琼脂糖凝胶电泳常见问题分析

DNA 凝胶电泳简介

一、实验原理

DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：

1 、聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb 以下的片段，最高分辨率可达1bp ，也用于分

离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。

2 、琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为

0.5 ～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般 1 小时

即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。

二、琼脂糖凝胶

琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3 连接的吡喃型b-D- 半乳糖和1，4 连接的3，6 脱水吡喃型阿a-L- 半乳糖组成，形成相对分子量为104～105 的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表 1 给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。

表 1 不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围

由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4 能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。

随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）

低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb 的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分

离。（5）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。

三、DNA电泳影响因素

DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极

泳动。而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。电泳中影响DNA分子泳动的因素很多，主要分两方面：DNA分

子特性和电泳条件。

1 、DNA分子大小：DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁

移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。

2 、DNA分子构型：对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也

会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。常规电泳中质粒DNA分子的3

种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。

3 、不同的胶浓度：对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。不同胶浓度对于DNA片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DNA 片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分

离（有时甚至用2％的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。

4、电场强度：电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为5V/cm，这样的场

强下虽能得到结果，但分辨率不高。在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1V/cm。电

场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。实验中要根据需要选择合适电压，如对于DNA大片段的分离可适当选

择较低电压进行（在Southern 杂交中的DNA电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子DNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电泳以缩短电泳时间。

5 、溴化乙锭：简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基

对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当DNA分子中嵌入

的EB 分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB 分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离EB 质量浓度为0.1g/ml~0.5g/ml ，

即电泳时所加的浓度。因此一般电泳可以忽略此因素，而对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。

6 、电泳缓冲液：目前有 3 种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE 和TPE，其组成及特点见表2。一般常用的DNA电泳选用TAE较多，其电泳时间较快，而且成本比较低，但是其缓冲容量较低，需经常更换电泳液。

表 2 常用DNA电泳缓冲液

四、DNA上样缓冲液

电泳中DNA点样前必须加入一定量的上样缓冲液，主要作用如下：

1、螯合Mg2+，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/L 的EDTA。

2、增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。而在大片段电泳中采用Ficoll （聚蔗糖），可减少DNA 条带的弯曲和托尾现象。

3 、指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp 的线状双链DNA相同。

目前厂商提供的限制性内切酶中都有赠送的上样缓冲液，一般为10×上样缓

冲液，DNA样品中仅需加入1/10 的量即可，加入过多的上样缓冲液会造成电泳轻微的托尾现象。

五、DNA上样量的控制

在分析性电泳中，一般样品投入量达50～100ng/ 带即可观察到清晰结果，而对于珍贵

DNA样品则上样量达电泳的最低分辨率5～10ng/带也可。而对于一定量的DNA，当电泳时采

用较薄的梳子制胶，则电泳时DNA条带相对较窄，观察较清晰；而随着电泳时间的延长，

由于DNA分子本身有一定的扩散，电泳条带也会变浅。

对于染色体DNA的酶切片段包含各种大小的条带，上样量即使超过10mg 条带也不会托尾，

而单一条带（>10 kb）当上样量超过200ng 就有可能产生托尾现象。

(免费共享)SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题及分析

常见问题及分析 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1) 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2) 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3) 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED 与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

DNA合成常见问题解答

DNA合成常见问题解答 1.DNA合成粗产物中含有什么杂质 DNA合成仪合成的粗产物经过浓氨水氨解以后，其中除了含有所需的目的DNA片段(n)以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段(n-1,n-2,…)以及脱保护基团产生的铵盐。需要通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。 2.如何进行合成产物的纯化目前公认和大多采用的DNA粗产物后处理方式有4种： A) C18柱脱盐，这是一种活性炭柱子，有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5' 端一个或两个或多个碱基的产物，却一般不会对普通PCR反应产生影响。但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别，以免后患无穷。 B) OPC柱纯化，OPC柱中装有对Dmt具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5' 端最后一个碱基上的Dmt，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有Dmt 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有Dmt的片段吸附能力弱，被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去Dmt基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA这种方法的优点是快速，简易。但是其专一性吸附Dmt能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。特别是对长于25 碱基以上的片段纯化效果不好。 C) HPLC纯化，这是国外厂家常常使用的办法。它是依据不同大小的片段带有的净电荷多少来分离产物的。合成粗产物中不同长度的DNA片段决定了它带有不同的净电荷，较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢。先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。它的优点是自动化程度高、省人

