第四章克隆策略与体外重组.
第四章克隆策略与体外重组
一、填空题
1．克隆策略有三层涵义：(1)第一层是—--------------—；
(2)第二层涵义是—----------------—；
(3)第三层涵义就是-------------------- 。
2．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：
(1)—-----------------—(2)——------------------
(3)—------------------—。
3．现有的基因克隆策略大体上分为三类：—--------------—、—------------—、—--------------—。
4．受体细胞的感受态是—--------------—。
5． DNA重组连接的方法大致分为四种：(1)—---------------—(2)—------------—
(3)————————————（4)—--------------------—。
6．平末端连接法(blunt end ligation)的连接效率比黏性末端连接的效率低得多，所以通常在连接反应体系中适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂，以提高平末端DNA连接的效率。常用的凝聚剂是--------------——。
7．一个细菌的表面大约有—-----------—个同DNA结合的位点。
8． 1984年,Hung和Wesink发现如果两个不同的5’黏性末端通过部分填补得到如下的单链突出末端，即可有效地相互连接：(1)—---------------—(2)—----------------— (3)——----------------。 9．将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个—-------------—，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个—---------------—。
10．将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个—----------—，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个—-------------------—。
11．在构建cDNA克隆之前，可以用—-----------—来富集一特殊的核苷酸序列。做法是用来自于能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞(不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切)的过量mRNA 分子杂交。
12．一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用——技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。 13．只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用—---------—可以将这段DNA进行百万倍的扩增。
14．SD序列是mRNA分子中同——结合的序列，其结构特征是—----------—的全部或一部分。
15．环状质粒的转化效率很低，通常是线性双链DNA转化效率的—-----------—。
16．cDNA技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法，因为它可以用—---------—为模板通过反转录成一个双链的、无——的基因，因而有利于在原核细胞中进行功能表达。
17．产生平末端的方法有：（1）----------------------（2）---------------------（3）----------------------。
18．不同细菌出现感受态的时期是不同的，如肺炎球菌感受态出现的时期是--------------、而枯草杆菌感受态的出现是在---------------------- 。
19．人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为—----------—时吸附DNA，—-------—时摄入DNA。
20．感受态细胞是可以诱导的，诱导的方法有—---------—、—----------------—、------------。
21．影响酶切的主要因素之一是底物DNA，底物的影响包括—------------------—，---------------------—，-----------------------，----------------。
22．salI是识别6个核苷酸的酶，其识别切割的理论值是——个碱基就有一个切点，但在哺乳动物中，大约——才有一个切点。
23.在精简基因组文库中，用标记的—------—同未标记的—----------—杂交，最后建成的是——————————库。
24．构建基因组文库时连接方法主要是—-------—；而构建cDNA文库，可用----------或一-------- 。
25．将携带有外源基因并能持久传递给子代的动物称为—---—动物，这些外源基因就叫做————————。
26．提高重组DNA分子对E．coli的转化效率，通常可采取—----------------—处理和-----------------------一。
二、判断题
1．外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后，这个基因不再有任何功能。
2．用不同的产生黏性末端的限制性内切核酸酶分别切割载体和外源DNA，得到的黏性末端是不亲和的黏性末端。
3．基因组DNA文库是含有某一生物中全部DNA序列随机克隆的克隆群，而cDNA文库是含有某一生物中所有表达基因随机克隆的克隆群。
4．CDNA克隆较之基因组克隆最重要的优越性就是它们含有一个基因的完整序列。
5．通过差示杂交后制备的CDNA文库使克隆那些只在特定分化细胞表达基因的几率大为提高。
6．在染色体步移中，可通过DNA测序知道已到达所感兴趣的基因。
7．一旦有了一套已知顺序的基因组克隆，通过从文库中获得覆盖目的突变基因所在基因组区的所有克隆，就可以进行染色体步移。
8．根据遗传连锁作图把基因定位在基因组中是定位克隆的第一步，它为分离特定的人的基因提供了一个直接而快速的方法。
