第8章 细胞重组与克隆技术
第8章细胞重组与克隆技术
8.1细胞重组
8.1.1细胞重组定义
指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。
8.1.2细胞重组的特点与意义
8.1.3细胞重组方式
细胞重组的方式基本分为以下三种：
（1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。
（2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。
（3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞。
8.1.4细胞重组材料的获得
8.1.4.1 胞质体（cytoplast)的获得
定义：是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。
制备方法：用细胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发其排核。借助细胞松驰素的这种作用，结合高速离心可以得到胞质体。
制取容器及条件
结构特点：植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同，具有内质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等骨架系统，各细胞器仍占有固有的位置。
8.1.4.2 核体的获得
定义：与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。
制备方法：
8.1.4.3 微细胞(microcell)的获得
定义：又可被称为微核体，是只含有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。
制备方法：秋水仙素及其衍生物和长春花碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。
将从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞作为材料，通过显微操作技术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇（PEG）等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们重新装配成新的活细胞。
8.1.5 显微操作技术
借助显微操作仪进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位的变化等等操作。
8.2克隆技术
植物界——吊兰
动物界——孙悟空
8.2.1 克隆(clone)的定义
本意——是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。目前——指一种实现无性繁殖的操作，而不是一般意义上的无性繁殖（或无性繁殖操作）。关键技术——核移植。
克隆的三个层面
分子克隆：分子水平上的克隆。如基因克隆。
细胞克隆：细胞水平上的克隆。如制备单克隆抗体的杂交瘤细胞的克隆。
动物克隆或植物克隆：个体水平上的克隆。如利用营养繁殖和组织培养技术生产的植物。8.2.2 克隆的理论基础
细胞全能性。
细胞的分化。
植物界
*克隆现象在植物界普遍存在，既可以是自然的，也可以是人工的。
*试管植物。
*花药培养。
*基因克隆—植物基因工程的核心
动物界
*与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的充分分化的个体。
*尚未分化的胚胎细胞具有全能性。基于这种认识，人们采用胚胎分割及胚胎细胞核移植技术成功克隆出了许多动物。
克隆技术的里程碑
*首只体细胞克隆动物“多莉”(Dolly)羊的成功证明了成熟的体细胞也具有全能性。
8.2.3 哺乳动物克隆的技术方法
*胚胎分割
*胚胎嵌合
*胚胎干细胞核移植
*胚胎细胞核移植
*胎儿成纤维细胞核移植
*体细胞核移植
分析
胚胎分割和胚胎嵌合不属于真正意义上的克隆，严格说属于胚胎工程的范畴。
其它方法都是涉及细胞核移植，只是细胞核来源不同而已。
8.2.4 细胞核移植技术
（一）定义
是利用显微操作仪，将一个细胞（核供体细胞）的细胞核移入另一个去核细胞（核受体细胞）中，经人工活化和体外培养后，再移植入代孕母体内，使其发育为含有与供体细胞相同遗传物质的个体。即胞质体与核体的重组。
是目前最常用动物克隆技术，是哺乳动物体细胞克隆的核心技术
8.2.4 细胞核移植技术
核供体细胞：胚胎细胞、胚胎干细胞、胎儿成纤维细胞、体细胞。
（其中以胚胎细胞克隆最为普遍，而以体细胞的克隆意义最大）
核受体细胞：去核的卵母细胞、受精卵、2-细胞胚胎
8.2.4 细胞核移植技术
（二）发展历史
1938年，德国胚胎学家汉斯.施佩曼（Hans Spemann）博士，最早提出核移植的构想。没有实现
1952年，美国人罗伯特.布里格斯（Robert.Briggs)和T.J.金，利用两栖类卵细胞建立了细胞移植技术
8.2.4 细胞核移植技术
（三）核移植技术操作过程
*核受体细胞的准备
*核供体细胞的准备
*细胞核移植
*激活
*重组胚的体内或体外培养
*胚胎移植
核受体细胞的准备
?去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。因为在卵母细胞的细胞质中含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，使已经分化的细胞重新回到原点，同受精卵一样开始个体发育过程。
?卵母细胞的来源
一是，用激素进行超排处理再从输卵管冲出成熟的 MII卵母细胞。
二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘-卵母细胞复合体，在体外培养成熟后作为受体。
?核受体细胞的去核
化学处理
紫外线灭活染色体
显微手术法
核供体细胞的准备
?细胞核供体细胞必须是完整的二倍体。首先必须保持有供体动物完整的二倍体，其次必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分裂过程的倒转，变的如同刚刚受精的合子一样，能够重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。
细胞核移植
?胞质内注射
用一个外径5-8um的注核针吸取供体核后，直接注射进卵母细胞胞质内的方法。
?透明带下注射
把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，然后用电刺激进行细胞融合。
激活
?