琼脂糖凝胶电泳标准操作流程

琼脂糖凝胶电泳操作标准流程一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功后，代表具备操作琼脂糖电泳的能力。二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA构想； 4、所用的电压； 5、琼脂糖种类； 6、电泳缓冲液核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重；360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合

对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA 损伤不是很大，所以也比较适用。三、材料、试剂及器具 1、材料不同大小的基因组片段； 2、试剂 Hind III digest DNA Marker（分子量标准）(TaKaRa)；D2000(TianGen)；BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）；加样缓冲液（6x）：溴酚黄；电泳缓冲液（1×TAE）；溴化乙锭（EB）； 3、仪器及器具（1）移液器、吸头、锥形瓶（2）电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。（3）紫外透射仪、微波炉、电子天平四、操作步骤 1.器具清洗：首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净，包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘（EB污染，需独立清洗）。清洗流程为：先用自来水冲洗三次，然后用纯水冲洗三次，最后用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进行胶回收，则还需用75%酒精对器具进行消毒。 2.配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶洗干净并加入少量纯水煮沸，然后量取一定量的电泳缓冲液（1×TAE）至锥形瓶中，再称取相应量的BIOWESTAGAROSE（西班牙琼脂糖）倒入锥形瓶中，摇匀并

琼脂糖凝胶电泳目的及后续工作

琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 1.分离纯化大片段DNA 琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。分离后如需回收：将需要的DNA胶部分切下，尽量不要切到多余的胶。切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚或氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。 2.提取大分子DNA构建大片段基因组文库的关键就是获得高分子量的基因组DNA。而利用成熟的商品化试剂盒提取基因组DNA只能得到大小约在20kb左右的DNA;酶抽提法需经过多次抽提法才能得到较纯的DNA，但极易造成基因组断裂，也难以得到大于300kb的基因组DNA。两种方法均不能达到目的，但经过研究人员不懈的研究，利用琼脂糖凝胶制备成凝胶块提取基因组DNA能够获得足够大的DNA片段，可以完全符合构建粘粒基因组文库的要求。在此过程中研究人员在用低熔点琼脂糖还是普通熔点琼脂糖制备凝胶块的问题中选择了后者，因为低熔点琼脂糖价格昂贵且胶块在制备纯化的过程中容易断裂，而普通熔点琼脂糖与低熔点琼脂糖在基因组DNA制备方面没有区别。 3.PCR产物检测在基因组DNA的提取中，DNA经孵育及抽提、沉淀后以70%乙醇洗涤2次，再适量的双蒸水溶解DNA。然后在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，以1kb DNA ladder 为参照，估计DNA溶液浓度。具体检验方法是:2.0%琼脂糖制成凝胶，取6 微升AFLP-PCR产物与1微升上样缓冲液混匀后上样，用1×TBE电泳缓冲液，120V电泳50min，使用EB溶液染色后在凝胶成像系统(ChampGel-3200)上观察拍照。 4.免疫扩散法中的应用免疫扩散法是指抗原与抗体在同一凝胶中扩散的方法，是观察可溶性抗原与相应抗体反应和抗原抗体鉴定的最基本方法之一。利用琼脂糖凝胶作为扩