9．人工感受态和自然感受态细胞都能吸收线性和环状单链DNA。
10．人工导入基因和正常染色体基因间的同源重组，可以发生基因置换。
11．为了保证重组DNA分子在受体细胞中能够稳定地独立存在下来，通常用rec-r-m-表型的细胞株作为受体菌。
12．线性DNA片段被导人哺乳动物细胞后，在细胞内酶的作用下，很快相互连接成重复的DNA大片段，并能在随机位点整合到染色体中。
13．不匹配的黏性末端是不能通过黏性末端连接的。
14．用限制性内切核酸酶切割载体、供体DNA后，要加入EDTA-SDS中止液使限制性内切核酸酶失活，这样有利于重组连接。
15．限制性内切核酸酶BglⅡ识别的序列为A↓GATC丁， BamHI识别的序列为G↓GATCC，用它们分别切割载体DNA和供体DNA，不必使酶失活，就可以直接通过黏性末端连接法进行连接。
16．具有EcoRⅡ末端的外源片段只能以一个方向插入到EcoRⅡ末端的载体中。
17．不匹配的黏性末端可以通过部分填补后进行连接。
18．低丰度的mRNA不仅拷贝数少，而且种类也少。
19．同聚物接尾法构建重组体，不仅连接效率高，而且也很容易回收插人的片段。
三、选择题(单选或多选)
1．重叠群(contig)是一群克隆，在这个克隆群体中各个体( )
(a)相互之间重叠
(b)都是来自不同生物的克隆
(c)插入片段位于不同染色体的不同区段
(d)位于同一染色体的不同区段
2．根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。在下列文库中， ( )是cDN A文库
(a) YAC文库
(b) MAC文库
(c) 扣减文库
(d) BAC文库
3．下面关于多克隆位点(multipleclonesite,MCS)的描述，不正确的一句是( )
(a)仅位于质粒载体中
(b)具有多种酶的识别序列
(c)不同酶的识别序列可以有重叠
(d)一般是人工合成后添加到载体中
4．部分填补是DNA体外重组中常用的一种技巧，填补时应( )
(a)控制DNA聚合酶的用量
(b)控制酶反应的时间
(c)限制dNTP的种类
(d)注意只能填补载体
5．在下列限制性内切核酸酶中，( )的识别序列中有松弛碱基，选用这种酶时要考虑连接后外源DNA的插入方向。
(a)HindⅢ
(b)EcoRⅡ
(c)BamHI
(d)Pstl
6． EcoRI切割载体DNA和供体DNA所产生的片段在用于重组连接前要( )。
(a)用65℃处理5～10分钟使限制性内切核酸酶失活
(b)用CIP处理载体DNA防止自身环化
(c)进行琼脂糖凝胶电泳监测
(d)上述说法都正确
7．在cDNA技术中，所形成的发夹环可用( )
(a)限制性内切核酸酶切除
(b)用3’外切核酸酶切除
(c)用S1核酸酶切除
(d)用5’外切核酸酶切除
8．在DNA的酶切反应系统中，通常：( )
(a)用SSC缓冲液
(b)加入Mg2+作辅助因子
(c)加入BSA等保护剂
(d)上述说法中，有两项是正确的
9．黏性末端连接法，不仅操作方便，而且( )
(a)产生新切点 (b)易于回收外源片段
(c)载体不易环化 (d)影响外源基因的表达
10．在下列表型中，( )是基因工程上理想的受体菌表型
(a)r+m+rec’
(b)r-m-rec-
(C)r-m-rec+
(d)r+m+rec-
11．关于DNA接头在基因工程中的作用，下列说法中哪一项不正确?( )
(a)给外源DNA添加适当的切点
(b)人工构建载体
(c)调整外源基因的可读框
(d)增加调控元件
12．DNA的结构对转化的影响很大，一般说来，转化效率最高的是：( )
(a)完整的线性双链DNA
(b)单链线性DNA
(c)完整的环状双链DNA
(d)开口的双链环状DNA
13．cDNA文库包括该种生物的( )
(a)某些蛋白质的结构基因
(b)所有蛋白质的结构基因
(c)所有结构基因
(d)内含子和调控区
14．下列关于建立cDNA文库的叙述中，哪一项是错误的?( )
(a)从特定组织或细胞中提取DNA或RNA
(b)用反转录酶合成mRNA的对应单链DNA
(c)以新合成的单链DNA为模板合成双链DNA
(d)新合成的双链DNA甲基化
15．下列对黏性末端连接法的评价中，哪一项是不正确的? ( )
(a)操作方便 (b)易于回收片段
(c)易于定向重组 (d)载体易于自身环化，降低重组率
16．关于cDNA的最正确的提法是：( )
(a)同mRNA互补的单链DNA (b)同mRNA互补的双链DNA
(c)以mRNA为模板合成的双链DNA (d)以上都正确
17．关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确?( )
(a)具有可诱导性
(b)具有可转移性
(c)细菌生长的任何时期都可以出现
(d)不同细菌出现感受态的比例是不同的
四、简答题
1． cDNA克隆与基因组克隆有何不同?
2．怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去?
3．有哪些可能的原因使一个基因在DNA库中丢失?
4．简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。
5．一个双链DNA分子(为5’突出端)可采用哪些方法使之加上dAl00～120的尾巴?
6．酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构?
7．何谓YAC?主要特性是什么?
8． Muller的PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里?
9．在构建cDNA文库时，为什么常用GC接尾而不用AT接尾法连接?
10．用限制性内切核酸酶切割DNA后，经电泳检查，发现有拖尾现象，其可能的原因是什么?
11．欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如E．coli)中进行表达，克隆时应注意哪些问题?
12．假定你分离到一个E．coli的Thy-突变体，并推测有可能是ThyA基因突变。请设计一个方案用P CR从染色体DNA扩增突变的ThyA基因，测定突变的序列。(注：E．coli野生型的ThyA基因的序列是已知的)
五、问答题
1．如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因?
2．何谓定位克隆(positional cloning)?
3．何谓染色体步移(chromosome walking)?
4．在染色体步移中，用哪些方法获得克隆的末端?
5．何谓表型克隆(phenotype cloning)?
6．什么是基因文库?