重组胚的体内或体外培养
?经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养，观察重组胚的发育率。
?羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养的方法获得桑葚胚和囊胚。
?大鼠、小鼠和兔多作体外培养，发育至桑葚胚或囊胚。
胚胎移植
?重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与共体品种不同、繁殖能力强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植入代孕母畜的子宫内，待其发育到产仔。
?移植的部位：输卵管和子宫角
?移植的方法：同于体外受精
8.2.4 细胞核移植技术
（四）类型
根据核供体细胞来源的不同，可以将细胞核移植分为：
?胚胎细胞核移植
?胚胎干细胞核移植
?胎儿成纤维细胞核移植
?体细胞核移植
胚胎细胞核移植
将未着床的早期胚胎分散成单个的细胞球，在电流的作用下，使单个细胞与去除染色体的未受精的卵母细胞融合，发育成胚胎后，移入受体妊娠产子。
?目前经此法已克隆出：小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛、猴等
胚胎干细胞核移植
?将胚胎或胎儿的原始生殖细胞经过抑制分化培养后，细胞数量增多，单细胞却不分化。因此，每个细胞仍然具有细胞全能性而发育成个体的能力，这样的细胞称谓胚胎干细胞。再利用核移植技术，从理论上讲，可以比胚胎核移植生产更多的动物个体。
?目前，仅小鼠成功
胎儿成纤维细胞核移植
?从妊娠早期胎儿分离出胎儿成纤维细胞采用细胞核移植方法克隆出胚胎，经移植受体后，妊娠产仔，克隆出动物个体。
?1996年，英国用此法克隆出3只山羊。
体细胞核移植（体细胞克隆技术）
将动物体细胞经过抑制培养，使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞中，发育成胚胎后移植至受体，妊娠产仔，克隆出成体动物。
?20世纪50年代，克隆出成体蛙
?1997年英格兰爱丁堡罗斯林研究所和PPL制药公司的胚胎学家伊恩.维尔穆特博士的研究小组克隆出雌性小绵羊——“多莉”
8.2.5克隆羊——多莉
1996年7月5日，生物学界发生了一件轰动世界的大事——克隆羊多利诞生。这一成果被美国
《科学》杂志评为该年度世界10大科技进步的第1项。科学家认为，多利诞生标志着生物技术新时代来临。此后，克隆，这个以前只在科学研究领域出现的术语变得广为人知。克隆猪、克隆猴、克隆牛……纷纷问世，似乎一夜之间，克隆时代已来到人们眼前。
这是克隆技术领域的一项重大突破，利用这一技术可以大批复制某一动物，其影响不可估量。美国《科学》杂志评出的1997年世界十大科技成就，多莉羊荣登首席
克隆羊多利的诞生，是科学界的一个里程碑，在它的后面有是什么呢... ...
