同步辐射红外光谱成像技术对细胞的研究

ＰＲＯＧＲＥＳＳＩＮ

ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ

ＤＯＩ：１０ ７５３６／ＰＣ１３０６６２

ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｇｃｈｅｍ．ａｃ．ｃｎ一一ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，２６（１）：１７８ １９２

同步辐射红外光谱成像技术对细胞的研究?

凌盛杰一邵正中一陈一新?

?

（聚合物分子工程国家重点实验室复旦大学高分子科学系先进材料实验室一上海２００４３３）

摘一要一同步辐射红外显微光谱技术凭借其超高亮度和高空间分辨率的优势，已经在多学科领域中取得了大量的研究成果三特别是在生物医学领域，同步辐射红外显微光谱可以对无染色二无标记的生物样品进行无损检测并可获得生物分子的大量结构信息，因此得到广泛应用三随着同步辐射红外显微光谱技术的发展，生物化学家和光谱学家已经将研究的重点从组织层次的红外光谱成像（组织红外光谱成像）扩展到细胞层次的红外光谱成像（细胞红外光谱成像），并在近十年的研究中取得了大量的研究成果，但同时也暴露出一些问题，例如（１）细胞或介质中的水在红外光谱酰胺Ⅰ谱带具有很强的吸收；（２）不平整的细胞表面会导致红外光谱中产生Ｍｉｅ散射；（３）细胞红外光谱的复杂性和不确定性会影响数据分析的有效性和准确性三另一方面，生化学家和光谱学家也为解决这些问题采取了许多有用的策略三因此，本综述首先从样品制备二实验设计以及数据分析等方面对最近十年来细胞同步辐射红外光谱成像技术取得的成果进行了总结，随后介绍了目前细胞红外成像技术面临的问题以及解决策略三我们相信，通过多束同步辐射红外光与焦平面阵列（ＦＰＡ）探测器的结合，同步辐射红外光谱成像技术在对细胞的结构和功能研究中以及其他领域不同材料的研究中都会逐步显示出独特的作用三

关键词一同步辐射光源一红外显微光谱一细胞一成像技术一数据分析

中图分类号：Ｏ６５７ ３３一文献标识码：Ａ一文章编号：１００５?２８１Ｘ（２０１４）０１?０１７８?１５

收稿：２０１３年６月，收修改稿：２０１３年９月，网络出版：２０１３年１２月２５日一?国家自然科学基金项目（Ｎｏ．１０９７９０２２）资助

ＴｈｅｗｏｒｋｗａｓｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（Ｎｏ．１０９７９０２２）

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（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＰｏｌｙｍｅｒｓ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅ，ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｄｖａｎｃｅｄＭａｔｅｒｉａｌｓ，ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００４３３，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ一Ｔｈａｎｋｓｔｏｔｈｅｕｌｔｒａ?ｈｉｇｈｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓａｎｄｈｉｇｈｓｐａｔｉａｌｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎｉｎｆｒａｒｅｄｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ，ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎｒａｄｉａｔｉｏｎｂａｓｅｄＦｏｕｒｉｅｒ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｆｒａｒｅｄ（ＳＲ?ＦＴＩＲ）ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙｉｓｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｍｕｌｔｉｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙｆｉｅｌｄ．Ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎｔｈｅｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｆｉｅｌｄ，ＳＲ?ＦＴＩＲｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙｅｍｐｌｏｙｅｄｉｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｕｎｓｔａｉｎｅｄａｎｄｕｎｌａｂｅｌｅｄｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓａｓａｎｏｎ?ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｉｎｔｈｅｒｅｃｅｎｔｔｅｎｙｅａｒｓ，ｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＳＲ?ＦＴＩＲｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓａｎｄｓｐｅｃｔｒａｌｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓｈａｖｅｅｘｐａｎｄｅｄｔｈｅｉｒｉｎｔｅｒｅｓｔｓｆｒｏｍｔｈｅｔｉｓｓｕｅｌｅｖｅｌＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇ（ｔｉｓｓｕｅＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇ，ｗｈｉｃｈｎｏｒｍａｌｌｙｆｏｃｕｓｏｎｉｍａｇｉｎｇａｔｉｓｓｕｅｓｅｃｔｉｏｎ）ｔｏｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｌｅｖｅｌＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇ（ｃｅｌｌＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇ，ｗｈｉｃｈｆｏｃｕｓｏｎｉｍａｇｉｎｇｏｆａｓｉｎｇｌｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｏｒｌｉｖｅｃｅｌｌ）．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅａｒｅｓｅｖｅｒａｌｐｒｏｂｌｅｍｓｎｅｅｄｔｏｂｅｏｖｅｒｃｏｍｅｉｎｃｅｌｌＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇ．Ｆｏｒｅｘａｍｐｌｅ，（１）ｗａｔｅｒｉｎｃｅｌｌａｎｄ／ｏｒｉｎｍｅｄｉｕｍｈａｓｓｔｒｏｎｇａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｉｎａｍｉｄｅⅠｂａｎｄ；（２）ｕｎｅｖｅｎｓｕｒｆａｃｅｏｆｃｅｌｌｌｅａｄｓｔｏＭｉｅｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｏｆＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒａ；（３）ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙａｎｄｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙｏｆＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒａｏｆｃｅｌｌａｆｆｅｃｔｔｈｅｖａｌｉｄｉｔｙａｎｄａｃｃｕｒａｃｙｏｆｔｈｅｄａｔａａｎａｌｙｓｉｓ．Ｏｎｔｈｅｏｔｈｅｒｈａｎｄ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓａｎｄｓｐｅｃｔｒａｌｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ

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四１７９一四

ｈａｖｅｄｅｓｉｇｎｅｄｆｒｕｉｔｆｕｌｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｔｏｓｏｌｖｅｔｈｅｓｅｐｒｏｂｌｅｍｓ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｗｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｔｈｅｓｔｕｄｉｅｓａｂｏｕｔｃｅｌｌＳＲ?ＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇｉｎｔｈｅｐａｓｔｔｅｎｙｅａｒｓｉｎｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗ．Ｗｅｆｉｒｓｔｌｙｄｅｓｃｒｉｂｅｔｈｅｓａｍｐｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎａｎｄｄａｔａａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓｉｎｔｈｅｓｅｐｕｂｌｉｓｈｅｄｗｏｒｋｓ，ａｎｄｔｈｅｎｐｕｔｆｏｒｗａｒｄｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎｓｏｎｃｅｌｌＳＲ?ＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇ．Ｗｅｂｅｌｉｅｖｅｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｍｕｌｔｉｂｅａｍｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎｓｏｕｒｃｅ／ｆｏｃａｌｐｌａｎｅａｒｒａｙ（ＦＰＡ）ｓｙｓｔｅｍ，ＳＲ?ＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇｗｉｌｌｂｅｃｏｍｅａｖｅｒｙｐｒｏｍｉｓｉｎｇｔｏｏｌｔｏｄｅｔｅｃｔｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓｎｏｔｏｎｌｙｆｏｒｃｅｌｌｓ，ｂｕｔａｌｓｏｆｏｒｍａｎｙｏｔｈｅｒｍａｔｅｒｉａｌｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｉｅｌｄｓ

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ一ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎｌｉｇｈｔｓｏｕｒｃｅ；ｉｎｆｒａｒｅｄｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ｃｅｌｌｓ；

ｃｈｅｍｉｃａｌｉｍａｇｉｎｇ；ｄａｔａａｎａｌｙｓｉｓ

ＴｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｃｅｌｌＳＲ?ＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｓ

ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｆｒｏｍｓａｍｐｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎａｎｄｄａｔａａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄｔｈｅｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎｓｏｎｃｅｌｌＳＲ?ＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇａｒｅａｌｓｏｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ．

Ｃｏｎｔｅｎｔｓ

１一Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ

２一ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｒｏｍＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒａｏｆｃｅｌｌｓ３一Ｓａｍｐｌｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎ３ １一ＡＴＲ?ＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇｏｎｃｅｌｌｓ３ ２一ＴｒａｎｓｍｉｔｔａｎｃｅＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇｏｎｃｅｌｌｓ４一Ｄａｔａａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｓ４ １一Ｕｎｉｖａｒｉａｔｅｉｍａｇｉｎｇ

４ ２一Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅｉｍａｇｉｎｇ

５一Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｓｏｌｖｉｎｇｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ

６一ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇｏｎｃｅｌｌｓ

６ １一Ｓｔｕｄｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｉｎｌｉｖｉｎｇｓｉｎｇｌｅ

ＰＣ１２ｃｅｌｌｓｗｉｔｈｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＦＴＩＲｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏ?ｓｃｏｐｙ６ ２一Ｒｅａｌ?ｔｉｍｅｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｂｉｏｆｉｌｍｓｗｉｔｈｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＦＴＩＲｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏ?