7．什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?
8．什么是cDNA文库(complement DNA library)?同基因组文库有何差别?
9．黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。 10．什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优缺点?
11．何谓接头连接法(1inker ligation)?
12．什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高?
13．如何使用甲基化酶对克隆DNA进行保护?有什么意义?
14．何谓稀有酶?(举例说明)
15．为了大量获得许多用于生化鉴定的产物，你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，你如何确保最终能得到产物?
16．若在进行DNA重叠群分析时，你发现在一个编码有价值但不稳定蛋白质的可读框之后，紧接着另一个可读框，它可在蛋白质的C末端加上一个稳定结构。举出至少两种获得被修饰蛋白产物的方法。
17．某一质粒载体具有Tet r和Kan r的表型，在Kan抗性基因内有一BglI的切点。现用BglI切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?
18．限制性内切核酸酶BamH I和PstI切割某一DNA序列，结果示于图20.1。
5’ 3’
- -GGATCC- - Bam HI - -G GATCC- -
- -CCTAGG- - -----→ - -CCTAG G- -
3’ 5’
图-20．1 BamHI和PstI识别序列处的切割，只显示识别位点的核苷酸序列
(1)指出被切割DNA分子的5’端和3’端；
(2)如果你将切割后的DNA同DNA聚合酶、4种dNTP在一起温育，这些DNA末端会有什么样的变化?
(3)经过B中的反应后，你还能够用T4 DNA连接酶将Bam HI末端连接起来吗?PstI末端呢?(T4DNA连接酶能够连接平末端和黏性末端)
(4)(3)中的连接后，能够重新形成BamHI位点吗?PstI位点呢?
4植物基因克隆的策略与方法
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
克隆技术简介
克隆技术介绍 张勋学号：160820216 摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。 一、克隆技术实质 1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克 隆(Clone)”的术语。学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。 克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。 植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。 正向遗传学途径以待克隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定基因的表达产物或表型性状进行克隆，如功能克隆和表型克隆等；反向遗传学途径则着眼于基因本身特定的序列或者在基因组中的特定位置进行克隆，如定位克隆、同源序列法克隆等；随着DNA测序技术和生物信息学的发展，又产生了电子克隆等新兴克隆技术。目前，在玉米，水稻、油菜、拟南芥、烟草、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。现对在植物基因克隆过程中运用的主要技术进行综述，以把握植物基因克隆技术的发展历程，并对未来的发展趋势进行展望。
同源重组和基因工程
同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在染色体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，同源重组需要一系列的酶催化。 !!!是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant) 拼接重组体(splice recombinant) 片段重组体： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) ：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 基因工程(genetic engineering) ：实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程。 工具酶功能 限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNA DNA连接酶催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键， 使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3′末端 Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5'→3'聚合、 3'→5'外切活性，而无5'→3'外切活性。常用于cDNA第二链合成， 双链DNA 3'末端标记等 反转录酶①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶切除末端磷酸基 基因载体：
《克隆技术》教案
第二节克隆技术 一、【教材分析】 前面学习了动植物的生殖和生物的遗传和变异的特征。本课是以此为基础，在学生已有的认知和经验基础上，进一步引领学生感悟生命过程的复杂多样，讨论克隆技术给人类带来的影响，思考科学技术的双面性。 二、【教学目标】 （一）知识目标： 1、能通过讨论等方式探究克隆技术带来的影响；能将所收集的资料进行整理，设计成有条理的讲演 稿向其他人介绍；能有一定根据地提出自己的观点，并能对其他同学的观点进行评价。 2、能体会到科学技术的“双刃剑”含义。（难点） 3、能用自己的话解释克隆技术。 4、能从正反两个方面说出克隆技术给人类带来的影响。（重点） （二）能力目标： 1.学会收集资料，能通过各种方法和途径收集到有关克隆技术的发展的资料。 2.学会交流和汇报，能够将自己的收获展示给大家，并能够在交流活动中获得他人的信息。 （三）情感目标： 1.通过收集有关克隆人方面的信息，增强关注社会热点问题的意识； 2.通过分工合作，培养团结互助的协作精神； 3.激发对生物技术发展研究的兴趣和探究的欲望。 四、【教学准备】 教师准备： 收集相关的资料和图片作成多媒体课件； 学生准备： 1、准备“假设我会克隆”小作文；
