酵母基因克隆与表达载体
二.酵母基因克隆与表达载体
(一).功能型骨架载体-----用于不同用途的功能研究和载体改造
1、酵母基因组整合质粒(Yeast integrating plasmid, YIP)
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
此类质粒经酶切线性化后可整合到酵母细胞基因组中
用途: a.基因取代或基因删除 b.稳定型表达元件的整合(integration)和敲入(knock in)
2、酵母中心粒-自主复制质粒(Yeast CEN-ARS plasmid, YCP)
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
此类质粒在细胞内可自主复制,且由于含有中心粒复制序列,因此每个细胞近乎只有一个拷贝。
用途: 由于每个细胞平均只有一个拷贝,避免了目的基因的盈余表达,因而特别适用于基因功能的研究
3、酵母附加体质粒(Yeast episomal plasmid, YEP)
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
此类质粒在细胞内以附加体的形式高度复制, 每个细胞高达200-400个拷贝贝
用途: 用于外源基因的表达
(二). 表达载体
1、GAL1启动子表达载体-----半乳糖诱导的表达载体
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
2、Cup1启动子表达载体-----硫酸铜诱导的表达载体
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
3、ADH启动子表达载体-ADC1组成型表达载体
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
神奇的酵母遗传学技术与高等生物基因功能研究讲座（一）外源基因在酵母中的表达
2010-07-24 11:51:11| 分类： 酵母遗传学方法与 | 标签：酵母培养基 选择缺陷 dropout 表达质粒 |举报|字号 订阅
作者：泛基诺技术部模式生物组 朱蕾诺
芽生酵母（budding yeast, Saccharomyces cerevisiae）俗称酿酒酵母,是单细胞真核生物，它的基因组比较简单（仅为大肠杆菌的3-4倍），易于操作，遗传背景相对清楚，加之其突变株又易于分离，而被誉为“真核大肠杆菌”（Eukaryotic E.coli）和“体内试管”（In vivo test tube), 因而是研究高等真核生物基因功能的理想模式生物。正象离不开大肠杆菌的操作一样, 一个向深度发展的分子生物学实验室离不开酵母实验操作。
作为分子生物学实验操作的案头资料-红皮书(Current Protocol in Molecular Biology)将酵母作为一个独立的章节与其他常用分子生物学实验技术并行而列；而被生命科学实验室奉为圣经的分子克隆, 其第三版的多个章节则穿插有不同方面的酵母实验操作, 足见酵母遗传学方法在当今生命科学研究
中的重要作用。酵母在生命科学研究中主要用于以下几个方面:
一、外源基因在酵母中的的表达(Foreign gene expression in yeast)
