植物细胞器的分离

植物细胞器的分离

一、叶绿体的分离：

1.实验原理：

采用差速离心法，利用不同颗粒的大小形状不同导致沉降速率不同，把叶绿体的颗粒沉降出来。

2.实验材料及试剂：

成熟的猪笼草、山梨醇、Tris、EDTA与β-巯基乙醇均为Amresco产品、细胞器分离缓冲液:300 mmol/L山梨醇, 50mmol/L Tris-HCl(pH为8.0), 5 mmol/L EDTA(pH 8.0), 0.1%β-巯基乙醇(临用前加入)。

3.实验器材：

SG350C多功能食品料理机(上海天航电器有限公司) , GL21M高速冷冻离心机及配套的2号角转头(湘仪集团)

山梨醇：配制体积：100 mL，浓度：3 mol/L；分子量：182.17g/mol

需要称取质量g:=100 mL*3 mol/L*182.17g/mol=0.1L*3

mol/L*182.17g/mol=54.651g

EDTA: 配置体积：100ml , 浓度：0.5mol/lL ,分子量：292.248g/mol

m= 0.5mol/L *100mL *292.248g/mol =14.6124 g

LEDTA : 配置体积:100ml 浓度：25mol/L ,分子量：292.248g/mol

m=2.5mol/L*100mL * 292.248g/mol=73.062g

4.制备方法

4.1叶绿体粗提物的制备

（1）. 取25 g叶片置于100 mL充分预冷的细胞器分离缓冲液中,用食品料理机匀浆2 min(5000r/min),

（2）. 然后将匀浆液用4层纱布过滤于500ml烧杯,

（3）. 滤液于4℃、700g在1000r/min离心10 min,

（4）.弃去细胞核沉淀上清液再于4℃、2 000 g在3000r/min离心10min,所得沉

淀即为叶绿体粗提物,

（5）.将此粗提物悬浮于7.5 mL细胞器分离缓冲液中备用。

4.2密度梯度离心制备完整叶绿体

（1）.用50 mL离心管制备蔗糖梯度,底部为18 mL含52%(质量分数)的蔗糖,50 mmol/L Tris-HCl(pH为8.8),25 mmol/L EDTA(pH为8.8)的混合液,

上面用7 mL含30%蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl(pH为8.0)、25 mmol/L EDTA(pH 为8.0)的混合液覆盖。

（2）. 将上述所得叶绿体粗提取物小心覆盖于30%的蔗糖上面,平衡后在4℃、20 kr/min离心30 min。

（3）.处于52%蔗糖与30%蔗糖界面上的绿色条带即为完整叶绿体。

（4）.用加样枪小心吸出绿色的条带。

5.叶绿体的显微鉴别：

叶肉细胞中的叶绿体，散布于细胞质基质中，呈绿色，扁平的椭球形或球形可以在高倍显微镜（400~600）下观察到它的形态和分布。

二、线粒体的分离

1.实验原理：

利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。

2.实验材料及试剂：

实验材料成熟的拟南芥，琼脂糖为杭州微生物试剂厂产品;牛血清蛋白(BSA)为上海试剂厂产品;DNase和RNase为上海生物工程技术服务有限公司产品;

溴化乙锭为SerVa公司产品;其余试剂均为国产分析纯.1×TAE电泳缓冲液(称取242 g Tris溶于适量蒸馏水中,加入57. 1 mL冰乙酸, 100 mL 0.5mol·L1EDTA,pH= 8. 0,用蒸馏水定容至1 L即为50×TAE转换为1 ×TAE稀50倍)缓冲液A:蔗糖0.

5 mol·L-1, Tris-Cl 50mmol·1,EDTA5mmol·L-1,BSA 0. 1%,PVP0. 5%, 0. 1%β-巯基乙醇,pH= 7. 5.缓冲液B:蔗糖0. 5 mol·L-1, Tris-Cl 50mmol·L-1, pH= 7. 5.缓冲液C:蔗糖0.

6 mol·L-1, Tris-Cl 10mmol·L-1,EDTA 20mmol·L-1, pH= 7. 2.缓冲液D: 0. 1 mol·L-1Tri-HCl(pH= 8. 0),0. 05 mol·L-1EDTA (pH= 8. 0), 0. 1mol·L1NaCl,10%SDS, 0. 01mol·L-1β-巯基乙醇.

EDTA：配置体积：100ml , 浓度: 0.5mol/L, 分子量：292.248g/mol

m= 0.5mol/L*100mL /*292.248g/mol =14.6124g.