2、收集有关克隆人方面的信息和资料，为“关于是否应该禁止克隆人的辩论”做准备。 五、【教学过程】 教学环 节及时间安排教师活动学生活动 设计意 图 一、创设情景，激发兴趣： （3分钟）1、【展示】孙悟空图片或视频： 2、【提问】你喜欢孙悟空吗？他有哪些本领？ 3、【过渡】孙悟空拔出一根毫毛能变出千万个一 样的自己来。这个神话引发人类复制自身的幻 想，用现代的眼光看就是“克隆”。今天我们学 习第二节克隆技术。 回答孙悟空会：①七 十二变；②腾云驾 雾；③有一双火眼金 睛，能看穿妖魔鬼怪 的伪装；④一个筋斗 能翻十万八千里；⑤ 拔一根毫毛变出一 样的自己等。 孙悟空 形象和故 事，家喻户 晓。易于激 发学生学 习兴趣。 二、知识回顾: （4分钟）1、【展示图片过渡】植物的“克隆”，老百姓可 能每天都在做。 扦插 嫁接 2、【提问】 植物的扦插、嫁接、压条、组织培养和用种子繁 殖相比，有什么特点？ 3、【过渡】无性生殖在生物学上就叫“克隆”。 植物的克隆我们每天都可以做，高等动物的克隆 看图片回顾植物的 扦插、嫁接、压条、 组织培养的知识。 思考回答：扦插、嫁 接、压条、组织培养 都是无性生殖，没有 两性生殖细胞的结 合而直接由母体产 生新个体。 学生对无 性生殖很 熟悉，但不 知道无性 生殖就是 克隆。教师 利用原有 的知识做 基础，引导 学生回顾、 复习。使课 堂能够顺 利过渡到 克隆技术。
植物基因克隆的策略与方法
植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1 功能克隆(functional Cloning) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此
克隆技术的发展与应用前景
克隆技术的发展及应用前景 克隆通常是一种人工诱导的无性生殖方式或者自然的无性生殖方式（如植物）。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一种生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（就像同卵双生一样）。但是通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”，它已经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 目前，克隆技术发展十分迅速。各国政府有关人士、民间对克隆技术的评价褒贬不一。克隆技术已展示出广阔的应用前景，包括以下四个方面： （1）培育优良畜种和生产实验动物； （2）生产转基因动物； （3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法； （4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源。 在不久的将来，克隆技术技术将可以用来治疗糖尿病、中风、癌症、爱滋病、心脏病以及诸如帕金森综合症等精神疾病，并极大改变现有的器官移植理论和治疗手段，给人类带来福音。 克隆技术会给人类带来极大的好处，例如，英国PPL公司已培育出羊奶中含有治疗肺气肿的a-1抗胰蛋白酶的母羊。这种羊奶的售价是6千美元一升。一只母羊就好比一座制药厂，用什么办法能最有效、最方便地使这种羊扩大繁殖呢？最好的办法就是“克隆”。同样，荷兰PHP公司培育出能分泌人乳铁蛋白的牛，以色列LAS公司育成了能生产血清白蛋白的羊，这些高附加值的牲畜如何有效地繁殖？答案当然还是“克隆”。母马配公驴可以得到杂种优势特别强的动物——骡，骡不能繁殖后代，那么，优良的骡如何扩大繁殖？最好的办法也是“克隆”，我国的大熊猫是国宝，但自然交配成功率低，因此已濒临绝种。如何挽救这类珍稀动物？“克隆”为人类提供了切实可行的途径。具体应用有以下几个方面： 转基因动物研究 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但转基因动物的实际应用并不多，除单一基因修饰的转基因小鼠医学模型较早得到应用外，转基因动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的研究时间较长，已进行了10多年，但在全世界范围内仅有2例药品进入3期临床试验，5～6个药品进入2期临床试验；而其农艺性状发生改良、可资畜牧生产应用的转基因家畜品系至今没有诞生。转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和
拟南芥基因克隆的策略与途径
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序 已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物 的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字 花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各 国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功 能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的 几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
2019届高考生物二轮复习克隆技术教案(浙江专用)
列叙述正确的是() A．三者都涉及基因工程技术 B．三者都是在细胞或细胞器水平上的操作 C．克隆动物属于无性生殖范畴 D．人工种子的胚状体是由受精卵发育而成的 【解析】乳腺生物反应器采用了基因工程技术，人工种子和克隆动物都采用了细胞工程技术，克隆动物是由重组细胞发育成完整的个体，该个体并非由受精卵发育而来，因此克隆动物属于无性生殖的范畴，人工种子的胚状体是由植物组织培养获得的，并非由受精卵发育而来。 【答案】 C 关于哺乳动物细胞体外培养的难易程度，下列表述正确的是()