最常用的外源基因表达受体是大肠杆菌，然而，自然界一些物种之间存在巨大的密码子偏好差异，一些物种的基因可以在大肠杆菌中得到有效的表达，而另一些物种的基因则在大肠杆菌中表达很弱或不能表达（如某些林木类植物），在这种情况下，作为真核细胞的酵母便成为目的基因表达的首选受体细胞。泛基诺公司技术部成功地为一些林业科学研究单位表达出大量具有天然活性的蛋白质，而这些蛋白质在原核生物大肠杆菌中是不能表达的（更详细的理论和技术信息可发电子邮件到:fungenome@https://www.360docs.net/doc/793583698.html,进行咨询）。另外，由于酵母具有易于繁殖且又无毒的特性（日常生活中用来发酵面粉和酿酒，故又称为面包酵母和啤酒酵母），因此生物技术和产业界研究人员常用酵母来表达外源基因，获得大量具有天然活性的蛋白质和经基因工程改造生产疫苗等。
1． 酵母表达载体的选择
用酵母来获得高产量蛋白质，其表达载体应具备以下三个特点：一是高效启动子，二是高拷贝质粒，三是可控性。GAL1启动子在半乳糖的诱导下，具有高效启动表达的特性，且在葡萄糖存在的情况下表达几乎完全被抑止，因此在大量表达某些蛋白可能对酵母细胞产生毒性的情况下，GAL1诱导性启动子是很好的选择。这类表达载体的代表是Invitrogen公司的pYes2和pYes3，泛基诺（FunGenome）公司的pYes4，pYes5，pYes6。如果大量表达的蛋白质不具有细胞毒性，ADH构成性（又称组成性）启动子则是非常适用的选择，这类表达载体的代表是泛基诺公司的pAY2，pAY3，pAY4
2． 酵母营养缺陷型培养基的选择
根据表达载体的特性来选择培养基，举例来说：如果选用的表达载体是pYes2那么就应该用SD-Ura(Synthetic Dropout Ura media),其原理是pYes2含尿嘧啶（Ura）合成酶途径中一个关键酶基因Ura3，当pYes2转化Ura3基因缺陷的酵母时，便可以在缺乏Ura的选择缺陷培养基SC-Ura中筛选。同样的道理，pYes3对应的选择缺陷培养基是SD-Trp(简写pYes3-Trp), pYes4(对应的选择缺陷培养基是SC-His，pYes5对应的选择缺陷培养基是SC-Leu, pYes6对应的选择缺陷培养基是SC-Ade。多元基因表达或质粒共转化时可选用SC-Ura-Trp-His-Leu-Ade的适当组合。更详细的培养基选择信息和特殊的个性化要求可发送电子邮件到fungenome@https://www.360docs.net/doc/793583698.html,咨询。这里特别强调，泛基诺公司提供的酵母选择缺陷培养基含有除葡萄糖外的所有营养成分，不需要再另加minimal SD base酵母含氮碱和其他氮源，加水后高压灭菌即可，极大地方便了使用者的配置，由于
提供的是粉剂，因此在保存干燥的情况下可以长期保存
神奇的酵母遗传学技术与高等生物基因功能研究系列讲座(二)酵母双杂交系统的前世今生
2010-08-02 15:39:40| 分类： 酵母遗传学方法与 | 标签：转录 gal4-bd gal4ad 报告基因 酵母双杂交 |举报|字号 订阅
酵母双杂交系统的原理、应用与进展
作者: 泛基诺技术总监 胡恩泛
【编辑部按：无论是新手上路还是导师专家，花几分钟的时间参阅下面由泛基诺技术总监撰写的内容，相信您还是能得到一些非常有用的信息，并在实际科研工作中有一定的借鉴作用】
酵母遗传学对二十世纪九十年代以来的生命科学与医学研究产生了极大地推动作用，其威力之巨大、影响之深远、应用之广泛使得其他任何一种模式生物都不能望其项背。这一节主要讲述酵母双杂交系统原理的最新诠释和实验操作精要。
酵母实验操作在国内研究型实验室广为传播的主要原因还是酵母双杂交系统的应用和发展，关于酵母双杂交系统的原理，这方面的文章俯拾皆是，但无论是新手上路还是导师专家，花几分钟的时间参阅下面由泛基诺技术总监撰写的内容，相信您还是能得到一些非常有用的信息，并在实际科研工作中有一定的借鉴作用。