ｓｃｏｐｙ

７一Ｏｕｔｌｏｏｋ

１一引言

自从１９９０年，Ｗｏｎｇ等［１ ３］报道将红外光谱用

于表征正常和癌变的组织和细胞以来，其已经发展成为研究生物组织和细胞最为常用的方法之一三虽然红外显微光谱技术理论上分辨率能够到达衍射极限，但是目前绝大多数红外显微光谱仪配备的都是传统的ｇｌｏｂａｒ光源，其热源温度只有１０００

１５００Ｋ［４］，光源亮度较弱，因此当测试狭缝调节到小于１０μｍ（细胞尺寸相当）时，其光通量将明显降低，从而严重影响红外图谱的质量三由此人们普遍认为配备传统光源的红外显微光谱仪能够以细胞尺

寸（５ ５０μｍ）级别的分辨率对生物组织切片进行研究三

同步辐射作为一种新型的红外光源，具有光谱

宽（１０ １００００ｃｍ－１）二亮度高（比传统光源高２ ３

个数量级）二发散度小以及具有时间结构等优良特性［５ ７］，特别是其高亮度的特性十分适合开展显微光谱成像研究，因此从１９９３年美国国家同步辐射光源（ＮＳＬＳ）建成世界上第一条同步辐射红外显微光谱实验线站以来［８ １０］，同步辐射红外显微光谱成像

技术已经在各个学科领域得到了广泛的应用［６，１１ １４］三其中，生物医学成为其应用最为广泛的领域，相关研究呈逐年增长的趋势三

同步辐射红外显微成像技术在生物医学领域的研究，就其对象而言主要包括两个方面：（１）从生物组织层次进行研究（组织红外光谱成像），主要研究正常和病变的生物组织，解析致病机理；（２）从单细胞层次进行研究（单细胞红外光谱成像），主要研究细胞的生物化学变化和细胞的生理活动三目前越来越多的科学家将研究的重点从组织层次延伸至单细胞层次，特别是活细胞或者具有活性功能的细胞三我们在前两篇综述中已经介绍了同步辐射红外光谱技术的基本原理二实验技术，及其在生物医学和分析化学领域的应用［６，１１］，因此本文主要介绍同步辐射红外光谱在细胞研究中的应用三由于同步辐射红外光谱成像技术与传统红外光谱成像技术除了在光源上有所不同，在样品制备二实验设计以及数据分析上没有多大区别，本文我们也会对传统红外成像的结

四１８０一四

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果进行相应的介绍三

与组织红外光谱成像相比，细胞红外光谱成像除了能获得组织红外光谱成像所获得的信息外，还具有以下几点优势［１５］：（１）可直接获得细胞内的生物化学信息三一般红外光谱对生物分子的表征往往存在一个明显的缺陷，即测试的样品往往经过纯化处理，因此生物分子在生物体内的特征只能通过体外纯化的测试结果进行推测三细胞红外光谱成像不仅避免了复杂的纯化过程，还可以在原生环境条件下实时监测生物分子的结构及其变化，从而避免纯化过程和细胞环境改变对于生物分子结构的影响三（２）可研究细胞间的变异性（ｃｅｌｌ?ｔｏ?ｃｅｌｌｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）三同基因细胞间的细胞活性和分子性能的差异性一直是细胞生理学研究的主要问题［１６］三细胞群的变异性一方面体现在群体中不同细胞之间的结构差异，

另一方面则体现在不同时间尺度下细胞结构的变化三这些差异和变化也被称作生物噪声（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｎｏｉｓｅ）［１７］三细胞红外光谱成像可以很好地跟踪和分析这些变异性三（３）可鉴别和检测罕见的或稀疏的细胞表型（ｃｅｌｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）三生物组织通常利用不同细胞的巧妙方式组合来实现其结构化和功能化三采用细胞红外光谱成像既可以探测组织中特定种类的细胞，也可以进一步了解特定细胞与周围细胞的相互作用机理三在细胞培养过程中，为了研究具有特定表型或特定细胞周期的细胞，也必须采用细胞红外光谱成像三（４）检测细胞中的特定部分或组成三细胞的生物化学特性与细胞中特定的细胞器或特定的细胞区域密切相关，但是组织红外光谱成像所获得的是多个细胞信息的总和，因此特定细胞器或细胞区域所提供的信息会被掩盖掉三细胞红外光谱成像可以大大提高红外成像对细胞研究的选择性和敏感性三（５）可检测细胞内生物分子的取向三生物分子（例如，磷脂和膜蛋白）在细胞内通常呈各向异性三通过调节红外光源的偏振性，可以获得不同偏振方向上细胞的红外吸收，从而可以研究细胞分子的取向状况三但组织红外光谱成像一方面在样品制备过程中会导致细胞中分子取向的改变［１８］，另一

方面成像所获得的红外吸收往往是多个细胞吸收的总和，因此很难用于研究特定分子在细胞中的取向状况三细胞红外光谱成像则可以很好地克服以上缺点，加之同步辐射红外光源具有良好偏振性，使其更加适宜于研究细胞中分子的取向状况三（６）可检测浓度梯度三许多细胞生理过程会导致某些物质在细胞内部和外部存在一定的浓度梯度，只有高分辨的

细胞红外光谱成像才能鉴别这些浓度梯度三

２一细胞红外光谱中包含的分子结构信息

细胞作为生命活动的基本结构和功能单元，被分为截然不同的两大类：原核细胞和真核细胞三细菌界和古菌界的生物由原核细胞构成，原生生物二真菌二植物和动物均由真核细胞构成［１９］三就其物质组成而言，各类细胞基本都含有蛋白质二脂质以及核酸等三

典型的生物细胞的红外光谱如图１ａ所示［２０］三

图１一（ａ）细胞的典型红外光谱（注意水Ｏ Ｈ键的伸缩和弯曲振动模式和蛋白质酰胺Ａ，酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ谱带重叠）［２０］；（ｂ）典型的蛋白质酰胺Ⅰ谱带以及相应的分峰拟合结果（最外的曲线是实验获得的红外光谱三不同二级结构对应的波数范围如下：α?螺旋，１６６２ １６４５ｃｍ－１；β?折叠，１６３７ １６１３ｃｍ－１，１６８９ １６８２ｃｍ－１，β?转角，１６８２ １６６２ｃｍ－１；无规线团；１６４５ １６３７ｃｍ－１）［２１］

Ｆｉｇ．１一（ａ）ＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆａｔｙｐｉｃａｌｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｅｌｌ．

ＮｏｔｅｔｈａｔｔｈｅＯ ＨｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇａｎｄｂｅｎｄｉｎｇｍｏｄｅｓｏｆｗａｔｅｒｏｖｅｒｌａｐｗｉｔｈｔｈｅａｍｉｄｅＡ，Ｉ，ａｎｄＩＩｂａｎｄｓｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎ．［２０］（ｂ）ＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｄｃｕｒｖｅｆｉｔｔｉｎｇｏｆｔｈｅａｍｉｄｅＩｂａｎｄｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＴｈｅｔｏｐｃｕｒｖｅｉｓｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｔｈｅａｍｉｄｅＩｂａｎｄ．Ｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｌｉｍｉｔｓｆｏｒｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：α?ｈｅｌｉｘ，

１６６２ １６４５ｃｍ－１；β?ｓｈｅｅｔ，１６３７ １６１３ｃｍ－１ａｎｄ１６８９ １６８２ｃｍ－１；β?ｔｕｒｎｓ，１６８２ １６６２ｃｍ－１；ａｎｄｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ

ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（ｒａｎｄｏｍ），１６４５ １６３７ｃｍ－１［２１］

细胞的主要成分在中红外区域（５００

４０００ｃｍ－１）都具有明显的特征吸收峰三蛋白质主要

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的特征吸收为酰胺谱带，在中红外区域主要存在酰

胺Ⅰ（１６００ １７００ｃｍ－１，主要是ＣＯ的伸缩振动），酰胺Ⅱ（１５００ １６００ｃｍ－１，主要是Ｃ Ｎ的伸缩振动）和酰胺Ⅲ（１２００ １３００ｃｍ－１，振动模式相对复杂，包括Ｈα的弯曲振动，Ｃ Ｎ的伸缩振动和Ｎ Ｈ的面内弯曲振动）三其中，酰胺Ⅰ不仅可以用来鉴别蛋白质，而且蛋白质中不同二级结构在该谱带中都具有特定吸收范围，因此酰胺Ⅰ既可以用峰位来定性判断蛋白质的二级结构，也可以通过分峰拟合来半定量地计算各种二级结构的相对含量（图

１ｂ）［２１］

三此外，脂质的主要特征吸收出现在：２９５９ｃｍ－１（ＣＨ３中Ｃ Ｈ反对称的伸缩振动），２９２２ｃｍ－１

（ＣＨ２中Ｃ Ｈ反对称的伸缩振动），２８７２ｃｍ

－１

（ＣＨ３中Ｃ Ｈ对称的伸缩振动），２８５２ｃｍ－１

（ＣＨ２中Ｃ Ｈ对称的伸缩振动）和１７４１ｃｍ－１

（ＣＯ的伸缩振动）；核酸的特征吸收则出现在：１７１５ｃｍ－１（嘧啶中ＣＯ的伸缩振动），１２５０ １２２０ｃｍ－１（ＰＯ２－反对称伸缩振动）和１０８５ｃｍ－１（ＰＯ２－对称伸缩振动）［２０，２２，２３］三生物样品红外光谱中峰位的详细归属如表１所示三

表１一生物样品红外光谱的峰位归属［２２，２３］

Ｔａｂｌｅ１一Ｔｅｎｔａｔｉｖｅａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｏｆｂａｎｄｓｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙｆｏｕｎｄｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓ［２２，２３］

ｆｒｅｑｅｎｃｙ（ｃｍ－１）

ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ

３５００Ｏ Ｈｓｔｒｅｔｃｈｏｆｈｙｄｒｏｘｙｌｇｒｏｕｐｓ ３２００Ｎ Ｈｓｔｒｅｔｃｈ（ａｍｉｄｅＡ）ｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ２９５９ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃＣ Ｈｓｔｒｅｔｃｈｏｆ ＣＨ３２９３４ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃＣ Ｈｓｔｒｅｔｃｈｏｆ ＣＨ２

２９２１ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃＣ Ｈｓｔｒｅｔｃｈｏｆ ＣＨ２ｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｓ２８９８Ｃ ＨｓｔｒｅｔｃｈｏｆＣ Ｈｍｅｔｈｉｎｅ２８７２ｓｙｍｍｅｔｒｉｃＣ Ｈｓｔｒｅｔｃｈｏｆ ＣＨ３

２８５２ｓｙｍｍｅｔｒｉｃＣ Ｈｓｔｒｅｔｃｈｏｆ ＣＨ２ｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｓ１７４１ＣＯｓｔｒｅｔｃｈｏｆｅｓｔｅｒｓ１７１５ＣＯｓｔｒｅｔｃｈｏｆｅｓｔｅｒｓ，ＲＮＡ／ＤＮＡ１６９５，１６８５，１６７５

ａｍｉｄｅＩｂａｎｄｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｒｅｓｕｌｔｉｎｇｆｒｏｍ

ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌｐｌｅａｔｅｄｓｈｅｅｔｓａｎｄβ?ｔｕｒｎｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ １６５５ａｍｉｄｅＩｏｆα?ｈｅｌｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ １６３７ａｍｉｄｅＩｏｆβ?ｐｌｅａｔｅｄｓｈｅｅｔｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ１５７５ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｓｔｒｅｔｃｈＣＯＯ－１５４８ａｍｉｄｅＩＩ

１５１５ｔｙｒｏｓｉｎｅｂａｎｄ

１４６８Ｃ ＨｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＣＨ２

１４００ｓｙｍｍｅｔｒｉｃＣＯｓｔｒｅｔｃｈｏｆＣＯＯ－

１３１０ １２４０ａｍｉｄｅⅢｂａｎｄｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ１２５０ １２２０ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃＰＯｓｔｒｅｔｃｈｏｆＰＯ２－１２００ ９００Ｃ Ｏ Ｃ，Ｃ ＯｄｏｍｉｎａｔｅｄｂｙｒｉｎｇｖｉｂｒａｔｉｏｎｓｏｆｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓＣ Ｏ Ｐ，Ｐ Ｏ Ｐ

１０８５ｓｙｍｍｅｔｒｉｃＰＯｓｔｒｅｔｃｈｏｆＰＯ２－

ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒｓ

７２０Ｃ ＨｒｏｃｋｉｎｇｏｆＣＨ２９００ ６００ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｒｅｇｉｏｎ

３一样品的制备和实验方法的设计

样品的制备是细胞红外光谱成像实验最根本的也是最重要的方面，其关键在于测试过程中如何保证细胞仍然具有活性三退一步而言，即便不能保证细胞完全存活，至少也应保证在测试过程中所研究的功能（例如，光敏细胞的光敏反应）没有发生本质的变化三而对于更苛刻的实验要求，还需要将细胞控制在特定的状态，比如控制细胞的细胞周期三因此对于不同的实验要求，样品的制备和实验方法的设计也不尽相同三

一般而言，红外光谱成像技术按照测试模式的区别可以分为：透射（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）成像二反射（ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）成像以及衰减全反射（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｔｏｔａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＲ）成像三根据样品性质和测试目的，可以选择不同的测试模式三不过反射成像很少用于生物医学领域的研究，因为生物组织自身的反射率较低，对生物材料进行抛光也不容易实现，所以在本文中我们主要对衰减全反射成像和透射成像的实验设计进行介绍三其中，细胞的透射成像与生物组织透射成像的最大区别在于，细胞红外光谱成像通常希望细胞在测试过程中保持活性，所以需要将细胞放入水或者营养液中进行培养并测试三这对样品池的设计提出了很高的要求，也是细胞透射成像最难实现的环节三因此，对于细胞透射成像我们主要介绍目前已见报道的用于单细胞红外光谱成像样品池的设计策略三

３ １一衰减全反射红外光谱成像ＡＴＲ红外成像模式测试的采样路径长度与样

品厚度无关，所以无需特别地控制细胞的厚度三此外，在ＡＴＲ红外成像中，显微镜系统中可采用高反射指数的ＡＴＲ物镜，其成像的空间分辨率可超过透射成像，因此该成像技术目前已广泛应用于生物医学领域的研究［２４］三例如，Ｋａｚａｒｉａｎ等［２４，２５］成功地进行了细胞的ＡＴＲ红外成像，他们直接在可移动的ＡＴＲ晶体表面培养细胞（图２ａ），使细胞与ＡＴＲ晶体表面具有良好的接触，然后再将可移动的ＡＴＲ晶体板与ＡＴＲ物镜组装后进行测试（图２ｂ）三图２ｃ为采用１５３５ｃｍ－１（蛋白质酰胺Ⅱ）和１０８５ｃｍ－１（ＤＮＡ中ＰＯ２－对称伸缩振动）强度积分得到的细胞红外光谱成像图，根据１５３５ｃｍ－１成像图可以确定细胞所处位置，根据１０８５ｃｍ－１成像图则可以进一步判断细胞核所处的区域三从细胞核区域提取的红外单谱（图２ｃ右图）可以发现，１０８５ｃｍ－１在细胞核

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区域（１０８５ｃｍ－１成像图中的ａ点）的吸收明显比细胞核周围（１０８５ｃｍ－１成像图中的ｂ点）的吸收强度

大，这表明该成像技术的空间分辨率达到了亚细胞的水平三

图２一衰减全反射红外光谱成像对单细胞的研究：（ａ）细胞在ＡＴＲ晶体表面生长的示意图（左）和测试原理图（右）；（ｂ）可移动ＡＴＲ晶体板的光学照片（左）和与ＡＴＲ

物镜组装后的光学照片（右）；（ｃ）细胞的红外成像图（左）和在ａ，ｂ两点提取的相应红外单谱（右）

［２４］

Ｆｉｇ．２一ＡＴＲ?ＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇｆｏｒｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌ．（ａ）ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｓｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆｓｅｅｄｉｎｇｌｉｖｅｃｅｌｌｓｏｎａｒｅｍｏｖａｂｌｅＡＴＲｓｌｉｄｉｎｇｐｌａｔｅ（ｌｅｆｔ）ａｎｄｈｏｗｉｔｉｓａｔｔａｃｈｅｄｔｏｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｄｕｒｉｎｇｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ（ｒｉｇｈｔ）；（ｂ）ＰｈｏｔｏｇｒａｐｈｏｆｔｈｅａｃｔｕａｌＡＴＲｓｌｉｄｉｎｇｐｌａｔｅ（ｌｅｆｔ）ａｎｄｗｈｅｎｉｔｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｔｏｔｈｅＡＴＲｏｂｊｅｃｔｉｖｅ（ｒｉｇｈｔ）；（ｃ）ＦＴＩＲｉｍａｇｅｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｕｓｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｔｒａｌｂａｎｄｓ（ｌｅｆｔ）ａｎｄｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｓｐｅｃｔｒａ（ｒｉｇｈｔ），ａｆｔｅｒｔｈｅｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎｏｆａｂｓｏｒｂａｎｃｅｏｆｗａｔｅｒ，ｆｒｏｍｌｏｃａｔｉｏｎｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｏｎｔｈｅＦＴＩＲｉｍａｇｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅ１０８５ｃｍ

－１

ｂａｎｄ

［２４］

但是ＡＴＲ红外成像存在一个明显的缺点，即衰减波（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔｗａｖｅ）的渗透深度有限［２０］，所以测试所得红外光谱的信噪比（ｓｉｇｎａｌｔｏｎｏｉｓｅｒａｔｉｏ，ＳＮＲ）较差三虽然同步辐射红外光源与ＡＴＲ红外成像技术的结合目前还未见报道，但是可以想象利用同步辐射红外光源的高亮度的优势可以大大提高ＡＴＲ红外成像的图谱质量三另外，由于衰减波渗透深度的限制，ＡＴＲ红外成像技术只能探测细胞表面

１ ２μｍ的深度，所以处在细胞内部的细胞核或者其他细胞器对于总体红外吸收的贡献非常有限三然而这些亚细胞单元在细胞的生理活动中起着非常重

要的作用，因此ＡＴＲ红外成像能否真正应用于对细胞的研究还需要进一步的确认［２０］三

３ ２一透射红外光谱成像

细胞红外光谱成像研究中，透射模式仍是最常

采用的方式，其实验策略中最为重要的方面则是透射样品池的设计三最简单的样品池的设计是直接采用标准的红外液体池，其构造如图３ａ所示［１５］，即将细胞夹持在两片红外透明窗口材料（通常采用ＣａＦ２或ＢａＦ２盐片）之间，两盐片间的距离和空间区域大小可以通过选择不同尺寸的垫圈来调节，然后再使用螺丝将其固定，从而形成 三明治 结构三水或培养液可以通过微孔注射到样品池中三样品池还可以进一步改装，例如外接恒温装置来控制样品池内的温度三虽然这类样品池设计简单二价格低廉并已经在细胞红外光谱成像中广泛应用，但是也存在以下几个缺点：（１）使用螺丝固定样品池时两盐片之间的压力增加可能破坏细胞的结构三另外，将液体注入样品池的过程中，液体流动产生的剪切应力也会在一定程度上损伤细胞；（２）液体中的液体并非流

动液体，因此不能实时调整培养液的组成，池内液体更换也非常不方便，需将液体池拆解并移除样品后重新加入液体；（３）不能原位监测药物或者营养液对于细胞的影响；（４）测试结束后样品很难回收，不利于后续实验研究三

为了克服上述传统液体池的缺点，红外光谱学的研究工作者开发了多种其他类型的样品池，例如可拆卸液体池［２６］二开放回路液体池［２７］二微流道盐片［２８］等三其中采用微加工技术制备的具有微流道的红外盐片，虽然其加工技术还处于初级阶段，但从目前已见报道的一些装置上看，已经在一定程度上有效地克服了传统液体池的一些缺点三下面列举若干种新型透射样品池的例子三

Ｔｏｂｉｎ等［２６］在氟化钙盐片表面上旋涂一层厚度

在６ ８μｍ光阻聚合物ＡＺ４６２０，然后采用紫外光刻技术制备了具有特定图案的二路径长度可控（小于１０μｍ）的氟化钙微流体盐片，如图３ｂ所示三Ｎａｓｓｅ等［２７］则在硅片单侧表面上生长一层金刚石薄膜，然后在其表面加上一个厚度为１５μｍ垫圈，接下来用一片没有生长金刚石薄膜的硅片覆盖垫圈三接着采用模板刻蚀的方法去除上下硅片的特定区域（可以根据需要设计不同图案的模板），从而使该区域的金刚石薄膜暴露在光路中三底部硅片除了与顶部硅片图案一致以外，还需要再刻蚀两个通孔，作为液体进入和流出流体池的通道三最后将该部分组件