A．乳腺癌细胞易于乳腺细胞；胚胎细胞易于脂肪细胞 B．乳腺细胞易于乳腺癌细胞；胚胎细胞易于脂肪细胞 C．乳腺细胞易于乳腺癌细胞；脂肪细胞易于胚胎细胞 D．乳腺癌细胞易于乳腺细胞；脂肪细胞易于胚胎细胞 【解析】哺乳动物的乳腺细胞和脂肪细胞都是高度分化的细胞，体外培养难度大，乳腺癌细胞能够恶性增殖，容易进行体外培养，胚胎细胞具有很强的分裂增殖能力，容易进行体外培养，A正确。 【答案】 A 1. (1)均能打破物种之间的生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍。 (2)均能按照人的意愿定向改良生物性状。 2．不同点 (1)原理不同：细胞工程是细胞(或细胞核)的全能性，细胞膜的流动性及细胞增殖；基因工程是DNA分子组成、结构和遗传密码的统一性。 (2)操作水平不同：细胞工程是细胞或细胞器水平；基因工程是分子水平。 (3)工具酶不同：细胞工程用到纤维素酶和果胶酶(植物体细胞杂交)或胰蛋白酶(动物细胞培养)；基因工程用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶。 (4)目的不同：细胞工程是为了改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品；基因工程是创造出人们需要的新的生物类型和生物产品。 3．联系 (1)转基因植物的获得离不开植物组织培养。 (2)转基因动物的培育离不开动物细胞培养。 下列生物工程技术中，不属于细胞工程的是() A．通过试管动物大量繁殖优良动物 B．利用含有人胰岛素基因的大肠杆菌生产胰岛素 C．通过体细胞克隆技术培养出克隆羊 D．将某人的肝癌细胞在实验室中繁殖成一个细胞系
克隆技术发展简介
克隆技术简介 克隆技术，是由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。一个克隆就是一个多细胞生物在遗传上与另外一个生物完全一样。克隆可以是自然克隆，例如由无性生殖或是由于偶然的原因产生两个遗传上完全一样的个体（例如同卵双生一样）。但是我们通常所说的克隆是指通过有意识的设计来产生的完全一样的复制。 “克隆”的来源及发展 克隆技术，已经经历了三个发展时期：第一个时期是微生物克隆，即用一个细菌很快复制出成千上万个和它一模一样的细菌，而变成一个细菌群；第二个时期是生物技术克隆，比如用遗传基因――DNA克隆；第三个时期是动物克隆，即由一个细胞克隆成一个动物。克隆绵羊“多利”由一头母羊的体细胞克隆而来，使用的便是动物克隆技术。 克隆技术的设想是由德国胚胎学家于1938年首次提出的，1952年，科学家首先用青蛙开展克隆实验，之后不断有人利用各种动物进行克隆技术研究。由于该项技术几乎没有取得进展，研究工作在80年代初期一度进入低谷。后来，有人用哺乳动物胚胎细胞进行克隆取得成功。1996年7月5日，英国科学家伊恩·维尔穆特博士用成年羊体细胞克隆出一只活产羊(多莉)，给克隆技术研究带来了重大突破，它突破了以往只能用胚胎细胞进行动物克隆的技术难关，首次实现了用体细胞进行动物克隆的目标，实现了更高意义上的动物复制。 多莉与那头6岁母羊具有完全相同的基因，可谓是它母亲的复制品。具体有四个步骤如下 ①从一只六岁雌性的芬兰多塞特(Finn Dorset)白面绵羊（称之为A）的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为供体细胞。 ②从一头苏格兰黑面母绵羊（称之为B）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞。 ③利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成融合细胞。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞。 ④将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（称之为C）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊多莉。 换言之，多莉有三个母亲：它的“基因母亲”是芬兰多塞特白面母绵羊（A）；科学家取这头绵羊的乳腺细胞，将其细胞核移植到第二个“借卵母亲”——一个剔除细胞核的苏格兰黑脸羊（B）的卵子中，使之融合、
4重组表达质粒的构建——基因的克隆
重组表达质粒的构建——基因的克隆 长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。 选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。 原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种： 1）酶切连接 这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。 2）TA克隆 TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3′末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3′末端A正好匹配。这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3′末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。 3）TOPO克隆 TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。主要原理是在T载体的T碱基上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，其克隆效率提高数倍，并且操作极其简单，整个反应体系不需要在添加连接酶成分。如果在线性化平端载体上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，平端连接将不再是难题，如果再配合一个致死基因ccdB （Control of cell death）使用，凡是没有插入外源核酸序列的空载体自连，转入大肠杆菌可以正常表达ccdB蛋白，破坏细菌DNA gyrase(促旋酶)，造成细菌染色体降解而死亡；而插入外源核酸序列的会干扰ccdB蛋白的正常表达，细菌可以正常存活，平端克隆高背景问题这样得以完美解决。 4）Gateway技术 该技术所依赖的基础是lambda噬菌体的位点特异性重组反应。需要限制酶切回收、T4 Ligase连接；该方法一步就可以完成，只需要将基因克隆到入门载体（Entry Vector）,依赖载体上的特定的重组序列和重组酶，将外源基因克隆到具有相同重组序列的载体上；入门载体一般包含两个attL1和attL2,中间夹杂一个ccdB自杀基因，自连的空载体在转入大肠杆菌中都不会存活。入门载体构建成功之后，就可以轻松地将入门载体和目的载体质粒混合加入重组酶即可发生重组，生成所需要的融合质粒，当然还有一个副产品质粒。这种克隆方法适合于将一个基因批量化构建到不同载体系列中进行功能测试。这种技术也适合于大批量的文库构建，具体细节在此就不做赘述。 该技术主要的缺点是：该技术系统使用的酶非常昂贵，而且酶非常不稳定；其次，适合于gateway技术的载体非常少，只有一个厂家生产而且昂贵，来源受限；对于大片度（>10Kb）的效率很低，与传统的酶切-T4连接技术相比没有优势。 5）Infusion技术 这个是目前比较流行的克隆技术，可以任意载体任意基因片段快速实现多片段、长片段定点定向克隆，