8.2.5.1具体操作过程
取处于后三分之一妊娠期的6岁母绵羊（芬兰多塞特白品种绵羊）的乳腺细胞作核供体细胞，用“饥饿法”使其进入休眠状态而使全部基因具有活性。
注射促性腺激素Gn促使母羊（苏格兰黑面母绵羊）排卵，28－33小时取其未受精卵快速去核，
期做受体细胞。
放入10%FCS（小牛血清）、1%FCS和0.5%FCS连续5天，饥饿使进入G
在乳腺细胞注射Gn34－36小时后与无核卵放入同一培养皿中，在微电流作用下，将乳腺细胞核融入卵中，形成一个含有新遗传物质的卵细胞。
将新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内，6天后发育成桑椹期胚胎或囊胚（8－16个细胞），再移入假孕母羊子宫内。
产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。
8.2.5.2 多莉羊克隆成功的原因
解决了使核供体细胞与核受体细胞（去核卵细胞）同步的方法。
?以前的失败是两者细胞周期不匹配，胚胎早期细胞大多停留在S期或G2期，而卵细胞大多停留在二倍体的中期，两者细胞不同步，使形成的胚胎可能发生DNA的额外复制，提早复制的染色体导致非整倍体及胚胎的异常发育。
?而伊斯维姆.穆特用饥饿法用饥法减缓细胞生长速度使两者进入G0期。同步后便于融合，使胚胎正常发育。
8.2.5.2 多莉养克隆成功的原因
解决了用体细胞做核供体与传基因的问题
由于体细胞大多停留在G0期，这为细胞同步提供了方便。同时，在受体细胞中导入目的基因，可进一步生产转基因动物。
8.2.5.3 多莉羊与以往克隆动物的最大区别
是它的核供体是高度分化了的体细胞—乳腺上皮细胞，而不是尚保留细胞全能性的早期胚胎细胞。
8.2.5.4 多莉羊的重要的生物学意义
已分化的体细胞在一定的条件下，可以恢复失去的全能性而形成完整个体。打破了哺乳动物已分化的体细胞不具有细胞全能性的传统概念。
多莉的的诞生及生长表明，利用克隆技术复制哺乳动物的最后技术障碍已被突破，在理论上成为可能。
提示我们，在培育供体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确地诱发核基因的遗传改变或精确的植入目的基因，再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意变化的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。也就是说，我们可以按照人的意志去改造、生产物种。8.2.5.5 多莉羊的真实性
科学工作者不希望科学实验出现无意差错，更不希望发生有意差错。
科学需要真实，科学来不得半点虚假，真正的科学是经得起时间检验的
8.2.6克隆技术的应用与意义
检验动物细胞全能性
加速动物繁殖、优良育种、曐护珍贵动物。
医药领域
克隆动物的遗传背景相同，因此它们是模拟疾病、基因治疗、器官移植等研究的良好实验材料，具有良好的稳定性和重复性。
可以用患者本人细胞培育出新组织。
最新进展
灵长类动物克隆成功
华人科学家于2000年左右成功利用胚胎分裂法复制两只恒河猴。
这是人类第一次克隆出与人最类似的灵长类动物。
*转基因克隆技术
*转基因——新物种，但繁殖？
*克隆——快速繁殖，但创造性？
*两者结合？——转基因克隆哺乳动物，使之成为用途广泛的“活体生物反应器”。
*大大降低转基因动物制作的技术难度和投入成本。
*当今动物克隆技术最重要的应用方向之一是高附加值转基因克隆动物的研究开发。
克隆技术存在的问题
*技术上——尚不成熟
*得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性。迄今为止，克隆试验的成功率始终很低。例如，在培育多莉的过程中，科学家共克隆出２７７个绵羊胚胎，最终成功使母羊受孕并生产的只有多莉一个。
*目前，多莉羊的制备还不能重复，更不能肯定克隆多莉羊的方法也适用于其它动物或其它不同组织器官的细胞。
克隆动物的体细胞突变、寿命及其它遗传问题
*克隆动物夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大。
*克隆动物没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。
是否是完全的“复制”？
1、克隆则是一个过程，克隆产生的个体还需进行胚胎发育和胎后发育。克隆与其原本尽管基因相同，所处环境却绝不会相同。
2、虽然克隆个体是由核移植产生的，但由于重建细胞的细胞质并非来自原本，而我们知道细胞质中也有遗传物质，它们必然会对个体产生影响，所以不能把克隆个体看成是原本的复制品。
是否是倒退？——可应用性
*有性生殖是历史进化的结果，利于种族繁衍和生存。
*选择无性生殖——克隆的方式不利于遗传多样性的保护。
社会学和伦理学问题
成龙问——克隆人，我是谁？
一个例子——人+动物
中山医科大学陈系古教授等于2001年1月以来，先后使用“核移植”技术，将人类皮肤细胞核移植到家兔卵母细胞中，经过２０００多次实验，成功克隆出１００多个人类胚胎，其中部分发育到“桑葚胚”阶段。这是国际上首次用该技术克隆出人类胚胎。
但有些学者就对在家兔卵母细胞中克隆出人类胚胎的提出质疑，认为这是违背人类伦理的“科学”实验。
克隆人制备过程