【正文】酵母双杂交系统首先由Stanley Fields实验室建立的，其原始出处参见1987年Cell杂志上的论文。该系统的理论基础是建立在对于酵母半乳糖代谢调控的两个关键转录因子Gal80负调控因子和Gal4正调控因子的功能解析上。
GAL4基因是酵母糖代谢中的一个重要基因，其编码的蛋白质Gal4（备注: GAL4表示基因，Gal4表示蛋白）具有两个结构域：位于N末端的DNA结合结构域(DNA-binding domain,简称BD)和位于C末端的转录激活结构域(transcription-activating domain,简称AD)。DNA结合结构域（BD）能识别GAL1基因启动子的上游激活序列（Upstream Activating sequence,UAS），转录激活结构域（AD）可同转录复合物的其他成分作用，启动GAL1基因的转录。GAL1基因上游含4个特殊序列UASg (upstream activator sequence-galactose)。每个UASg由17bp序列构成，当加入半乳糖作为诱导物后，Gal4可全方位的与GAL1的UASg结合，从而使GAL1基因的表达成千倍地增加。
Gal4蛋白有一个非常突出的特性，它的二个结构域在其适当的连接区被打断后仍具有各自的功能，而且这两个不同的结构域可以重建继续发挥转录激活作用。这一特性使得研究者可以构建两个载体来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。具体方法是：将A基因与DB融合构建一个表达质粒（通常带Trp标志基因，以下简称Trp质粒）在酵母中表达Gal4-BD-A，将B基因与AD融合构建另
一个表达质粒（通常带Leu标志基因）表达Gal4-AD-B，然后将者两个质粒转化酵母，在泛基诺SD/-Trp-Leu双缺培养基上筛选转化克隆（备注：两个质粒共转化的效率一般很低，也可先后逐个转化，即先转化Trp质粒，在泛基诺SD/-Trp的培养平皿中筛选阳性克隆后再转化Leu质粒。如果A蛋白和B蛋白之间存在相互作用，那么Gal4-BD和Gal4-AD通过A和B的桥接作用被聚集在一起而重建转录因子的活性，启动下游报告基因的转录。早期的报告基因选用LacZ，后来为减少非特异性激活而产生的假阳性，增加了双报告基因和三报告基因(LacZ,His3,Ade2)。
1991年，我在美国做博士后期间, 老板从Stanley Fields实验室获得原始材料，让我对菌株和质粒进行改造， 原始菌株是SCY90，实际上将它作为起始材料基本上没有任何用处，因为其中的标志基因已经没有选择的余地，只能从W303-1A/-1B系列或YPH499/500系列开始.。我试图从以下几个方面来改进：1）用不同的启动子序列代替单一的GAL1，并将上游激活序列用定点突变（SDM）的方法进行优化；2）用三报告基因（Ade2、His3、LacZ）替换单报告基因（LacZ）和双报告基因（LacZ，His3）。这些工作三言两语说得轻巧，可做起来却花费了我近两年的时间。要知道，我们还要将原始菌株中的编码Gal80和Gal4这两个基因敲除（注意：酵母基因敲除英文不用knock out，而是用deletion，所以中文描述应该是基因删除）。熟悉酵母分子遗传学操作的人都知道，删除酵母的某个基因时，需要在基因组中插入可供筛选的标记基因，但为了方便后续实验，即为保证最终获得的酵母报告菌株有较多的选择标记基因可用，还需要将先前插入的标记基因再删除以备后续酵母转化实验中的质粒转化选择筛选，这些工作可是非常的time consuming！另外，当时定点突变采用的方法是Uracil选择法，该法费力耗时，可不像现在所采用的Strategene的SDM法简单快捷。在我走后又过了几年，双报告基因和三报告基因就先后商业化了，如Y187和AH109等.
