝胶。固定相的选择应符合:颗粒细且均匀;传质快;机械强度高,能耐高压;化学稳定性好,不与流动相发生化学反应。固定相以承受高压能力来分类,可分为刚性固体和硬胶两类[8]。刚性固体以二氧化硅为基质,可承受7.0× 108 Pa～ 1.0× 109 Pa的高压,可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团,可扩大应用范围,它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中,它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108 Pa。固定相按孔隙深度分类,可分为表面多孔型和全多孔型固定相。表面多孔型固定相的多孔层厚度小、孔浅,相对死体积小,出峰迅速、柱效亦高;颗粒较大,渗透性好,装柱容易,梯度淋洗时能迅速达到平衡,适合进行常规分析,但由于多孔层厚度薄,最大允许量受到限制。全多孔型固定相由直径为10 nm的硅胶微粒凝聚而成。由于颗粒很细(5～ 10μm),孔仍然较浅,传质速率快,易实现高效、高速。适合复杂混合物分离及痕量分析。

2.2 流动相

在液相色谱中,当固定相选定时,流动相的种类、配比能显著地影响分离效果[9],因此流动相的选择非常重要。

2.2.1 流动相的性质要求

第一、在选择流动相时,一般采用色谱纯试剂,必要时需进一步纯化,以除去有干扰的杂质。因为在色谱柱整个试用期间,流过色谱柱的溶剂是大量的,如溶剂不纯,则长期积累杂质而导致检测器噪声增加[10]。

第二、流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩,从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统[11]。

第三、流动相必须与检测器匹配。使用UV检测器时,所用流动相在检测波长下应没有吸收,或吸收很小。当使用示差折光检测器时,应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相,以提高灵敏度。

第四、流动相粘度要低(应< 2 cp)。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质,降低柱效,还会使柱压降增加,使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相[12-15]。

第五、流动相对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳,样品会在柱头沉淀,不但影响了纯化分离,且会使柱子恶化。

2.2.2 流动相的pH

采用反相色谱法分离弱酸(3≤ pKa≤ 7)或弱碱(7≤ pKa≤ 8)样品时,通过调节流动相的pH,来抑制样品组分的解离,增加组分在固定相上的保留,并改善峰形。分析弱酸样品时,通常在流动相中加入少

量弱酸,常用50mmol L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时,通常在流动相中加入少量弱碱,常用50mmol L磷酸盐缓冲液和30 mmol L三乙胺溶液。流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残

余硅醇基的强相互作用,减轻或消除峰拖尾现象。

2.2.3 流动相的选择

正相色谱的流动相通常采用低极性溶剂如正己烷、苯、氯仿等加适量极性调整剂,如醚、酯、酮、醇和酸等。反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂,再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂,如甲醇、乙腈、二氧六环、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下,甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求,且流动相粘度小、价格低,是反相色谱最常用的流动相。但与甲醇相比,乙腈的溶剂强度较高且粘度较小,并可满足在紫外185～ 205 nm处

检测的要求,因此,乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。

2.3 柱温的选择

柱温是最重要的色谱操作条件,它直接影响色谱柱的选择性、色谱峰区域展宽和分析速度。柱温

不能高于固定相的最高使用温度,否则会造成固定相的大量挥发流失;柱温也不能低于固定相的熔点,

以免影响其分配作用提高柱温,柱温的选择,要依据具体情况而定:若分离是关键,则应采用较低的柱温;若主要研究的是分析速度,则应采用较高的柱温;若既要获得较高的分离度,又要缩短分析时间,一

般采用较低的柱温与较低的固定液配比相配合的方法。液相色谱中,一般在室温条件下进行分离分析,适当提高柱温有利于改善传质和提高分析速度。

2.4 监测器的选择

检测器是液相色谱仪的关键部件之一。一个理想的检测器应具有灵敏度高、重复性好、响应块、线性范围宽、适用范围广、对流动相温度和流量的变化不敏感、死体积小等特点。在液相色谱中,有

两种类型的监测器,一类是溶质性监测器,如紫外、荧光、电化学检测器等,它仅对被分离组分的物理

或物理化学特性有响应。紫外检测器具有很高的灵敏度,即使是那些对紫外光吸收较弱的物质也可用

来检测。此外紫外检测器对温度和流速不敏感,可用于梯度洗提,但不适用于对紫外光完全不吸收的试样。荧光检测器比紫外光检测器的灵敏度要高2个数量级,许多物质,特别是具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后,能辐射出比紫外光波长较长的荧光,例如多环芳烃、维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物等,许多生化物质包括某些代谢产物、药物、氨基酸、胺类、甾族化合物都可用荧光检