科学家们计划将普通的男性细胞或者是主体细胞和一枚女性卵子结合起来，储存于女性卵子中的遗传信息将事先被消除。通过细胞分裂形成的胚胎应只带有这名男性的全部遗传信息，最后将胚胎移植到女性子宫中。当然，如果一对夫妇愿意的话，也可以克隆女性。
克隆的漫漫长路
1938年汉斯.斯皮曼建议用成年的细胞核植入卵子的办法进行哺乳动物克隆。
1952年运用斯皮曼的构想，出现世界上第一只克隆青蛙。
1962年约翰.格登宣布他用一个成年细胞克隆出一只蝌蚪，从而引发了关于克隆的第一轮辩论。
1984年斯蒂恩.威拉德森用胚胎细胞克隆出一只羊。这是第一例得到证实的克隆哺乳动物。1996年第一个用成年哺乳动物细胞克隆出的个体———克隆羊多莉出世了。
1997年美国总统克林顿决定5年之内禁止用联邦基金资助克隆人的计划。
2000年美国科学家用无性繁殖技术成功地克隆出一只猴子“泰特拉”，这意味着克隆人在技术上已有可能。
2001年美、意科学家联手展开克隆人的工作。
课堂讨论
问题1：克隆人是不是正常的人？
解答：不管克隆技术怎样发展，克隆人怎样产生，都是人，与被克隆人实质上是存在着年龄差的同胞胎，正是这一点让人们觉得很难应对克隆人出现的伦理关系。
问题二：克隆人有没有心灵？
解答：克隆人同正常人一样有情感和感受，但克隆人的情感和被克隆人并不一样。一个广为人知的例子就是克隆希特勒，他是否会制造一场屠杀浩劫？虽然一个人的性格一部分由基因决定，是天生的，但外部环境对形成一个人的性格起更大作用。如果克隆的希特勒生活在现在的美国，这时全世界都是处于稳定繁荣状态，这个希特勒与生活在战后的德国充满仇恨和一片废墟的希特勒性格是不一样的。
所以，伟大的历史人物、英雄是很难重生的！
问题3：身体上任何一部分的细胞是否都可以用来克隆？
解答：不是，具体情况研究人员也不太说得清，他们认为，一种称为干细胞的细胞，制造起来较为方便。这种遍布全身的细胞，可以产生多种其他细胞，即使在头发上也可找到。
问题5：人可以无休止地被克隆吗？
克隆羊多莉刚出生时，它的染色体却告诉我们：当它离开母体时，就已经有好几岁了。
苏格兰罗斯林研究院的科学家们对多莉的染色体做了仔细的研究，发现其染色体末端，即端粒，比同龄的普通绵羊短。科学家认为，端粒是决定细胞老化的主要因素，端粒越短的细胞越接近死亡。变短的端粒或许表明遗传的蓝本会随着时间流逝而老化，无休止地克隆一个动物是不可能的。
软琼脂克隆形成实验步骤完整版
软琼脂克隆形成实验步 骤完整版 集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2%Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWESTREGULARArgroseG10 （4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和 0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7%Argrose上胶，降温后放入42℃水浴锅 中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每孔迅速加入1.5ml 混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数， 用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7%Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需先配2ml（20%FBS+2 ×1640+2×PS）+2ml0.7%Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO ，37℃，培养2－3 2周。 8、间隔2天补加200ul10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数视野中大于50个 克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。 10、数据处理：每个视野的面积是1mm2,6孔盘每孔的面积是9.6cm2,则一个孔中总的克隆数=平均克隆数× 960，如果要比较﹥0.05mm的克隆的绝对值，则可以利用“每孔﹥0.05mm的克隆数/每孔总细胞克隆数”，将分母取一组作为标准，做出此组与其他组的比值系数，再分别用此系数乘以各组﹥0.05mm的克隆的绝对值，就得到总细胞克隆数相同条件下的﹥0.05mm的克隆的绝对值，可进行比较。
2020高考生物二轮复习基因工程与克隆技术学前诊断