原核生物的同源重组
原核生物的同源重组 在生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组（Homologous Recombination）。同源重组的频率与DNA或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍。 3.1.1 原核细菌的基因转移程序 原核细菌的基因转移程序是基于物理学和生物学的原理建立起来的，将质粒或噬菌体DNA导入细菌受体细胞的方法主要有以下几种： 1．Ca2+诱导转化法 1970年，有人发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收 噬菌体DNA，此后不久，对这种程序进一步的优化实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序如图3-1所示。将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+协助细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2和CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。1983年，有人除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。 2．原生质体转化法 在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子的吸收。此时，再加入含有待转化的DNA样品和聚乙二醇的等渗溶液，均匀混合。通过
第四节克隆技术的应用和难题
第四节克隆技术的应用和难题 一、克隆技术的应用领域 克隆技术已展示出广阔的应用前景和有价值的应用，概括起来大致有以下五个方面： （一）生产转基因动物 转基因动物研究是动物生物工程领域中最诱人和最有发展前景的课题之一，转基因动物可作为医用器官移植的供体、作为生物反应器，以及用于家畜遗传改良、创建疾病实验模型等。但目前转基因动物的实际应用并不多，转基因动物制作效率低、定点整合困难所导致的成本过高和调控失灵，以及转基因动物有性繁殖后代遗传性状出现分离、难以保持始祖的优良胜状，是制约当今转基因动物实用化进程的主要原因。 体细胞克隆的成功为转基因动物生产掀起一场新的革命，动物体细胞克隆技术为迅速放大转基因动物所产生的种质创新效果提供了技术可能。采用简便的体细胞转染技术实施目标基因的转移，可以避免家畜生殖细胞来源困难和低效率。同时，采用转基因体细胞系，可以在实验室条件下进行转基因整合预检和性别预选。在核移植前，先把目的外源基因和标记基因（如LagZ基因和新霉素抗生基因）的融合基因导入培养的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选转基因阳性细胞及其克隆，然后把此阳性细胞的核移植到去核卵母细胞中，最后生产出的动物在理论上应是100％的阳性转基因动物。采用此法，Schnieke等（Bio Report，1997）已成功获得6只转基因绵羊，其中3只带有人凝血因子IX基因和标记基因（新霉素抗性基因），3只带有标记基因，目的外源基因整合率高达50％。Cibelli（Science，1997）同样利用核移植法获得3头转基因牛，证实了该法的有效性。由此可以看出，当今动物克隆技术最重要的应用方向之一，就是高附加值转基因克隆动物的研究开发。 目前，克隆技术在英国又有了新的进展，他们把这一技术应用于人类造血事业。英国的PPL公司是克隆技术的经济后台，它的主管罗思詹姆斯博士说：“从研究“多莉”中我们知道，我们可以用一个细胞制造出一只转基因动物。我们现
第8章 细胞重组与克隆技术
第8章细胞重组与克隆技术 8.1细胞重组 8.1.1细胞重组定义 指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。 8.1.2细胞重组的特点与意义 8.1.3细胞重组方式 细胞重组的方式基本分为以下三种： （1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。 （2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。 （3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞。 8.1.4细胞重组材料的获得 8.1.4.1 胞质体（cytoplast)的获得 定义：是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 制备方法：用细胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发其排核。借助细胞松驰素的这种作用，结合高速离心可以得到胞质体。 制取容器及条件 结构特点：植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同，具有内质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等骨架系统，各细胞器仍占有固有的位置。 8.1.4.2 核体的获得 定义：与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。 制备方法： 8.1.4.3 微细胞(microcell)的获得 定义：又可被称为微核体，是只含有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。 制备方法：秋水仙素及其衍生物和长春花碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。 将从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞作为材料，通过显微操作技术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇（PEG）等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们重新装配成新的活细胞。 8.1.5 显微操作技术 借助显微操作仪进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位的变化等等操作。 8.2克隆技术 植物界——吊兰 动物界——孙悟空 8.2.1 克隆(clone)的定义 本意——是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。目前——指一种实现无性繁殖的操作，而不是一般意义上的无性繁殖（或无性繁殖操作）。关键技术——核移植。 克隆的三个层面 分子克隆：分子水平上的克隆。如基因克隆。 细胞克隆：细胞水平上的克隆。如制备单克隆抗体的杂交瘤细胞的克隆。 动物克隆或植物克隆：个体水平上的克隆。如利用营养繁殖和组织培养技术生产的植物。8.2.2 克隆的理论基础 细胞全能性。 细胞的分化。 植物界 *克隆现象在植物界普遍存在，既可以是自然的，也可以是人工的。