化学进展，２０１４，２６（１）：１７８ １９２

四１８３一四

安装到硅胶或氟橡胶密封的聚四氟乙烯底座上，从而制备出了具有开放回路的液体池，如图３ｃ所示三此外，Ｈｏｌｍａｎ等［２８］采用深层反应离子刻蚀（ｄｅｅｐｒｅａｃｔｉｖｅｉｏｎｅｔｃｈｉｎｇ）技术在硅片中刻蚀出深度为１０ １５μｍ二宽度约４０μｍ的亲水微流道，并在各支线

上巧妙地设计了４个矩形的微滴腔（如图３ｄ），水从微流道进入微滴腔时产生的流体静压力与水流出微滴腔时产生的毛细管作用力相平衡，因此水在流道中可以一直保持连续的薄膜层流（ｔｈｉｎ?ｆｉｌｍｌａｍｉｎａｒｆｌｏｗ），且可将水的体积流量控制在６０μｍ四ｓ－１左右三

图３一同步辐射红外光谱对单细胞研究中使用的样品池示意图：（ａ）常规可拆卸二加热的红外液体池［１５］；（ｂ）采用氟化钙晶体制备的具有开放回路的样品池［２６］；（ｃ）可拆卸的流动液体池［２７］；（ｄ）采用微流体加工技术制备的明渠微流体液体池［２８］Ｆｉｇ．３一ＥｘａｍｐｌｅｓｏｆｓａｍｐｌｅｈｏｌｄｅｒｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓｆｏｒｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＦＴＩＲｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．（ａ）Ｂａｓｉｃｓａｍｐｌｅｈｏｌｄｅｒｆｏｒａｑｕｅｏｕｓｃｅｌｌ

ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓｂａｓｅｄｏｎｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｏｌｙｍｅｒｉｃｓｐａｃｅｒｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｏｐｔｉｃａｌｗｉｎｄｏｗｓ．Ｔｈｅｈｏｌｄｅｒａｌｌｏｗｓｔｈｅｆｌｏｗｏｆａｎａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎａｒｏｕｎｄｔｈｅｅｄｇｅｏｆｔｈｅｗｉｎｄｏｗｓｔｏｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｆｏｒｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｔｈｅｓａｍｐｌｅ（ｔｏｐ），ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｓａｍｐｌｅｈｏｌｄｅｒｆｏｒａｑｕｅｏｕｓｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓｂａｓｅｄｏｎｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｏｌｙｍｅｒｉｃｓｐａｃｅｒｂｅｔｗｅｅｎｔｗｏｏｐｔｉｃａｌｗｉｎｄｏｗｓ．Ｔｈｅｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｅｉｔｈｅｒｂｙｆｌｏｗｉｎｇａｔｈｅｒｍｏｓｔａｔｉｃｆｌｕｉｄａｒｏｕｎｄｔｈｅｈｏｌｄｅｒｏｒｂｙｕｓｅｏｆａｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｌａｔｅ（ｂｏｔｔｏｍ）［１５］；（ｂ）ＣａＦ２ｗｉｎｄｏｗｓｗｉｔｈｆａｂｒｉｃａｔｅｄｓｐａｃｅｒｓ（ｔｏｐ）ｆｏｒａｓｓｅｍｂｌｙｉｎｔｏＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎｃｅｌｌ（ｂｏｔｔｏｍ）［２６］；（ｃ）Ｄｅｍｏｕｎｔａｂｌｅｌｉｑｕｉｄ／ｆｌｏｗｃｅｌｌ．Ｔｈｒｅｅ?

ｑｕａｒｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎｖｉｅｗｏｆｔｈｅｆｌｏｗｃｈａｍｂｅｒ（ｔｏｐ）ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆｌｉｄ，ｂａｓｅ，ｄｉａｍｏｎｄ?ｃｏａｔｅｄｓｉｌｉｃｏｎｗａｆｅｒｓ，ｓｐａｃｅｒ，ｓｅａｌｓ，ｗａｔｅｒｔｕｂｅ，ａｎｄｓｃｒｅｗｓｆａｓｔｅｎｉｎｇｔｈｅｌｉｄｔｏｔｈｅｂａｓｅ，ａｎｄｅｘｐｌｏｓｉｏｎｖｉｅｗ（ｂｏｔｔｏｍ）ｏｆｔｈｅｆｌｏｗｃｈａｍｂｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈｅｗａｔｅｒｆｌｏｗ（ａｒｒｏｗｓ）［２７］；（ｄ）ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＦＴＩＲｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｐｌａｔｆｏｒｍｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｅｔｕｐ（ｔｏｐ），ｐｌａｉｎｖｉｅｗｄｅｐｉｃｔｉｏｎｏｆａｎｅｘａｍｐｌｅｃｈｉｐｗｉｔｈｓｅｖｅｒａｌｐａｒａｌｌｅｌｅｔｃｈｅｄｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（ｂｏｔｔｏｍｌｅｆｔ），ａｎｄｆｌｏｗｍａｐｓｏｆｔｈｅｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，

ｓｉｍｕｌａｔｅｄｆｒｏｍｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙｍｅａｓｕｒｅｄｐａｔｈｓｏｆｎｅａｒ?ｎｅｕｔｒａｌｄｅｎｓｉｔｙｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅｂｅａｄｓ（ｙｅｌｌｏｗａｒｒｏｗｓ）ａｎｄｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｅｄｏｎａｓｎａｐｓｈｏｔｉｍａｇｅ（ｂｏｔｔｏｍｒｉｇｈｔ）［２８］

４一数据分析方法

随着红外光谱成像技术的迅速发展，相应的数据处理方法也趋于多样化，这为研究者提供了更多分析手段的同时也增加了错误分析的可能性三因此，在实际应用中应根据不同的研究目的，选择合适的数据分析方法三总体而言，对于红外光谱成像的数据处理主要包括以下几个步骤［２９］：（１）质量控制（ｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌ）三在红外光谱成像中，仪器饱和（如

样品太厚导致吸收强度太强）二仪器故障二气体污染二光散射和噪声过大等都会导致红外光谱成像数据集中存在异常值（ｏｕｔｌｉｅｒｓ），因此在数据分析之前必须先检测并剔除这些异常值三（２）数据预处理

（ｐｒｅ?ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）三数据预处理通常被认为是成像分析前最重要的步骤，包括基线校正二去除非样品（例如，水分二二氧化碳等）的红外吸收二校正由于浓度或者样品厚度不均匀导致的光谱差异二以及消除噪声（由于通过同步辐射红外光源获得的图谱质量通常比较好，所以此步骤往往可以忽略）三（３）提取特征（ｆｅａｔｕｒｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）三根据研究目的，提取图谱中的有用信息，对于细胞红外光谱成像而言，主要是蛋白质二脂类以及核酸等的特征吸收峰的峰位以及强度信息三（４）红外光谱成像（ＦＴＩＲＩｍａｇｉｎｇ）三根据过程（３）的分析结果，按照适当的成像方法进行成像，从而获得一定空间尺寸的红外光谱二维或三维成像图三按照对成像数据分析方法的不同，红外光

四１８４一四

ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，２６（１）：１７８ １９２

谱成像可以分为单变量成像（ｕｎｉｖａｒｉａｔｅｉｍａｇｉｎｇ）和多变量成像（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅｉｍａｇｉｎｇ）两种三

４ １一单变量成像

单变量成像也叫化学成像（ｃｈｅｍｉｃａｌｉｍａｇｉｎｇ）

或官能团成像（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｒｏｕｐｉｍａｇｉｎｇ），是红外光谱成像中最基本二最常用的方法三该方法对要研究物质（或组分）的特征吸收峰的强度（或吸收峰的面积）在各像素点进行积分（也即是对各像素点的单谱中某个峰的强度或峰面积进行积分），然后再按照各像素位置组装成二维或三维红外光谱成像图［６，１１］三

红外光谱成像图可以直观地展现出所采集样品

区域内特定组分的分布及其强度关系，但是对于生物样品，特别是细胞，红外光谱成像所获得图谱的基线往往会发生倾斜，为了消除基线对于成像的影响，二阶导数谱也经常被用于积分成像三此外，由于二阶导数谱（以及自去卷积谱）在红外分析中通常被认为是 光谱分辨率增强技术（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｅｎｈａｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ） ［３０］，因此采用二阶导数谱成像还有一

个优点是谱的分辨率比原谱更高三但需要注意的是，二阶导数谱的信噪比相对于原谱有所降低，所以对其分析应格外小心，应排除图谱噪音对分析结果的影响三

４ ２一多变量成像虽然单变量成像方法简单二操作方便，但如前所

述单变量成像通常只按照一个特定的吸收峰的强度或面积来积分，因此当各像素点的单谱差异较小时，采用单变量成像方法得到的结果并不可靠三因此，Ｌａｓｃｈ等［３１，３２］在多变量模式识别（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅｐａｔｔｅｒｎ

ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ）基础上发展了多变量红外光谱成像方法，主要包括主成分分析（ｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ，ＰＣＡ）成像和聚类分析（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）成像三这些多变量成像方法既可以选取特定吸收峰进行分析，也可以使用整个光谱区间或者特定波数（频率）区间进行分析，因此可以在一定程度上克服单变量成像的缺点三

４ ２ １一主成分分析成像主成分分析是一种分析二简化数据集的方法三该方法在不导致损失原变量太多信息的前提下，尽可能降低原变量的维数，即用维数较少的互不相关的新变量（该新变量也被叫做主成分）反映原变量所提供的绝大部分信息［３３］三主成分的个数根据主成分的累计贡献率来确定（一般选取累计贡献率达

到８５％ ９５％的特征值λ１，λ２， ，λｍ所对应的第

１二第２二 二第ｍ个主成分），在确定主成分的个数之后可以进一步计算各主成分载荷（ｌｏａｄｓ），最后根据主成分的载荷可以计算出各主成分的得分值（ｓｃｏｒｅｓ）［３４］三

主成分成像是对红外光谱成像数据集（原变

量）进行降维处理并转换为不相关新变量集，然后根据各像素谱的前几个主成分的得分值重新组装成为新的二维或三维成像图［３５］三相似的图谱其主成分的得分值也相近，因此从主成分成像图中可以根据颜色差异来区分不同像素点的图谱差异的大小三