DNA电泳常见问题分析

DNA电泳常见问题凝胶电泳操作注意事项 1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 2、凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。 3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。 4、样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA 中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 6、 DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。 7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。 8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。 9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。 10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。 11.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。 12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量 DNA电泳常见问题分析之一 1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。一个让PAGE胶很快聚合的方法：不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。 2 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？ 1、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm

PCR常见问题分析报告及对策

PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低

6.循环次数过多对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物

的交*污染对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非

琼脂糖凝胶电泳常见问题分析

DNA凝胶电泳简介一、实验原理 DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。 2、琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。二、琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。表1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分离。（5）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。

引物的应用常识

引物的应用常识引物的原理引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA取代。在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。 1. 不同实验要求的引物选择在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等） 2.引物设计的重要因素有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus， ?引物长度和专一性常见的引物长度为18-30个碱基。短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。 ?平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 ?3’-序列 3’端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。同时它将提高PCR效率，因为引物-模板符合物的开放将达到最小。但是，超过3个G/C碱基将会具有负面效果，因为会降低反应的专一性。 ?避免互补的引物序列

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理)

打印琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。琼脂糖凝胶孔径较大适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广。琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA (5-500bp) 效果较好，其分辩力极高，甚至相差1bp的DNA段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快，可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前，一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D-半乳糖和3,6脱水L-半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1%-3%,加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA,电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖在62 C时熔化，因此其中的样品(如DNA)，可以在加热到熔点的水浴中放置一段时间，重新溶解到溶液中而回收。由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下:

PCR常见问题分析及对策

. PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因: 1.模板:含有抑制物，含量低 2.Buffer对样品不合适 3.引物设计不当或者发生降解 4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策: 1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 2.更换Buffer或调整浓度 3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因： 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.退火温度偏低

. 6.循环次数过多对策： 1.重新设计引物或者使用巢式PCR 2.适当降低模板或引物浓度 3.适当减少酶量 4.降低镁离子浓度 5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法 6.减少循环次数

问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg 2+浓度偏高 6.循环次数过多对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策： 1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

(完整word版)DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤

一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA 核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。影响核酸分子泳动率的因素主要是： 1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。 DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA ＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。 2、支持物介质核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵

电泳常见问题

Marker 参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的? 参考见解：DNA带模糊??： 1、DNA降解??避免核酸酶污染。 2、DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。 3、所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 4、DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 5、有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。 6、DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。好象没跑出来，是怎么回事？参考见解： 1、根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5％左右，也不一定。 2、紫外灯下没见带，不一定没有出孔，而是量少看不到，可以测一下浓度看一下，或直接试跑一下PCR。

3、最好加一个marker孔，尤其你第一次跑胶时。 4、电泳时间可能过长，一般75v×30min左右，但是具体看溴酚蓝的离孔距离和目的条带离孔距离。怎样根据目测条带亮度来判断DNA浓度？参考见解： 1、跑胶时候marker 可以加成定量marker，如1kb、100bp等marker，按说明书的量上样电泳，如加500ng量的DNA marker，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和MARKER 条带的亮度做个大致的比较，找出两者最接近亮度的条带。因为marker的各条带都已知所含的DNA浓度（说明书中详细注明），因此根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。 2、在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，比如从0。5、2、4、6，因为，如果质粒的量很浓的话，通过简单的对一条条带的目测产生的结果误差是很大的或者利用marker(推荐DL 2000),再用软件做半定量分析。 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？参考见解： 1、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm即可。 2、电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。 3、上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。跑出的DNA带模糊？参考见解： 1、DNA降解：避免核酸酶污染。 2、电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。 3、所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 4、DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。 5、DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 6、有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。 7、DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。有不规则DNA带迁移? 参考见解： 1、对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。 2、电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液。 3、DNA变性：以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。跑出的DNA条带带弱或无DNA带？参考见解： 1、DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。 2、DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。