不久前，由于一个委托研究课题的需要，我用荧虫酶报告基因Luciferase将LacZ置换掉，原始材料分别选用Y187和AH109，在实验之前，需要对局部基因组区域测序收集有关信息，结果发现：Y187和AH109这两个酵母报告株每个报告基因的上游UASg序列与我当年用定点突变优化的组合序列竟完全一致，一个碱基也不差!！我真的不敢想这是否就是出自我当年之手。谈笑间，二十年过去，往事如梦，但一切又仿佛是在昨天，令人感慨万千! 有一首歌是怎么唱的来着？仿佛是：多年后，终点又回到了起点。这就是酵母双杂交系统的前事今生！二十年前酵母遗传学的副产品酵
母双杂交系统如今在后基因组时代-蛋白质组研究中再次大放异彩。
神奇的酵母遗传学技术与高等生物基因功能研究系列讲座（三）酵母交配型实验与酵母双杂交系统
2010-08-15 13:21:43| 分类： 酵母遗传学方法与 | 标签：标记基因 酵母交配实验 酵母双杂交 假阳性 |举报|字号 订阅
酵母接合型转换、酵母交配型实验与酵母双杂交系统的发展
Yeast mating type switching , yeast mating assay and the development of yeast two-hybrid system
作者：泛基诺技术总监 胡恩泛
读者或和科研人员在接触酵母双杂交系统时，总会看到酵母细胞表型（基因型）的标记(俗称酵母菌株符号），如Mata或Matα，后面还紧跟一连串的小写标记符号如ura3,his3,leu2,trp1,ade2,can1-100，实际上这些都是基因符号，是酵母遗传操作尤其是酵母转化时非常有用的筛选标记。文献中特别是中文资料中缺乏清晰而又系统的关于酵母菌表型的诠释，使得初涉酵母实验的新手感觉是云里雾里。鉴于此，笔者便占用泛基诺官方博客一席之地对酵母基因型作一简要解释。
Mata或Matα是指酵母接合型（又叫酵母交配型，英文是yeast mating type），用于遗传学研究的酿酒酵母单倍体只有这两种接合型。a和α型单倍体可以交配形成二倍体a/α, 例如单倍体a型AH109和α型Y187交配(接合)形成二倍体, 其表型兼有a和α型的特征； Mat后面的小写基因符号表示相应基因的突变表型。具体说来，ura3表示尿嘧啶合成途径的一个关键酶的编码基因突变，带有这样基因型的酵母在缺乏尿嘧啶(Ura)的选择缺陷培养基（SD/-Ura）中不能生长，在同样的条件下，如转化了含Ura3野生型基因的质粒后或激活了报告基因Ura3（反向酵母双杂交系统）就能在SD/-Ura的选择缺陷培养基中生长了，这种转化标记筛选目前已被广泛用来研究外源基因在酵母中的表达（见神奇的酵母遗传学与高等生基因功能系列讲座一，这里不再赘述）。同样的解释，his3表示组氨酸合成酶的关键基因突变，转化了带His3报告基因质粒的ura3突变表型酵母可以用SC-His合成缺陷培养基筛选，leu2表示亮氨酸合成酶的关键基因突变，trp1表示色氨酸合成酶的关键基因突变，ade2表示腺嘌呤合成酶基因突变，相应的在选择缺陷培养基中的生长情况和筛选策略依次类推。can1表示编码精氨酸穿透（透过性）酶的基因突变，其表型与刀豆氨酸canavanine (一种植物来源的非蛋白氨基酸，精氨酸的结构类似物）抗性有关。
上一讲提到，酵母双杂交系统的建立本来是酵母遗传学研究的副产品，当初未曾料想这个系统对于生命科学研究的整体发展会产生如此巨大的影响。
酵母双杂
交系统自八十年代建立以来已有几次改进，除了第一次改进增加报告基因没有涉及到酵母遗传学的额外知识，其他两次改进都增添了新知识（如接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统，后者还涉及到5-FOA的代谢问题）。