gateway重组技术
河南农业大学牧医工程学院 1 Gateway 基因克隆 Gateway 基因克隆是由Invitrogen 公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA 片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA 转移成为可能。 这一技术在插入的目的DNA 片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone ）。据Invitrogen 宣称Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA 保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA 片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology ）。 一、Gateway 基因克隆的原理及机制 Gateway 被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector ）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector ，目的载体）上。 Gateway 的原理是建立在噬菌体DNA 定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF 、Int ）的作用下，lambda 的attP 位点和大肠杆菌基因组的 attB 位点可以发生定点重组，lambda 噬菌体DNA 整合到大肠杆菌的基因组DNA 中，两侧产生两个新位点：attL 和attR 。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis 和IHF 、Int 的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB 和attP 位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
高中生物克隆技术
高中生物克隆技术2019年3月21日 （考试总分：100 分考试时长： 120 分钟） 一、单选题（本题共计 20 小题，共计 100 分） 1、（5分）下列有关克隆绵羊“多利”的说法正确的是 ①“多利”的诞生属无性繁殖 ②“多利”的诞生采用了核移植技术 ③“多利”的诞生采用了胚胎移植技术 ④“多利”的诞生说明动物细胞具有全能性 ⑤动物细胞培养是整个技术的基础 ⑥“多利”的诞生采用了胚胎分割技术 A．①④⑤⑥ B．①②③④ C．①②③⑤ D．①②④⑤ 2、（5分）下图为真核细胞内某基因（15N标记）结构示意图，该基因的全部碱基中C占30%。下列说法正确的是 A．若该基因中含有180个碱基，则该基因中含有的氢键数目为180个 B．将该基因置于14N培养液中复制3次后，含15N的DNA分子占1/8 C．DNA解旋酶只作用于①部位，限制性核酸内切酶只作用于②部位 D．该基因的一条核苷酸链中（C+G）/（A+T）为3：2 3、（5分）SPL蛋白是植物中广泛存在的一类调控基因转录的分子。不同植物的SPL蛋白结构不同，但均有一个大约由80个氨基酸构成的结构相同的功能区，可识别并结合到某些基因的特定区域。SPL基因最初是从植物花序cDNA文库中得到的。下列相关叙述正确的是 A．SPL是80个氨基酸构成的蛋白质 B．SPL基因能在花序细胞中表达 C．SPL可催化特定基因的翻译过程 D．SPL在不同绿色植物中功能差异较大 4、（5分）在下列选项中，需要采用植物组织培养技术的有几项 ①利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，获得多倍体植株 ②获取大量的马铃薯脱毒苗 ③利用基因工程培育抗棉铃虫的植株 ④利用花药离体培养得到单倍体植株 ⑤无子西瓜的快速大量繁殖 ⑥快速繁殖花卉和蔬菜等作物A．3项 B．4项 C．5项 D．6项 5、（5分）下列关于基因工程的叙述中，正确的是 ①基因工程是人工进行基因重组的技术 ②基因治疗是基因工程技术的应用 ③基因工程打破了物种与物种之间的界限 ④DNA探针可用于病毒性肝炎的诊断、遗传性疾病的诊断、改造变异的基因、检测饮用水病毒含量A．②③④ B．①②③ C．①②④ D．①③④ 6、（5分）下列对动物核移植技术的描述不正确的是 A．通过体细胞核移植方法生产的克隆动物是对提供体细胞核的动物进行了100%的复制 B．体细胞核移植的过程中可通过显微操作去除卵母细胞中的细胞核 C．体细胞核移植过程中通常采用MⅡ中期的卵母细胞作为受体细胞 D．哺乳动物核移植包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植 7、（5分）下列关于各种酶作用的叙述，正确的是 A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与核糖连接 B．限制酶将DNA分子切成两个片段可产生两分子的水 C．限制酶和DNA连接酶作用的化学键相同 D．纤维素酶和果胶酶处理植物细胞直接获得杂种细胞 8、（5分）乙羊的卵母细胞核被甲羊的体细胞核置换后，这个卵母细胞经过多次分裂，再植入丙羊的子宫内发育，结果产下一只羊羔。下列叙述正确的是 A．直接在体外对甲羊的体细胞进行诱导也能培养出胚胎来 B．羊羔的性状完全与甲羊相同 C．该过程可以很好地证明动物细胞的全能性 D．此项技术可用于保护濒危物种 9、（5分）2018年1月国际顶尖学术期刊《Cell》杂志报道，我国科学家以一只雌性猕猴胎儿成纤维细胞为核供体成功克隆两只猕猴，成为全球首例体细胞克隆灵长类动物。相关叙述错误的是 A．这项技术证明高度分化的动物体细胞具有全能性 B．研究中需要使用成熟卵母细胞作为移植核的受体 C．培育出的两只雌性猕猴的基因组成几乎完全相同 D．克隆猕猴的成功为大量培育灵长类遗传病模型动物提供了可能 10、（5分）单克隆抗体与血清抗体相比，其优越之处在于 A．单克隆抗体可作为某些药物的载体 B．单克隆抗体可以在体外制备 C．单克隆抗体特异性强、灵敏度高，并可大量制备 D．单克隆抗体的制备过程简单，操作方便 11、（5分）有关基因工程的应用及安全性的说法中，正确的是 A．用基因工程方法培育的抗虫植物也能抗病毒 B．在同一DNA分子中，限制酶的识别序列越长，酶切点出现的概率越大 C．以受精卵为受体细胞时，先要用Ca2+处理细胞以使其处于感受态