４ ２ ２一聚类分析成像

聚类是将数据分类到不同的类或者簇的过程，

所以同一个簇中的对象有很大的相似性，而不同簇间的对象有很大的相异性［３３］三在红外光谱成像中最常应用的是系统聚类（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）［３１］三

所谓系统聚类也叫层次聚类，是对给定的数据对象（各像素点的红外光谱）集合进行层次的分解，而分解的标准主要基于各像素谱的相似性三最开始每一个像素谱被作为单独的一类，然后将各像素谱的相似性最高（即最短的距离，可以按照欧几里德距离和马氏距离判断）的单谱合并为一个层次，如此相继地合并二分类单谱，直到最后所有的单谱合并成一个（层次的最上层），或者达到一个终止条件三

虽然聚类分析方法本身不是成像方法，但是可以将同层次的图谱编码为同一个颜色，然后再将各颜色按照像素谱的空间序列排列构建出伪彩色（ｐｓｅｕｄｏｃｏｌｏｒ）的二维剖面图，从而反映各像素点图谱的相似性［３１］三但是聚类分析存在一个明显的问题是聚类的层次数是不可能预先知道的，因此很难预先制定层次个数，所以只能反复地使用有效性指标对聚类分析结果进行评估，以此来确定合适的层次数三

５　实验存在的问题及其解决策略

经过十多年的发展，同步辐射红外光谱成像技术已经被证明在研究细胞结构和功能方面具有很大的潜力，但同时也暴露出一些问题，生物学家以及光谱学家也正在寻求各种方法来完善该技术三

５ １一水对于测试的影响

细胞红外光谱成像过程中，为了保持细胞的活

性，测试往往是在湿气氛围或是水溶液中进行的三但是，水分子在３０００ ３７５０ｃｍ－１（Ｈ２Ｏ的反对称和对称伸缩振动）以及１６００ １７００ｃｍ－１（Ｈ２Ｏ的弯曲振动）都存在明显的红外吸收，如图４所示［１５］三表

化学进展，２０１４，２６（１）：１７８ １９２四１８５一四

２则列出水在中红外区域的吸收峰二吸收系数以及为获得最佳信噪比时所需控制的最佳光程长度［３６］三

水在１６５０ｃｍ－１处的吸收在水层厚度大于１５μｍ的时候达到饱和；而在３２００ ３６００ｃｍ－１的吸收，水层

厚度只要大于２μｍ即达到饱和三因此在测试中，必须严格控制水层的厚度以确保在需要研究的波数区间范围内有足够的光通量照射到细胞上三特别是水在１６５０ｃｍ－１处的吸收与蛋白质酰胺Ⅰ的吸收重合，因此更加需要严格控制样品的厚度三一般来说，８ １０μｍ被认为是最大可接受的样品厚度，而当需要获得质量更高的图谱时，样品的厚度最好控制在

３ ４μｍ三此外，水的浓度在细胞内外不一致，还会在Ｈ２Ｏ反对称和对称伸缩振动以及弯曲振动附近引起峰形的扭曲，

因此有时还需要对酰胺Ⅰ谱带进行校正

［３７，３８］

三

图４一氘代水二水以及干细胞样品的红外光谱（为了便于对照，图谱进行了归一化处理）［１５］

Ｆｉｇ．４一ＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｏｆＨ２ＯａｎｄＤ２Ｏｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈａｔｙｐｉｃａｌｃｅｌｌｓｐｅｃｔｒｕｍ．Ｔｈｅｓｐｅｃｔｒａｈａｖｅｂｅｅｎｒｅｓｃａｌｅｄａｎｄａｎｏｆｆｓｅｔｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｆｏｒｃｌａｒｉｔｙ．

Ａｃｃｕｒａｔｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ

ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｆｏｒＨ２ＯａｎｄＤ２ＯａｒｅｓｈｏｗｎｉｎＴａｂｌｅ２．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｔｒａｃｅｓｓｈｏｗｓｃｌｅａｒｌｙｔｈａｔｔｈｅｂｅｎｄｉｎｇｍｏｄｅｏｆｗａｔｅｒ（Ｈ２Ｏｂ）ａｒｏｕｎｄ１６５０ｃｍ－１

ｏｖｅｒｌａｐｓｗｉｔｈｔｈｅ

ａｍｉｄｅⅠａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｉｎｔｈｅｓａｍｅ

ｓｐｅｃｔｒａｌｒｅｇｉｏｎ

［１５］

目前，控制细胞厚度最有效的方式是ＡＴＲ红外成像系统三由于细胞粘附在ＡＴＲ晶体上，同时ＡＴＲ红外成像模式只检测样品表面，所以无需考虑细胞的厚度［２５］三但是由于上述ＡＴＲ细胞成像的缺点，所以该方法并未受到广泛的关注三

另外一种方法是采用时间分辨红外光谱对细胞

进行动态成像［２８，３９，４０］三由于在不同的时间点进行红外成像所采集的都是针对细胞同一位置的红外光谱，因此第一个时间点所采集的光谱可作为参考光

谱，然后采用差谱的分析方法来扣除水分对图谱造成的影响三

还有一种较为通用的方法是使用氘代水（Ｄ２Ｏ）

代替水作为介质或营养液成分［１５］三该方法早已被广泛地应用于蛋白质水溶液的红外光谱测试中［４１ ４３］三从图４和表２可知，Ｄ２Ｏ的吸收主要在

２５００ｃｍ－１，对应于Ｄ２Ｏ的反对称和对称伸缩振动，而在该区间并没有生物样品的红外吸收三此外，Ｄ２Ｏ在１２００ｃｍ－１还存在一个较弱吸收，对应其弯曲振动三虽然在此峰位生物样品也有吸收，但是可以发现Ｄ２Ｏ的红外吸收避开了蛋白质最主要的酰胺Ⅰ吸收谱带，因此有利于对细胞中的蛋白质进行分析三但是使用Ｄ２Ｏ的缺点在于其与水结构的差异，细胞在Ｄ２Ｏ溶液中的存活能力并不能得到保证［４４］三

表２一水和氘代水的振动光谱数据汇总［３６］

Ｔａｂｌｅ２一ＶｉｂｒａｔｉｏｎａｌｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃｄａｔａｏｆＨ２ＯａｎｄＤ２Ｏ［３６］

Ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌｍｏｄｅ

ω０／ｃｍ－１

ε０／Ｍ－１

ｃｍ

－１

Ａ１０μｍ／ａ．ｕ．

ｌｏｐｔ／μｍ

Ｈ２Ｏｓ，Ｈ２Ｏｖｓ３４０４ ０

９９ ９?０ ８

５ ５３０ ８Ｈ２Ｏｂ１６４３ ５２１ ８?０ ３３ ６３ ６Ｈ２Ｏｂ＋η２１２７ ５３ ５０?０ １０ １９４２２ ４Ｄ２Ｏｓ，Ｄ２Ｏｖｓ

２５０４ ０７１ ５?０ ４３ ９４１ １Ｄ２Ｏｂ１２０９ ４１７ ４?０ ２０ ９６２４ ５Ｄ２Ｏｂ＋η１５５５ ０

１ ９０?０ ０５

０ １０５

４１ ２

ω０：ｐｅａｋｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｗａｖｅｎｕｍｂｅｒ；ε０：ｍｏｌａｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ；Ａ１０μｍ：ａｂｓｏｒｂａｎｃｅｆｏｒａ１０μｍｐａｔｈｌｅｎｇｔｈ；ｌｏｐｔ：ｏｐｔｉｍａｌｐａｔｈｌｅｎｇｔｈ，ａｔｗｈｉｃｈｔｈｅＳ／Ｎｒａｔｉｏｉｓｍａｘｉｍｉｚｅｄ．νＳ：ｓｙｍｍｅｔｒｉｃｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇｍｏｄｅ；ｓ：ａｎｔｉｓｙｍｍｅｔｒｉｃｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇｍｏｄｅ；ｂ：ｂｅｎｄｉｎｇｍｏｄｅ；ｂ＋ηｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｂｅｎｄｉｎｇａｎｄｌｉｂｒａｔｉｏｎｍｏｄｅ．

５ ２一窗片材料对测试的影响

除了水会对细胞的红外图谱产生影响，细胞培

养基板的选择也会对其生长和红外图谱产生影响三在细胞红外光谱成像中，培养细胞的基板一般应满足以下几点要求：（１）基板在感兴趣的中红外波数范围内没有吸收（即中红外透明），所以只能选择红

外透明材料；（２）基板应没有细胞毒性且能保证细胞容易粘附；（３）基板应不吸湿二不溶于水三

Ｐｅｔｉｂｏｉｓ等［４５］详细地研究了不同种类的红外透

明材料对细胞红外光谱测试的影响，结果如表３所示三实验室较为常用的盐片，如ＮａＣｌ二ＫＣｌ二ＫＢｒ和ＣｓＩ都会吸湿或溶于水，所以不能作为培养细胞的基板；而ＺｎＳｅ二ＺｎＳ二ＣａＦ２二ＢａＦ２和金刚石（ｄｉａｍｏｎｄ）则因为具有一定的细胞毒性或细胞不容易粘附也不能作为理想的细胞培养基板三剩下的只有Ｓｉ?Ｏ二Ｓｉ３Ｎ４二Ｓｉ?ＦＩ二Ｇｅ和石墨符合以上三点要求，但是

四１８６一四

ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４，２６（１）：１７８ １９２

一一

一表３一红外透明材料细胞毒性以及粘附性实验结果汇总［４５］Ｔａｂｌｅ３一ＭａｉｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｔｈｅＩＲｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｔｅｓｔｅｄｆｏｒｔｈｅ１８?ｈｏｕｒｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ［４５］

ＮａＣｌ

ＫＣｌ

ＫＢｒ

ＣｓＩ

ＺｎＳｅ

ＺｎＳ

ＣａＦ２

ＢａＦ２

Ｄ

Ｓｉ?ＦＩ

Ｓｉ?Ｏ

Ｓｉ３Ｎ４

Ｇｅ

Ｃ

ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ（ｍｍ）２２２２２２２２１０ ５０ ４５０ ０００５１０ ５ＩＲｌｏｗｆｒｅｑｕｅｎｃｙｃｕｔｏｆｆ（ｃｍ－１）６８０５２０４９０２００６００７５０１１００９００１００７５０７２０７２０６００１００ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃ

＋

＋

＋

＋

－

－

－

－

－

－－－－

－

ｅｎｅｒｇｙｌｏｓｓ（％）５％５％７％１７％１５％３％３％７％３１％３０％

１３％

３６％１７％ｂｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ

（％ｄｅａｄｃｅｌｌｓ）１９?６２３?８１５?１４２１?１１１?１４?２

３?１

６?４２?２４?２

ａｄｈｅｓｉｏｎ（ｃｅｌｌ／ｍｍ２）１１?９

９?８１４?１１７?５６５?２４１０８?３４１５７?３９１６４?４４１０７?３７１２１?４８ｒｅｍａｒｋ

ＦＦＦＦ／Ｔ

Ｆ／Ｔ

Ｔ

Ｆ／Ｔ

Ｆ

Ｆ

Ｏ

Ｆ

Ｏ

Ｏ

Ｃ＝ｃａｒｂｏｎｇｒａｐｈｉｔｅ；Ｄ＝ｄｉａｍｏｎｄ；Ｆ＝ｆｒａｇｉｌｅ（ｋｎｏｏｐ＜２００）；Ｏ＝ｏｐａｑｕｅ，ｄａｒｋｔｏｖｉｓｉｂｌｅｌｉｇｈｔ（ｏｎｌｙｒｅｆｌｅｃｔｅｄｌｉｇｈｔｉｓｖｉｓｉｂｌｅ）；Ｔ＝ｔｏｘｉｃ（ｉｆｃｅｌｌｄｅａｔｈ＞１０％ｔｏｔａｌｃｅｌｌｓ）．Ｖａｌｕａｂｌｅａｄｈｅｓｉｏｎｌｅｖｅｌｗａｓｓｅｔａｔ?１００ｃｅｌｌｓ四ｍｍ－２，０＝ｎｏｃｅｌｌ．ＨｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄｖａｌｕｅｓｓｈｏｗｕｎｓｕｉｔａｂｌｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｐａｒａｍｅｔｅｒｓｆｏｒｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇｏｆｃｅｌｌｓ．

Ｓｉ３Ｎ４和Ｓｉ?ＦＩ易碎，石墨对可见光不透明，因此综合各种因素Ｇｅ晶体是最理想的细胞培养基板三

５ ３一细胞形态对测试的影响

除了测试条件会对细胞红外光谱成像产生影响

外，细胞自身形态也是影响成像结果的关键因素三细胞的尺寸一般在５ ５０μｍ，与红外波长相当［２０，４６］，因此红外光通过细胞时会产生明显的散射，所采集的图谱既包含了样品结构信息，也包含了红外光的散射，

特别是Ｍｉｅ散射会导致图谱产生一条正弦振荡的基线，从而导致图谱峰位和吸收强度失真［４７ ５１］三为解决这个问题，图像分析前需要先对图谱进行Ｍｉｅ散射校正，如图５所示三比较原始光谱和Ｍｉｅ校正后的细胞单谱可以发现，Ｍｉｅ校正后光谱正弦振荡的基线被扣除，图谱的吸收强度明显提高，

相应特征吸收峰的成像图也显示其校正后的空间分辨率明显提高，更能准确地反应样品的结构信息三

图５一老鼠胚胎干细胞的光学和同步辐射红外成像图像三上部的图像由直接从样品收集的原始数据获得，下部的图像则由相同原始数据通过Ｍｉｅ散射校正后获得三相关红外光谱显示Ｍｉｅ校正前后的情况，表明在原始光谱中这一假象产生的影响［４７，４８］

Ｆｉｇ．５一ＶｉｓｉｂｌｅｉｍａｇｅａｎｄｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｍａｇｅｓｏｆａｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ．Ｔｈｅｔｏｐｉｍａｇｅｓａｒｅｐｒｏｃｅｓｓｅｄｆｒｏｍｔｈｅｒａｗｄａｔａｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｏｒｔｈｅｓａｍｐｌｅ；ｔｈｅｂｏｔｔｏｍｉｍａｇｅｓａｒｅｐｒｏｃｅｓｓｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓａｍｅｄａｔａａｆｔｅｒｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎｆｏｒＭｉｅｓｃａｔｔｅｒ．Ｓｐｅｃｔｒａｆｒｏｍａｐｉｘｅｌｗｉｔｈｉｎｔｈｅｓｔｅｍｃｅｌｌ，ｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ，ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｔｈｅｉｍｐａｃｔｏｆｔｈｉｓａｒｔｉｆａｃｔｉｎｔｈｅｒａｗ

ｄａｔａ［４７，４８］

一一另外，圆形细胞的Ｍｉｅ散射的强度比扁平细胞

的Ｍｉｅ散射强度更强，这种现象被称为共振Ｍｉｅ散射［５０ ５２］三在这种情况下，图谱的频率和强度都会受到影响，因此在这种情况下所获得的图谱不适合对细胞的生物化学性质进行评价三最近Ｂａｓｓａｎ等发展了一套完整的共振Ｍｉｅ散射校正算法［５０ ５２］，并已

成功地应用于校正同步辐射红外光谱采集的单细胞红外光谱，因此将细胞红外光谱的原始数据根据此算法进行校正后再进行图谱成像可以获得比较准确的信息三

细胞形态对于红外光谱成像影响的另一个方面则表现在细胞器的尺寸上三真核细胞中各细胞器如

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四１８７一四

图６一传统红外光源与同步辐射红外光源焦平面阵列探测器的光强以及分布比较［７］

Ｆｉｇ．６一ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｒａｗｉｎｇｏｆｔｈｅｒｍａｌａｎｄｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＩＲｓｏｕｒｃｅｓａｌｉｇｎｍｅｎｔｆｅａｔｕｒｅｓｏｎａＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇｓｙｓｔｅｍｅｑｕｉｐｐｅｄｗｉｔｈａＦＰＡｄｅｔｅｃｔｏｒ．Ａｈｉｇｈｅｒｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｌｅｖｅｌ（３６?ｖｅｒｓｕｓ１５?）ｉｎｄｕｃｅｓａｌｏｓｓｉｎｄｅｔｅｃｔｏｒｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎｂｙｏｎｅｏｒｄｅｒｏｆｍａｇｎｉｔｕｄｅｗｈａｔｅｖｅｒｔｈｅｓｏｕｒｃｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ，

ｂｕｔｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎｃｏｖｅｒｓｍｕｃｈｍｏｒｅｏｆｔｈｅｄｅｔｅｃｔｏｒｆｏｒｉｔｓｂｒｉｇｈｔｅｓｔｐａｒｔ，ｔｈｕｓｅｎｈａｎｃｉｎｇｔｈｅＳＮＲ［７］

细胞核（１ ３μｍ）二线粒体（约１μｍ）二核糖体（＜１

μｍ）的尺寸都小于红外光谱显微成像（包括同步辐射红外光谱）的极限空间分辨率，所以长久以来红外光谱成像并不能真正实现亚细胞的空间分辨

率［７］，于是红外谱学专家们通过寻求各种方式期望提高其空间分辨率三就目前进展而言，在这方面的研究中最为成功的方式是将同步辐射红外光谱与焦

平面阵列（ｆｏｃａｌｐｌａｎｅａｒｒａｙ，ＦＰＡ）探测器结合三意大利ＤＡＦＮＥ实验室［７］尝试将单束同步辐射光与ＦＰＡ探测器结合，并将同步辐射红外光谱成像系统的空间分辨率提高至２ ６?２ ６μｍ三但是由于同步辐射红外光源的发散角较小（约为１００μｍ），红外光斑不能涵盖所有的ＦＰＡ像素点，ＦＰＡ像素阵列中间区域的红外光强度远远高于周围红外光强，由此导致外围像素点图谱的性噪比较差，限制了其应用三

美国威斯康辛大学同步辐射中心ＩＲＥＮＩ线站［５３］采用多束同步辐射红外光与ＦＰＡ探测器结合，开创了同步辐射红外光谱宽场探测成像技术（图７ａ）三由于结合了多束的同步辐射红外光，其光斑在ＦＰＡ探测器的分布均匀性明显提高，且红外光的强度相对于单束同步辐射红外光源也有了很大的提高（图７ｂ）三所以，该技术成功地将红外光谱成像的空间分辨率提高了两个数量级，达到０ ５４?０ ５４μｍ，同时还大大缩短了成像时间三从使用该技术获得的细胞红外光谱成像图（图７ｃ）可以看出，其空间

分辨率较传统ＦＰＡ成像系统有明显的提高，真正达到了亚细胞级别［５４，５５］三但该技术的光路设计十分复杂，相应的改造成本也很高，因此在其他同步辐射红外实验线站的推广受到限制三最近，美国ＮＳＬＳ［５６］采用更为简单的光路设计（图８ａ）对其Ｕ１０红外线站进行了改造，实现了多束同步辐射光与ＦＰＡ成像系统结合的全场红外成像，在３６?３６像素的范围内实现了同步辐射红外光源的均匀照射（图

８ｂ）三该技术设计精巧二改造成本低，必将为其他同步辐射红外实验线站的改造提供宝贵的经验三可以预见在不久的将来，随着多束同步辐射红外光与ＦＰＡ成像系统技术的应用二

推广和完善，研究者将可以在亚细胞层次对细胞的结构和生理过程进行更加深入的研究三

图７一同步辐射红外光谱宽场探测成像技术：（ａ）实验装置示意图［５３］；（ｂ）多束同步辐射光源与ＦＰＡ探测器联用的光强分布［５３］；（ｃ）同步辐射红外光谱宽场探测成像对ＴｇＣＲＮＤ８小鼠血小板的研究［５４，５５］

Ｆｉｇ．７一ＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇｗｉｔｈａｍｕｌｔｉｂｅａｍｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎｓｏｕｒｃｅ．

（ａ）Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｅｔｕｐ．Ｍ１?Ｍ４ａｒｅｍｉｒｒｏｒｓｅｔｓ；［５３］（ｂ）Ａｆｕｌｌ１２８?１２８ｐｉｘｅｌＦＰＡｉｍａｇｅｗｉｔｈ１２ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｂｅａｍｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｎｇａｎａｒｅａｏｆ５０μｍ?５０μｍ（ｓｃａｌｅｂａｒ，４０μｍ）；［５３］（ｃ）ＳｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＦＴＩＲｉｍａｇｅｓｏｆｌｉｐｉｄｅｎｖｅｌｏｐｅｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇａｍｙｌｏｉｄｐｌａｑｕｅｆｒｏｍＴｇＣＲＮＤ８

ｍｉｃｅ：ｃｅｎｔｅｒｓｈｏｗｓｗｈｉｔｅｌｉｇｈｔｐｈｏｔｏｏｆｄｅｎｓｅｃｏｒｅｐｌａｑｕｅ；ｌｅｆｔｓｈｏｗｓｍａｐｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｓｉｎｇｌｅｐｏｉｎｔ，ｒａｓｔｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ａｎｄｓｔａｎｄａｒｄ２０μｍ?２０μｍｐｉｘｅｌ；ｒｉｇｈｔｓｈｏｗｓｓｐｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｍａｇｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｍｕｌｔｉｂｅａｍｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ

ＦＴＩＲｉｍａｇｉｎｇ［５４，５５］

６一细胞同步辐射红外光谱成像应用举例

自１９９８年Ｊａｍｉｎ等［４］最早报道使用同步辐射红外光谱成像技术来研究细胞以来，经过十多年的

四１８８一四

ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，

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图８一（ａ）多束同步辐射红外光源成像实验线站示意图；（ｂ）多束同步辐射红外光源在ＦＰＡ探测器的照射面积［５６］

Ｆｉｇ．８一（ａ）ＳｃｈｅｍａｔｉｃｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉｂｅａｍｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＩＲｉｍａｇｉｎｇｂｅａｍｌｉｎｅ．Ｔｈｅｂｅｎｄｉｎｇｍａｇｎｅｔｒａｄｉａｔｉｏｎ（８５?４０ｍｒａｄ）ｉｓｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｔｈｅｓｏｕｒｃｅｉｓｒｅｉｍａｇｅｄｂｙｍｅａｎｓｏｆｔｈｅｅｌｌｉｐｔｉｃａｌＭ２ｍｉｒｒｏｒ．Ｔｈｅｄｉｖｅｒｇｉｎｇｆａｎｏｆｌｉｇｈｔｉｓｓｐｌｉｔｉｎｔｏｆｏｕｒｎｅａｒｌｙｃｏｌｌｉｍａｔｅｄｂｅａｍｌｅｔｓ，ｗｈｉｃｈａｒｅｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄａｔｔｈｅｓａｍｐｌｅｐｏｓｉｔｉｏｎ．（ｂ）Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄａｒｅａｏｆｔｈｅ１２８?１２８ｐｉｘｅｌＦＰＡｄｅｔｅｃｔｏｒ（ｌｅｆｔ）ａｎｄｔｈｅｅｎｌａｒｇｅｄＦＰＡａｒｅａｏｆ３６?３６ｐｉｘｅｌｓ（ｒｉｇｈｔ），ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｔｏｔｈｅｓａｍｐｌｅａｒｅａ

ｏｆ

２０

?

２０

μｍ，

ｓｈｏｗｉｎｇ

ｎｅａｒｌｙ

ｕｎｉｆｏｒｍ

ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ［５６］

发展，同步辐射红外光谱成像技术已经对不同种类的细胞，如细菌［２８，４０，５７，５８］二海藻

［４７，５９］

二成纤维细

胞

［６０］

二神经细胞［６１，６２］

二正常干细胞

［４７，６３］

二癌细

胞［６４ ６６］等进行了研究三其研究目的大致包括：（１）

研究细胞的表型；（２）对静态细胞的物质组成进行表征；（３）研究细胞中分子的结构或取向；（４）对细胞生理活动进行动态监测三下面举两个最具代表性的例子三

６ １一同步辐射红外光谱对ＰＣ１２神经细胞蛋白质磷酸化的研究

蛋白质磷酸化（ｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）是生物体内一种常见的调节方式，在细胞信号传导过程中起着重要作用，并与细胞的增值和分化密切相关［６７］三目前研究细胞内蛋白质磷酸化过程常用的方法是使用荧光标记物，而同步辐射红外光谱技术则可以在无生物标记的情况下监测细胞分子的结构变化三Ｃｈｅｎ等［６２］采用同步辐射红外显微光谱监测了ＰＣ１２细胞分化过程中蛋白质的磷酸化过程（图９）三他们发现细胞分化后，其红外光谱在１０８０ｃｍ－１和９９０ ９７０ｃｍ－１处的吸收比分化前明显加强（图９ｂ），且这两处吸收峰的强度是随着分化的进行逐

渐增加的（图９ｃ），所以作者认为这两个吸收峰可以作为ＰＣ１２细胞分化过程中蛋白质磷酸化的光谱标记（ｓｐｅｃｔｒａｌｍａｒｋｅｒｓ）三接着作者采用同步辐射红外成像和荧光标记的方法对该光谱标记的可靠性进行了验证，如图８ｄ所示三实验中采用ＴｒｋＡ?ＥＧＦＰ融合质粒对ＰＣ１２细胞进行转染，ＴｒｋＡ的过度表达一方面会使受体发生自身磷酸化，另一方面则使细胞蛋白质激酶（在ＰＣ１２细胞中主要是Ｅｒｋ１和ＰＩ?３激酶）保持持续的活性三为检测ＰＣ１２细胞能否保持持续的蛋白质激酶活性，实验中采用共表达的增强型荧光蛋白（ＥＧＦＰ）作为荧光标记三作者首先对２２９４ｃｍ－１（脂质的特征吸收）和１５５０ｃｍ－１（蛋白质

的特征吸收）谱带进行积分成像，以确定细胞位置，然后再分别使用１０８０ｃｍ－１和９９０ ９７０ｃｍ－１谱带进行积分成像，结果表明在其相应的成像图中可以在细胞区域中清晰显示两个亮斑，且位置与荧光照片中绿色斑点位置几乎完全致，从而验证了

１０８０ｃｍ－１和９８０ｃｍ－１处的吸收峰可以用来作为细胞蛋白质磷酸化的光谱标记三因此，该研究可以说是建立了一种研究细胞内蛋白质磷酸化的新方法三６ ２一同步辐射红外光谱实时监测生物膜中细菌的

生长和发育

生物膜（ｂｉｏｆｉｌｍｓ），即由微生物细胞自身产生的

胞外多聚物基质（主要是多糖）所包围形成并附着在浸有液体的惰性或生物表面的，具有结构的群落［６８］三生物膜的形成二生物膜的耐药性以及生物膜对宿主免疫系统的攻击往往会导致人体慢性细菌感

染三同时，生物膜的上述过程会受到流体动力学二营养液供应和废料排除等因素的影响三因此实时监测生物膜的形成二生长以及生物膜与药物作用过程，对我们了解和治疗细菌感染有非常大的帮助［６９］三

Ｈｏｌｍａｎ等［２８］采用时间分辨红外光谱成像方法研究了细菌在明渠微流体装置（ｏｐｅｎ?ｃｈａｎｎｅｌ

ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）表面的生长和发育状况三作者比较了在微流体和微孔板（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓ）中生物膜的形成过程三微流体装置与微孔板相比具有更高的营养液供应速度和更高的废产物排除速率三生物膜在微流体装置中不同生长时间段的的红外光谱如图１０ａ所示三作者在１０００ １８００ｃｍ－１波数范围内选取了４个红外吸收峰，即１０８０ｃｍ－１（多糖）二１１３０ｃｍ－１（多糖?蛋白质复合物）二１２４０ｃｍ－１（ＤＮＡ／ＲＮＡ）和

１３１０ｃｍ－１（蛋白质酰胺Ⅲ）作为相应物质的光谱标记，然后采用差谱的手段对生物膜的形成过程进行了研究三

比较图１０ｂ和图１０ｃ可以发现，在两种基板上

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图９一同步辐射红外光谱对ＰＣ１２细胞中蛋白质磷酸化的研究三（ａ）ＰＣ１２细胞在神经分化过程中蛋白质磷酸化的示意图；（ｂ）ＰＣ１２细胞在神经分化前后的红外光谱；（ｃ）神经生长因子处理ＰＣ１２细胞１ｈ内不同时间点采集的红外光谱（左，插图为１１５０ ９００ｃｍ－１区域的放大图），以及神经生长因子处理ＰＣ１２细胞７天内不同时间点采集的红外光谱（右）；（ｄ）同步辐射红外光谱成像结果与荧光照片结果对比，证明１０８０ｃｍ－１和９９０ ９７０ｃｍ－１附近的红外吸收可以作为蛋白质磷酸化的光谱标记［６２］

Ｆｉｇ．９一ＳｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＦＴＩＲｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｉｎｌｉｖｉｎｇｓｉｎｇｌｅＰＣ１２ｃｅｌｌｓｄｕｒｉｎｇｎｅｕｒｏｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．（ａ）Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｎｅｕｒｏｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；（ｂ）ＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒａｏｆＰＣ１２ｃｅｌｌｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｎｏｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；（ｃ）ＴｈｅｍｅａｎＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒａｏｆｃｈａｎｇｅｓｏｆＰＣ１２ｃｅｌｌｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｆｉｒｓｔｈｏｕｒｏｆＮＧＦｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｌｅｆｔ，ａｖｅｒａｇｅｄｏｖｅｒ１５０ｃｅｌｌｓ，ｉｎｓｅｔ：ｅｎｌａｒｇｅｄｓｐｅｃｔｒｕｍｉｎｔｈｅ１１５０ ９００ｃｍ－１ｒｅｇｉｏｎ）ａｎｄｔｈｅｍｅａｎＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒａｏｆｃｅｌｌｓｃｈａｎｇｅｓｄｕｒｉｎｇａ７?ｄａｙＮＧＦｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ｒｉｇｈｔ）；（ｄ）ＩｎｓｉｔｕｂｉｍｏｄａｌｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｉｎＰＣ１２ｃｅｌｌｃｌｕｓｔｅｒｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ

ｗｉｔｈＴｒｋＡ?ＥＧＦＰｆｕｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ．ＴｈｅｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄｉｍａｇｅａｎｄｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｅｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｓａｍｅｃｌｕｓｔｅｒｏｆＴｒｋＡ?

ＥＧＦＰｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄＰＣ１２ｃｅｌｌｓａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ．Ｔｈｅｉｎｆｒａｒｅｄｉｍａｇｅｓａｒｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｍａｐｓｆｏｒｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｉｎｆｒａｒｅｄｂａｎｄｓａｓａｎｎｏｔａｔｅｄｉｎｔｈｅｆｉｇｕｒｅ．Ｔｈｅ ２９１４ｃｍ－１ｂａｎｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｌｉｐｉｄｓ，ａｎｄｔｈｅ １５５０ｃｍ－１ｂａｎｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅｂａｎｄｓｂｅｔｗｅｅｎ９９０ａｎｄ９７０ｃｍ－１ａｒｅｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｔｏｇｅｔｈｅｒ．Ｔｈｅｌａｒｇｅｒｅｄｓｑｕａｒｅｓｍａｒｋｔｈｅｒｅｇｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｅｓｔ．Ｔｈｅｗｈｉｔｅａｒｒｏｗｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｌｏｃａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｃｅｌｌｓ（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｐｏｔｓ）ａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｓｐｏｔｓｉｎｔｈｅｉｎｆｒａｒｅｄｍａｐ．Ｔｈｅｂｒｉｇｈｔｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｐｏｔａｔｔｈｅｌｏｗｅｒｅｄｇｅｄｏｅｓｎｏｔｒｅｇｉｓｔｅｒｉｎａｎｙｏｆｔｈｅｆｏｕｒｉｎｆｒａｒｅｄｉｍａｇｅｓ．Ｉｔｍａｙｃｏｍｅｆｒｏｍｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ

ｏｆｎｅｃｒｏｔｉｃｃｅｌｌｓ［６２］

生物膜的形成过程具有明显的差异三对于微流体基板（图１０ｂ上），４个吸收峰的吸收强度都逐渐增加，这表明生物膜是通过多重收敛的遗传途径（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔｇｅｎｅｔｉｃｐａｔｈｗａｙｓ）形成的［６９］三微流体通道中存在大量的多糖以及大面积的生物膜（图１０ｂ下）也证明多糖在细菌形成生物膜过程中起着关键作用三与之相反，生物膜在微孔板中则是按照循环增长模式生长（图１０ｃ上），随着时间的推移，４个吸收峰的强度呈现波浪式起伏，按照先增加后减小，然后再增加再减小的模式进行三从１１３０ｃｍ－１的成像图（图１０ｃ下）可以看出微孔中基本没有多糖的吸收峰，表明在微孔中并未形成大量的生物膜，这可能是因为细菌与微孔壁的粘附能力较弱，从而影响了生物膜的形成三最近有研究发现一些细菌可以产生一种Ｄ?氨基酸的混合物，该物质可以阻止生物膜的形成，并可破坏已经形成的生物膜［７０］三同时本课题组也发现丝蛋白?银纳米颗粒形成的复合物对由抗

甲氧西林的金黄色葡萄糖球菌形成的细菌膜有很强的破坏作用［７１］，因此笔者认为，采用同步辐射红外光谱成像技术来研究这些物质对细菌膜的破坏过程

将是一个很好的选择三

７一展望

同步辐射红外光谱技术经过三十多年的发展，

已经在多学科门类中广泛使用［６，１１］，特别是在生物医学领域，同步辐射红外光谱技术可以原位探测细胞（亚细胞）级别的生物化学变化，并保留细胞的生命特征三通过对蛋白质二核酸二磷脂等成分的定性和定量分析，可以了解细菌二骨细胞二神经细胞以及癌细胞等的活动情况［６］三虽然同步辐射红外光谱成像在细胞研究中仍存在一些问题，但经过十多年的发展，其相关实验技术已经取得了长足的进步，并获得了一系列的研究成果三随着新型同步辐射红外光谱成像技术的发展，可以预见在不久的将来同步辐

四１９０一四

ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，

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图１０一同步辐射红外光谱实时监测细菌生长和发育（ａ）在微流体通道中不同时间点的大肠杆菌生物膜的红外光谱；（ｂ）在微流体通道中和（ｃ）在微孔板中，生物膜红外光谱中 １０８０ｃｍ－１（多糖）， １１３０ｃｍ－１（多糖?蛋白质复合物）， １２４０ｃｍ－１（ＤＮＡ／ＲＮＡ多糖），以及 １３１０ｃｍ－１（蛋白质酰胺Ⅲ）吸收峰随时间变化的差谱（顶图）以及相应特征吸收峰的化学成像图（底图）［２８］

Ｆｉｇ．１０一Ｒｅａｌ?ｔｉｍｅｃｈｅｍｉｃａｌｉｍａｇｉｎｇｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｂｉｏｆｉｌｍｓｕｓｉｎｇｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．（ａ）Ｓｎａｐｓｈｏｔｓｏｆ

ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｅｄｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒａｏｆＥ．ｃｏｌｉｂｉｏｆｉｌｍｉｎａｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｆｏｒｓｅｌｅｃｔｅｄｔｉｍｅｐｏｉｎｔｓ．Ｔｈｅｙｗｅｒｅｖｅｃｔｏｒ?ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｏｖｅｒｔｈｅ９００ １７８０ｃｍ－１ｒｅｇｉｏｎａｎｄｏｆｆｓｅｔｃｏｒｒｅｃｔｅｄ；ＳｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＦＴＩＲｔｉｍｅｃｏｕｒｓｅａｎａｌｙｓｅｓａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｉｍａｇｅｓｏｆｂｉｏｆｉｌｍｓｉｎａｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ（ｂ）ａｎｄｉｎａｍｉｃｒｏｗｅｌｌ（ｃ）ａｓｓｈｏｗｎｂｙｆｏｕｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓａｔ １０８０ｃｍ－１（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）， １１３０ｃｍ－１

（ｇｌｙｃｏｃａｌｙｘ）， １２４０ｃｍ－１（ＤＮＡ／ＲＮＡｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ），ａｎｄ １３１０ｃｍ－１（ｐｒｏｔｅｉｎａｍｉｄｅⅢ）．Ｕｎｌｉｋｅｔｈｅｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｄａｔａ，ｉｎｗｈｉｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆｋｅｙｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓａｐｐｅａｒｅｄｔｏａｐｐｒｏａｃｈａｎａｓｙｍｐｔｏｔｉｃｓｔａｔｅ，ｔｈｅｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎＦＴＩＲｄａｔａｗｅｒｅｃｙｃｌｉｃ（ｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｒｅｌｅａｓｅ）．ＴｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｉｍａｇｅｐｌｏｔｓｏｂｔａｉｎｅｄａｆｔｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｃｙｃｌｅｓｈｏｗｌｏｃａｌｌｙｈｉｇｈｅｒｓｉｇｎａｌｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｍｉｄｅⅢａｎｄＤＮＡ／ＲＮＡｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｎｅａｒｔｈｅｍｉｃｒｏｗｅｌｌｃｅｎｔｅｒ，ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍａｔｒｉｘａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄｎｅａｒｔｈｅｍｉｃｒｏｗｅｌｌｅｄｇｅ．Ｔｈｅｒｅｉｓｌｉｔｔｌｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｇｌｙｃｏｃａｌｙｘｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇｓｔｒｏｎｇａｄｈｅｒｅｎｃｅｔｏｔｈｅｍｉｃｒｏｗｅｌｌｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｓｃａｌｅｂａｒｓ１０μｍ［２８］

射红外光谱对细胞的研究将更加深入三

自２００９年合肥国家同步辐射实验室红外谱学和显微成像实验站对用户开放以来，包括本课题组在内的我国研究人员在同步辐射红外光谱研究中也取得了一系列可喜的成果［７２ ７６］三在红外光谱成像研究方面，本课题组［７７］成功采用该技术对高分子共混膜的相容性进行了研究，证明该方法可以有效地判定共混体系是相容二部分相容还是不相容三田扬超等［７８］对胃癌ＢＧＣ８２３细胞进行的原位观察，发现细胞核与内质网（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，ＥＲ）的红外吸收存在显著差异，从而证明了红外光谱成像作为潜在的癌症诊断技术可以在亚细胞层次对单个胃癌细胞进行检测分析三但是到目前为止，相比于国

外，我国关于细胞的同步辐射红外光谱研究还显得较少，因此我国科研人员完全可以在该领域开展一系列的研究工作三此外，由于实验技术和数据分析方法的一致性，我们可以将同步辐射细胞红外光谱成像的研究方法拓展到其他研究领域三例如，本课题组在仿生制备高性能人工丝蛋白纤维方面获得了许多富有成效的研究成果［７９ ８２］，如果利用单细胞研究中通常使用的微流体装置，我们可以研究人工纺丝过程中丝蛋白的凝固机理，从而可以进一步优化纺丝条件三另一方面，天然丝特别是综合力学性能最为优异的蜘蛛丝的直径一般在２ ２０μｍ，因此当采用同步辐射红外采集直径较小的蜘蛛单丝时获得的红外光谱也存在明显的Ｍｉｅ散射，所以我们可以

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四１９１一四

借鉴单细胞研究中常用的数据校正技术，对蜘蛛单丝的红外光谱进行校正以获得更为精准的结构信息三

总之，随着合肥国家同步辐射实验室的改造升级，其光源的亮度和稳定性会得到进一步提高，这为我国在同步辐射红外领域的研究打下了坚实的基础，也可以确信我国在相关领域的研究会更上一个台阶三

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