引物设计常见问题

引物设计常见问题与解答(二) 17. 长链引物为什么出错的几率非常高答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。 18. 如果测序发现突变，该如何处理答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。 19. 如果测序发现引物突变，是否有补偿答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%.您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。 20. 引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。 21. 为什么OPC或PAGE纯化的引物，再用HPLC鉴定纯度不高

实验6、琼脂糖凝胶电泳

实验六、琼脂糖凝胶电泳【实验目的】熟练掌握琼脂糖凝胶的配置和DNA凝胶电泳的方法。【实验原理】琼脂糖是从海澡中提取的长链状多聚物，琼脂糖凝胶点为 40~45℃。当加热至90℃左右时，即可成清亮、透明的液体，浇在模具上冷却后固化形成凝胶，琼脂糖凝胶可区分相差100bp 的 DNA片段。为了满足特殊的要求，可选择低溶点琼脂糖(<70℃,低于双链DNA的变性温度)。带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。各种生物大分子在一定的pH值条件下，可解离成带电荷的离子，在电场中向相反的电极移动。分子生物学领域中，琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电泳应用最多，它们是分离、鉴定和纯化DNA及RNA片段的主要方法。该方法操作简便、快速，可以分辨其它方法(如梯密度离心法)所无法分离的片段。直接嵌入荧光染料后，在紫外灯下可直接检出DNA片段所在的位置，如有必要，从凝胶中回收DNA片段，用于各种克隆操作。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶均可制成各种不同大小、形状和孔径的凝胶块，在不同的装置上进行电泳。琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率低，但其分离范围广，约200bp~50kb的DNA。琼脂糖凝胶电泳通常在水平装置上进行。聚丙烯酰胺分离小片段(5~500bp)的效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。长度大于10 000kb的DNA片段，可以通过电场方向呈周期性变化，在脉冲电场胶中进行电泳。【试剂和器材】试剂：灭菌重蒸水；TE缓冲液；琼脂糖；核酸染料；；DNAmarker；6×上样缓冲液（0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油）器材：移液器；水平电泳槽；电泳仪，枪头，移液器，锥形瓶，微波炉，制胶槽，梳子，水平电泳仪，稳压器，凝胶成像系统【实验步骤】（1）称取1 g琼脂糖加入250mL锥形瓶中，量取100 ml 1× TAE电泳缓冲液加入锥形瓶。（2）微波炉加热并多次摇晃锥形瓶使琼脂糖充分溶解。

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳 1.原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。 2操作流程准备干净的配胶板和电泳槽琼脂糖凝胶电泳：水平电泳注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 (1)电泳方法

一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 (2)凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 (3)缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为Tris）是一种有机化合物，其分子式为(HOCH2)3CNH2。Tris被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备。例如，在生物化学实验中常用的TAE和TBE 缓冲液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。 (4)电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA 电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 (5)DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。 (6)DNA的上样

DNA电泳常见问题分析

D N A电泳常见问题分析The final revision was on November 23, 2020

献给初学者：PCR常见问题分析

献给初学者：PCR常见问题分析变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。 1没有扩展条带可能的原因及对应的解决方案如下：酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5~10分钟。引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。 DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。 2PCR产物量过少可能的原因和对应的解决方案如下：退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。 DNA模板量太少。增加DNA模板量。 PCR循环数不足。增加反应循环数。引物量不足。增加体系中引物含量。延伸时间太短。以1 kb/分钟的原则设置延伸时间。变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。 DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净 3扩增产物跑电泳条带弥散

可能的原因和对应的解决方案如下：酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。 dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。 MgCl？浓度过高。可适当降低其用量。模板量过多。质粒DNA的用量应<50 ng，而基因组DNA则应<200 ng。引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。退火温度过低。电泳体系有问题： ①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大； ②凝胶没有凝固好； ③琼脂糖质量差。若为PCR试剂盒则可能： ①由于运输储存不当引起试剂盒失效； ②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。 4扩展产物出现杂带可能的原因和对应的解决方案如下：引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。样品处理不当。 Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。