大概是在2001－2002年间，Clontech公司推出了酵母接合（交配）型双杂交系统。在这之前，一直是以AH109或Y187单倍体（备注：Y153,Y190,SCY90早期菌株，目前已基本Out了）为受体菌，先转化诱饵质粒，然后再转化文库，通过报告基因检测（如在四缺培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade中）来筛选与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白。接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行Mating。
我是在2002首次接触到交配型双杂交这个系统，这里还有一个小故事。当时我在美国宾州大学分子生物学系做酵母遗传学方面的research, 爱人在生物系做果蝇(Drosophila)遗传学方面的研究，和爱人同实验室的一个研究生在用酵母双杂交筛选相互作用靶蛋白时遇到技术问题询问怎么办（实验室的人都知道我爱人以前做过酵母双杂交），我爱人不仅没能帮助解决，甚至连讨论性回答都说不上来。晚上回来和我说起这事，我便问她以前做了那么久酵母双杂交，什么情况基本上都遇到过，怎么一点也回答不上呢？爱人说：他们用的那个双杂交方法怎么那样怪啊？用了两种酵母然后还要变成二倍体，没见过这阵势，真是一点也不明白。我听后也是一头雾水，纳闷着我是否也Out了。第二天上班，爱人将我带到她所在的实验室，拿过说明书一看，是将两种接合型酵母进行交配, 原来如此啊，心里感叹美国人聪明，总是在不断地创新。交谈中得知学生遇到的问题是：效率低。这个效率问题应该是酵母接合效率的问题了。我当时研究的课题是酵母染色质沉默区HML和HMR基因调控机制，经常用到酵母接合型转换（Mating type switching）和酵母交配的实验技术，对常用酵母菌株之间的接合或交配效率如数家珍，于是我滔滔不绝，然后又三言两语建议改用质粒文库转化，因为质粒转化效率是完全可以提高的，不同的酵母转化方法，其效率可能会相差十万八千里，而酵母Mating效率的提高几乎没有令人激动的空间。我随后还将High efficiency yeast transformation protocol发给我爱人让她转发，后来他们实验室还真的按我的建议做了，问题也解决了。这可让我赚足了面子，其实这只不过是雕虫小技。
不论用哪一种方法，在筛选文库之前一定要检测诱饵质粒转化后表达的诱饵蛋白本身能否激活报告基因 ( 即进行所谓的自激活检测，备注：猎
物蛋白的自激活检测在完成筛选之后同样不可忽略)，这种情形下需要利用三缺培养基SD/-Trp-His-Ade来检测（以诱饵质粒的选择标记基因Trp为例），以免产生所谓的I 类假阳性。也许有的研究者遇到过这样的问题，好不容易通过酵母双杂交系统筛选到了阳性克隆，后来用GST pull- down和免疫共沉淀证（Co-IP）实全是阴性。当然，这种情况是完全可以避免的。另外，由于诱饵蛋白的存在致使报告基因His产生渗漏表达（leaky），即所谓的II 类假阳性也应该事先主动避免，少走弯路。一般情况下，在培养基中加入终浓度为25mM的3-AT可以有效地抑止His报告基因的渗漏表达，特殊情况下3-AT的浓度需要加大到45mM才能有效抑止渗漏表达，减少假阳性，在这种情形下，质粒文库转化酵母或两种接合型酵母进行接合交配后在SD/-Trp-Leu-His-Ade+X-Gal选择缺陷培养基中筛选时（备注：不同公司的诱饵载体和猎物载体由于选择标记基因不同，所用的选择缺陷培养基也不同，如有些公司的载体系统可能就要用到SD/-Ura），最后一道防火墙即挑起大而饱满的克隆仍然是必要的。
如果检测到诱饵蛋白自身就能激活报告基因时怎么办？这就是所谓的III类假阳性。在这种情况下是否就不能再利用酵母双杂交系统从文库中来钓鱼呢？笔者在前些年的研究工作中就遇到这样的情况，怎么办？改用其他蛋白质相互作用的方法钓基因？别说前些年，就是今天，酵母双杂交技术仍然是不可替代的发现相互作用靶标的首选方法。笔者的解决之道是：用生物信息学方法分析诱饵蛋白结构域，将诱饵蛋白潜在的具有AD功能的结构域用缺失突变的方法敲掉，然后重新构建诱饵载体，这一招还真的灵光。详细方法如有时间将在今后的泛基诺博客中继续交流，读者不妨保持关注。