蔗糖:配置体积：100ml , 浓度：0.5mol/L ,分子量:342.3g/mol

m= 0.5mol/L *100mL*342.3g/mol=17.115g.

LTris-Cl:配置体积:100ml , 浓度：0.5mol/L ,分子量:121.14g/mol

m= 0.5mol/L*100ml*121.14g/mol=6.057g.

蔗糖:配置体积：100ml ,浓度：0.5mol/l , 分子量:342.3g/mol

m=0.5mol/L*100mL*342.3g/mol=17.115g.

蔗糖: 配置体积：100ml , 浓度:0.6mol/L ,分子量:342.3g/mol

m= 0.6mol/L*100mL*342.3g/mol=20.538g.

Tris-Cl:配置体积：100ml, 浓度：0.1mol/L , 分子量:121.14g/mol

m= 0.1mol/L*100mL*121.14g/mol=1.2114g.

EDTA:配置体积:100ml ,浓度:0.2mol/l , 分子量：292.248g/mol

m= 0.2mol/L*100mL*292.248g/mol=5.845g.

NaCl : 配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L , 分子量:58.44g/mol

m= 0.1mol/L*100mL*58.44g/mol=0.5844g.

β-巯基乙醇: 配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L , 分子量：78.13g/mol

m= 0.1mol/L*100ml*78.13g/mol=0.7813g.

3.实验仪器:

超速冷冻离心机、制冰机、研钵(Υ= 15 cm)、无菌纱布、大离心管

(50mL)、水浴锅、微量离心管(1. 5 mL)、微量离心机(1. 5mL管)、-20℃冰箱、自动扩增仪、凝胶成像系统、紫外灯.

4.实验方法:

（1）.采集叶片30 g左右(采集前需暗培养24～28 h,以减少叶片组织所含糖类的污染);

(2).用蒸馏水洗涤2～3次,置研钵中(研钵提前预冷),加适量预冷缓冲液A和少量的石英砂在冰上研磨,直至缓冲液为深绿色;

(3).用6层无菌纱布过滤匀浆组织(并用缓冲液A漂洗纱布),然后将磨碎组织放回研钵中重新研磨并过滤, 2次滤液合并,补加缓冲液A至3～5mL·g-1试材,并将滤液分装于4个50mL无菌离心管中, 1 000 g离心10m in,收集上清液;

(4).将上清液2 000 g离心10m in,再收集上清液于20 000 g离心10m in得到粗线

粒体沉淀,在粗线粒体沉淀中加入每管10mL预冷的缓冲液B用软笔轻轻悬浮沉淀,注意应悬浮均匀后,将粗线粒体悬液1 000 g离心10min;

(5).收集上清液于同一50mL无菌离心管,加入300μL 1mol·L-1的MgCl2至终浓度0. 01mo·L-1,和5mg·mL-1的DNaseⅠ至终浓度20μg·mL-1,冰浴放置1. 5～2 h,在冰浴液中加入1. 5mL 0.5mol·L1的EDTA(pH=8.0)至终浓度20mmol·L-1; (6).将上述溶液小心铺于缓冲液C上(每管25mL C缓冲液), 18 000 g离心20 m in;收集沉淀重新悬浮于装20 mL预冷缓冲液C的离心管中,18 000 g离心10m in,

得到较纯的线粒体沉淀.以上操作均在0～4℃条件下进行.

5.显微鉴别:

线粒体在光学显微镜一般呈短棒状或圆球状，但必须借助健那绿(Janus green B)染液,使得线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态. 因此可以使活细胞中的线粒体呈现蓝绿色,而细胞质接近无色.线粒体能在健那绿染液中维持活性数小时,通过染色,可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布.配制质量分数为1%健那绿染液（将0.5g健那绿溶解于50mL生理盐水中,加温到30-40

摄氏度,使其充分溶解）.

三、细胞核的分离:

1.原生质体制备:

（1）.取生长3～4 d的拟南芥悬浮系细胞1 700 rpm离心3min.静置沉淀，（2）.用0.4 mol L甘露醇短暂洗涤后置于20mL酶解缓冲液(5mmol/LMES,6.8 mmol/LCaCl2, 11 mmol/LKH2PO4, 0.3mol/LMannitol, 0.3mol/Lsorbitol, 0.4%PVP-

甘露醇:配制体积：100ml , 浓度：0.4mol/l , 分子量:182.17g/mol

m= 0.4mol/L*100ml*182.17g/mol=7.2868g.