测器检测[16]。另一类是总体监测器,如示差折光检测器,它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。几乎每种物质都有各自不同的折射率,因此都可用差示折光检测器来检测,它是一种通用型的浓度检

测器,但是对温度变化很敏感,不能用于梯度洗脱。

3.HPLC的研究现状

3.1HPLC在食品农药、兽药残留的检测

李海飞等运用HPLC柱后衍生荧光检测法,测定苹果、梨、桃、葡萄、香蕉和芒果等水果样品中涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、克百威和甲萘威7种氨基甲酸酯类农药的残留量,结果7种农药3种不同浓度平均添加回收率在72.5%～ 116.2%,最低检出限为0.003 7～0.007 4mg/kg[17]。陈辉华等建立了同时检测水产品中四环素类和氟喹诺酮类兽药多残留的HPLC法。样品经

固相萃取小柱净化,以甲醇-丙二酸+氯化镁水溶液梯度洗脱,紫外检测器检测。对样品前处理和色谱分

析条件进行了优化,8种抗生素(土霉素、四环素、金霉素、沙拉沙星、恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、单诺沙星)在0.1～ 10.0mg/L范围内与峰面积线性关系良好,最低检出限(S/N= 3)为0.011～

0.051mg/kg,定量下限(S/N= 10)为0.035～ 0.170mg/kg,平均加标回收率为81.0%～ 96.0%[18]。

此外,西维因、多菌灵和狄氏剂等150多种农药都可以用HPLC法进行分离或分析,在啤酒中时有发现的致癌性很强的亚硝胺类化合物,利用Warters公司开发的SppakSilica小柱净化、浓缩样品、反相色谱法也能快速、准确地检测[19]。

3.2HPLC在环境监测中的应用

张梅凤[20]应用高效液相色谱技术对生物样品农药残留进行了分析研究。色谱条件:色谱

柱:416x25mmC18柱,柱温:30,C,流动相:乙腊:水(35:65),流速Zloml/min,检测器:紫外检测器,灵敏

度0101AUFS,根据各组分设定合适的波长时间程序.称取5109试样于soml离心管中,加入苯loml,无水硫酸钠6g,匀浆3min。将离心管放入离心机中以25。。转/min离心smin。用吸管将上清液转入20ml 离心管中。残渣再用ZXsml苯提取两次,合并提取液并于50℃水浴上用氮气吹干。离心管冷却至室温,用sml乙酸乙醋将残渣洗入层析柱中,以Zml/min的流速使溶液流出并弃去。用15ml洗脱液洗脱组分。洗脱液于50℃水浴上真空蒸干,用110ml流动相溶解残渣,取上清液进样。

崔莹[21]应用高效液相色谱技术对环境中的磷脂进行了分析研究.用ishca硅胶柱为固定相,也有

用CN氰基柱、NH:氨基柱和DIOL二醉柱的报。流动相有氯仿一甲醇一氨水、正己烷一异丙醉一水以及乙睛一甲醇一水,在流动相中加入离子抑制剂如85肠磷酸、乙酸馁、30写氨水、乙酸,可以有效改善峰形,抑制色谱峰拖尾磷脂在正相色谱中的分离是由于各组分分子极性大小不同,流出顺序不同,各组分得到分离。如硅胶住上.正己烷一异丙醉一水为流动相时,PE极性最小,PC极性最大,IP位于中间,故一般的流出顺序为:PE、Pl、PC,当甲醇一乙腑一磷酸为流动相洗脱时略有差别,流出顺序为PI、PE、PC。

3.3脂肪酸的分析

脂肪酸和丙三醇结合成脂肪，通过测定食品中脂肪酸的含量，可为食品加工、贮存及合理配比等提供必要的数据。张萍等[22]以磷酸盐甲醇溶液为流动相，pH 2.8 的条件下，采用线性反相梯度洗脱，同时分离测定出甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、丙酸、丁酸、戊酸等[23]种短链脂肪酸。测定结果的相对标准差为 1.8 % ，平均回收率为 92 % ，重复性变异系数小于 4 %。张海满7采用 Shim- pack ODS 分析柱，柱温 40 ℃，色谱纯甲醇为流动相，流速 1.2 m L/ min，测定脂肪酸中α- 亚麻酸的含量，测定结果的相对标准差小于 0.35 % ，重复性好。

4. 结束语

高效液相色谱技术作为一种十分有效的分析分离手段，已广泛地用于食品以及药品分析等领域，提供了可靠、精确分析结果，简化了试验步骤，节省了样品准备时间和分析时间，随着技术的不断改进与发展，相信不久的将来，HPLC 必将在分析领域发挥越来越重要的作用。

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