写到这里，似乎可以收笔了，但意犹未兴，还有一类假阳性姑且称作是IV类假阳性。呵呵，四类（死类），不吉利呀。这类假阳性用上述解决III类的办法也无济于事，所以我们将它戏称为死假阳DFP（dead false positive）。这类假阳性产生的根本原因是细胞内诱饵蛋白和目标蛋白的表达量过高。我们知道，诱饵载体和猎物载体的启动子都是ADH，而ADH是酵母细胞组成型强启动子，启动子的强效性和组成型的聚积性使得待研究的蛋白质水平远远高于体内的真实水平，也就是说这类假阳性是系统本身造成的，因此无法克服。这也可以解释很多研究者在经过一系列排除假阳性实验后最终得出的所谓阳性克隆，在被后续其他实验手段严明正身时仍然是假阳性的困惑。因为体内蛋白质之间的相互作用是在极其微量的情况下发生的，酵母的高水平表
达使原来相互作用的量化基础成千上万倍地放大了。目前所有版本的酵母双杂交系统都存在这一缺陷，要解决这一问题，就要对酵母双杂交系统进行实质性改造而非改良。泛基诺研究人员利用酵母接合位点（Mating type locus）两侧沉默区HML和HMR基因调控的原理开发出一套全新的蛋白质相互作用系统，使得蛋白质可以保持在低水平的条件下检测到相互作用的存在。
现在，回头再来谈酵母接合型话题。前面提到，酵母接合型位点两侧是HML和HMR沉默区，基因沉默机制的研究是最近生命科学研究的热点，也是医学科学表观遗传特征研究的热门话题，如肿瘤相关基因的沉默与激活等等。因此，泛基诺博客即将开设表观遗传学高级讲座系列，由泛基诺技术部技术支持陈博主讲，特此预告。（附言：陈博是泛基诺技术部客户经理，很多客户都很熟悉，他理论知识丰富，技术娴熟，被大家称为万能技术支持）。不过，我的【神奇的酵母遗传学与高等生物基因功能研究系列讲座】仍然是未完待续----------
密码子偏好性分析
2007-12-07 13:51:18| 分类： 生物专业 |举报|字号 订阅
遗传信息在由mRNA到蛋白质的传递过程中是以三联体密码子的形式传递的。每种氨基酸至少对应一个密码子，最多的有6种对应的密码子。编码同一种氨基酸的密码子称为同义密码子。在蛋白质的合成过程中，同义密码子的使用概率并不相同。某一物种或某一基因通常倾向于使用一种或几种特定的同义密码子，这些密码子被称为最优密码子(Optimal Codon)，此现象被称为密码子偏好性(Codon Usage bias)。人们已对不同物种的密码子使用偏好性进行了一些研究，发现不同物种的基因在密码子使用上存在着明显的偏好性；不同功能的基因其密码子使用偏好性也存在较大的差异。
密码子使用的相对概率(Relative Synonymous Codon Usage，RSCU)作为衡量的标准。RSCU是指对于某一特定的密码子在编码对应氨基酸的同义密码子间的相对概率，它去除了氨基酸组成对密码子使用的影响，如果密码子的使用没有偏好性的话，该密码子的RSCU值等于1。当某一密码子的RScU值大于1时，代表该密码子为使用相对较多的密码子，反之亦然。它计算简便，而且直观地反映了密码子使用的偏好性。
密码子适应指数(Codon adaption index。CAI)该指数以一组具高表达水平的基因为参考，测量某一个基因的密码子偏好情况和这些高表达基因密码子偏好情况的接近程度，如果一个基因完全使用高表达基因中所用的密码子，则其CAI值为1。目前这个指数已被广泛用来预测基因的表达水平。
有效密码子数(Efective Number of
Codon。Nc)CAI测量的是某个基因所用的密码子与高表达基因所用密码子的接近程度。和CAI不同，Nc 测量的是某个基因的密码子偏好程度，如果一个基因平均使用每一个密码子，则其Nc为61，如果一个基因只使用每组同义密码子中的一个，则其Nc为20。理论上讲，一个具有低CAI的基因也可以同时具有低Nc值，换句话说，该基因具有较强的密码子偏好性，只不过其偏向的并不是高表达基因所用的密码子。
GC 和GC3s：GC测量的是基因中G和C的含量。GC3s则计算密码子第三个碱基中出现G或c的频率。一般认为这两个因素对基因的密码子选择有重要影响。