MES :配置体积：100ml , 浓度:0.5mol/L ,分子量:213.25g/mol

m= 0.5mol/L*100ml*213.25g/mol=10.6625g.

CaCl2 :配置体积:100ml ,浓度：0.68mol/L ,分子量：110.98g/mol

m= 0.68mol/L*100mL*110.98g/mol=7.54664g.

KH2PO4 :配置体积：100ml ,浓度：0.11mol/L ,分子量：136.09g/mol

m= 0.11mol/L*100mL*136.09g/mol=1.497g.

Mannitol甘露醇:配置体积：100ml , 浓度：0.3mol/L , 分子量:182.17g/mol

m= 0.3mol/L*100mL*182.17g/mol=5.4651g.

Sorbitol山梨糖醇:配制体积：100ml , 浓度：0.3mol/L ,分子量：182.17g/mol

m= 0.3mol/L*100ml*182.17g/mol=5.4651g.

PVP-K30 : m=(50g*0.4%)/(1-0.4%)=0.2008g.

(3).摇床设定70 rpm,28℃.三层纱布过滤一次,

(4).滤液经1 700 rpm离心3min,去上清，

(5).用洗涤缓冲液(5 mmol/LMES,0.2mol/Lsorbitol,0.2mol/LManmitol(pH5.7))洗涤

MES :配置体积：100ml ,浓度：0.5mol/L，分子量：213.25

m= 0.5mol/L*100mL*213.25g/mol=10.6625g.

sorbitol :配制体积：100ml ,浓度：0.2mol/L , 分子量：182.17g/mol

m= 0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g.

Manmitol:配置体积：100ml ,浓度：0.2mol/L ,分子量：182.17g/mol

m= 0.2mol/L*100mL*182.17g/mol=3.6434g.

2.细胞核与叶绿体的分离提纯

为保证提纯的细胞器中组分免受破坏,以下步骤均要在0～4℃下进行.

2.1细胞核与叶绿体的粗提

(1). 向原生质体中加入含有0.5%Triton X-100的CSK缓冲液(100 mmol/L KCl,3 mmol/LMgCl2,1mmol/LEGTA(pH8.0),10mmol/LPIPES(pH6.8),300mmol/Lsucrose, 1.2 mmol/L PMSF,20 mmol L DTT),振荡混匀后,静置7 min.溶去原生质体膜但保证细胞核和叶绿体的膜系统不被破坏.

(2).取120g离心10min,弃上清液.

(3).用CSK缓冲液重悬沉淀,

(4). 20μm孔径的滤膜过滤,

(5).取120g离心10 min,得到的沉淀为粗提的细胞核与叶绿体的混合物,

(6).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核与叶绿体的初步分离情况.

2.2细胞核与叶绿体的纯化

（1）. 把含有2.3mol L蔗糖的CSK缓冲液(100mmol LKCl, 3 mmol L MgCl2 ,1 mmol L EGTA(pH8.0), 10mmol LPIPES(pH6.8), 2.3 mol L sucrose, 1.2 mmol

KCl :配制体积：100ml ,浓度：0.1mol/L ,分子量：74.6g/mol

m= 0.1mol/L*100mL*74.6g/mol=0.746g.

MgCl2:配置体积：100ml ,浓度:0.3mol/L , 分子量：95.21g/mol

m= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.

EGTA :配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L , 分子量：380.35g/mol

m= 0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035g

PIPES:配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L ,分子量：302.40g/mol

m= 0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024g.

sucrose:配置体积：100ml ,浓度：2.3mol/L ,分子量：342.3g/mol

m= 2.3mol/L*100mL*342.3g/mol=78.729g.

PMSF:配置体积：100ml ,浓度：0.12mol/L , 分子量：174.19g/mol

m= 0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g.

DTT :配置体积：100ml ,浓度：0.2mol/L ,分子量：154.25g/mol

m= 0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g.

（2）.再把60%percoll CSK缓冲液(60%percoll, 100 mol L KCl, 3mmol L MgCl2, 1 mmol L EGTA(pH8.0), 10 mmol LPIPES(pH6.8), 300mmol Lsucrose, 1.2mmol

KCl:配置体积：10ml , 浓度：100mol/L ,分子量:74.6g/mol

m= 100mol/L*10mL*74.6g/mol=74.6g.

MgCl2:配置体积：100ml ,浓度：0.3mol/L ,分子量：95.21g/mol

m= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.

EGTA: 配置体积：100ml , 浓度:0.1mol/L ，分子量：380.35g/mol

m=cv/M=0.1mol/L*100mL*380.35g/mol=3.8035g.