Gateway重组克隆技术
Gateway? 重组克隆技术 经典的克隆工作流程包括许多步骤，尤其是传统的限制性内切酶克隆方法。这种传统的方法限制了克隆的成功率。 例如，当其可能会在目的基因内部进行切割， 从而截短插入片段，并使得基因无法用于下游表达时，某些限制性内切酶是不能使用的。采用传统的克隆方法， 需要额外的片段回收步骤，而且在克隆大片段DNA 时，将会遇到重组效率降低， 从而需要浪费费很多时间以筛选到所需的克隆的问题- 所有这些步骤都会耗费大量的时间和精力，而且成功还无法得到保障。 而Gateway? 重组克隆技术则不存在这些问题。 极好的通用性 相反，Gateway? 重组克隆技术则规避了这些克隆限制，使您几乎能够使用任何表达系统。Gateway? 重组克隆采用了99% 有效且可逆的一小时重组反应， 并且不使用限制性内切酶、连接酶、亚克隆步骤，也不需要对不计其数的菌落进行筛选，从而节省您的时间、金钱和精力。Gateway? 技术自推出后便为研究界广泛采用， 仅参考文献便超过1500 篇。此技术使跨学科研究的合作变得简单方便，而且能从这些研究团体中获得众多载体用于真正的多学科科学研究。 最后，MultiSite Gateway? 技术等最新进展使得Invitrogen 的 Gateway? 克隆成为蛋白质表达和功能分析的理想克隆方法。 Gateway? 技术的优点 只需一小时，室温克隆反应便能快速产生您所需的克隆，效率高达99% 以上 无需使用限制性内切酶或连接酶便能保持片段正确的插入方向和阅读框，从而，获得可直接进行表达的克隆 从靶标鉴定到验证始终使用同一个克隆，无需重新测序，从而确保结果在整个实验过程中一致 使DNA 插入片段从一个表达载体穿梭到另一个表达载体，既提高了灵活性，同时还简化了克隆工作流程
疾病基因克隆的策略及主要方法
疾病基因克隆的策略及主要方法 申海鹰周元国（第三军医大学野战外科研究所分子生物学中心，重庆400042） 摘要疾病基因的分离和克隆是功能基因组学的研究热点，具体策略的选择取决于疾病背景资料的掌握程度，为能快速、准确地克隆出目的基因，本文介绍两类常用的基因克隆策略——定位克隆策略、功能克隆策略——及其主要方法，如：家系连锁分析、等位基因共占法、人群相关分析法、抑制性消减杂交、差示反转录PCR、差异消减显示法、代表性差异分析法、比较基因组杂交等，并作简要的评价。 关键词基因；定位克隆；消减杂交 学科分类号Q785 Strategies and methods for cloning pathogenic gene SHEN Hai-ying, ZHOU Yuan-guo. (C enter of Molecular Biology, Research Institute of Surgery and Daping Hospital, Third Milit ary Medical University, Chongqing 400042) Abstract Isolation and cloning of pathogenic gene is a hot spot in functional genome stu dy, while it is the disease background which decides the selection of the strategies. Tw o strategies, mapping strategy and functional cloning strategy, which can clone the obje ctive gene rapidly and accurately were introduced. Some main methods including family-based linkage analysis, allele sharing method, population association analysis, suppressio n subtractive hybridization (SSH), differential display reverse-transcription PCR (DD-RT-PC R), differential subtraction display (DSD), representational difference analysis (RDA), com parative genome hybridization (CEH) were elucidated briefly. Key words: Gene; Mapping clone; Subtractive hybridization 基因组全序列测定可望提前完成，而以功能鉴定为中心的功能基因组学应运而生，将人类5~10万个基因定位及克隆是一项庞大而艰巨的任务。自1911年Wilson将色盲基因定位于X染色体起，随着连锁分析方法的发展和体细胞杂交、重组DNA、分子杂交以及PCR技术的发现和应用，陆续出现了几种改进或全新的遗传学基因定位和克隆方法。与此同时，另一类以消减杂交为基本原理的代表性差异分析、基因组错配扫描、比较基因组杂交及mRNA差示等方法的出现和应用，使一些多基因遗传病相关致病基因的筛查和定位面临突破。迄今为止，约有5000个遗传性状被定位，其中400多个为致病基因［1］。根据不同的背景资料，人类基因克隆可采取的思路有以下四种（见附图）： 目前人类基因克隆的主要策略有三种：一是反向遗传学定位克隆策略，它通过RFLP、微卫星D NA等遗传标记，先获得某一表型基因在染色体上的定位，再在候选区域内选择已知基因，进行致病突变的筛选，并获得cDNA及全基因；另一类是从蛋白质功能着手的功能克隆策略，采用以消减杂交为策略的多种分子生物学手段，先通过消减获得特异表达或缺失的基因片段，然后进行染色体定位乃至获得全基因。本文拟就前两种主要策略和各自方法的优缺点作一介绍和分析。此外，尚有介于两者之间的候选克隆策略，包括定位候选克隆和功能候选克隆，前者是在将疾病基因以连锁分析和染色体分析基本定位以后，再在候选区域内选择所有已知基因进行致病突变的筛