PIPES:配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L 分子量：302.40g/mol

m= 0.1mol/L*100mL*302.40g/mol=3.024 g.

Sucrose:配置体积：100ml ,浓度：0.3mol/L ,分子量：342.3g/mol

m= 0.3mol/L*100mL*342.3g/mol=10.269 g.

PMSF：配置体积：100ml ,浓度：0.12mol/L ,分子量：174.19g/mol

m= 0.12mol/L*100mL*174.19g/mol=2.0903g.

DTT:配置体积：100ml,浓度：0.2mol/L 分子量：154.25g/mol

m= 0.2mol/L*100mL*154.25g/mol=3.085g.

(3).用移液枪加时要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一溶液之上.这时应该能观察到溶液明显的分层现象,

(4).然后把粗提细胞核与叶绿体的混合物用CSK缓冲液悬起并轻轻的平铺于上述两层的溶液顶部,

(5).最终形成三层溶液各居其层,

(6). 200 g离心32min.溶液梯度层重新分布,

(7).叶绿体沉于离心管底部,

(8).细胞核分布于2.3mol/L蔗糖的CSK缓冲液与60%percoll CSK缓冲液的交界处一薄层中,

(9).用移液枪小心吸出这一薄层,再加入2倍体积的CSK缓冲液,12000g离心

5min,沉淀即为纯化的细胞核,

(10).用改良碱性品红苯酚染色,镜检细胞核的纯化情况.并用1/400 mm2的血细胞计数板对从烟草悬浮细胞中提取的细胞核计数.

四、液泡的分离

1原生质体分离步骤

同细胞核的分离

2.酶液配制

酶的种类及配比根据酶解材料选择.

应用的酶主要有果胶酶Y-23(pectolyase Y-23)、

果胶酶R-10(离析酶macerozyme R-10)、

纤维素酶RS(celllase "ONOZUKA")、

纤维素酶R-10(cellulase "ONOZUKA"R-10)等.

3.取材

制备原生质体时要将冲洗过的组织，表面用70%的乙醇消毒30 s.有的研究者认为,将消毒后的组织剥去表皮并切成0. 5～2mm的小条块;对于难于剥去表皮的叶片,如禾本科的一些植物,可直接切成小条.适当的萎蔫有利于原生质体分离.

4.分离与纯化

1.将处理好的材料放入直径6cm的培养皿中.

2.每2g材料加入酶液10mL,在25～30℃酶解6～12 h.

3.每隔30m in镜检一次,直到有一定数量的原生质体释放出来为止.

4.将酶解好的混合液通过尼龙网或金属网过滤,一般40～100μm.

5.用含渗透剂浓度较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面,常用的渗透剂有（蔗糖、山梨醇或甘露醇）.

6.将从叶片酶解得来的原生质体混合液在500×g离心5m in,使原生质体与杂质

一起沉淀.

7.去上清液后用25%的蔗糖使之悬浮,在1500×g离心5 m in,弃沉淀,将上清液用

蒸馏水稀释3倍,再在500×g离心5m in;沉淀即为纯化的原生质体.

5液泡分离

5.1渗透裂解法

（1）.酶法制备原生质体,在制备好的120mL原生质体悬浮液中迅速(15s内)加

入等体积的介质溶液.

（2）. 介质溶液成分及浓度为: 3mmol/LMgCl2, 1mmol/L DDT(二硫基苏糖醇),

MgCl2:配置体积：100ml ,浓度：0.3mol/L ,分子量：95.21g/mol

m= 0.3mol/L*100mL*95.21g/mol=2.8563g.

DDT:配置体积：100ml ,浓度：0.1mol/L ,分子量：154.25g/mol

m=cv/M=0.1mol/L*100mL*154.25g/mol=1.5425g.

（3）.缓慢摇动后得到一个均一的悬浮液.用一个多浆叶的搅拌器搅拌2～4 m in,转速为每分钟15转.

（4）.去掉搅拌器将悬浮液通过1mm孔径的塑料板过滤,然后再通过2层玻璃棉. （5）.得到的悬浮液在23×g下离心3m in使一些杂质沉淀,将上部清液转移到另

一个250mL的离心管中,用一木条缓慢搅拌使其成为均一悬浮液;而残余的聚合团和碎片附着在木条上.去掉木条,在100×g下离团和碎片附着在木条上. (6).心悬浮液3m in,去掉上清液得到的沉淀即为含大量色素的液泡;而不含色素的液泡需要在1100×g离心3m in才能获得.