【2019最新】精选高考生物二轮复习基因工程与克隆技术学前诊断 分子β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题： (1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的__________序列发生改变。 (2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作________________________。 (3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的____________，以其作为模板，在______________酶的作用下反转录合成cDNA。cDNA与载体需在____________________酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。 (4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取________，用相应的抗体进行__________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。 解析：(1)基因是具有遗传效应的DNA片段，遗传信息储存在基因碱基对的排列顺序中。(2)蛋白质工程是指通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，故题中所述不属于蛋白质工程。(3)利用逆转录法获取目的基因时，需先提取mRNA，在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA。cDNA与载体需要在限制酶和DNA连接酶的作用下拼接构建成基因表达载体，才可导入受体菌。(4)检测目的基因是否翻译成蛋白质，需要从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。 答案：(1)碱基对(2)不属于没有对现有的蛋白质进行改造(3)mRNA 逆转录限制酶和DNA连接(4)蛋白质抗原—抗体 2．下图是科学家利用大肠杆菌生产人胰岛素的部分过程。请结合相关知识回答
细胞工程(克隆技术)
专题二细胞工程(克隆技术) [限时检测] [满分100分；限时45分钟] 1．(18分)(2015·南京模拟)下图所示为科学家利用番茄叶细胞和马铃薯叶细胞杂交培育“番茄—马铃薯”植株的过程，请回答下列问题： (1)①②过程使用了__________________________酶，以使植物原生质体相互分离，此处使用的溶液浓度较大，以保证植物细胞会发生________________，以保护原生质体不被破坏；在动物细胞培养技术中，使细胞分离开来的酶是________________。 (2)过程③在化学药剂______________的作用下会发生细胞融合；动物细胞融合的方法与植物细胞不相同的是___________________________________________ ________________________________________________________________________ __________________________。 (3)过程________________属于脱分化，过程________________属于再分化，细胞发生分化的根本原因是_____________________________________________ ________________________________________________________________________ _________________________。 (4)过程⑤⑥⑦的细胞工程技术是________________，其培养时选用的材料通常是分生组织，原因是________________________________________________ ________________________________________________________________________ _______________________。
软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)
注意：软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。接种细胞的密度每平方厘米不超过35个，正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。 1、配制100ml的1.2% Argrose和0.7%Argrose，Argrose用DNA电泳用BIOWEST REGULAR Argrose G10（4℃），溶剂用双蒸水（DDW），高压灭菌后，维持在42℃中不会凝固；配制500ml的2×1640和0.005%的结晶紫。 2、实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度42℃。提前融化血清和双抗。 3、如已制好上下胶，则在微波炉中溶解1.2%Argrose下胶和0.7% Argrose上胶，降温后 放入42℃水浴锅中保持。 4、根据实验需要的量配制20%FBS+2×1640+2×PS（5种细胞配40ml），每种细胞设3 个复孔。 5、铺下胶：按1:1比例使1.2%Argrose下胶和20%FBS+2×1640+2×PS混合，6孔盘每 孔迅速加入1.5ml混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气泡）。对于一个6孔盘，配5ml上述培养液+5ml 1.2%Argrose下胶于50ml离心管中（离心管要一直置于水浴锅中）。 6、细胞计数：取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞， 作活细胞计数，用正常培养液调整细胞密度至40×104／ml以上，这样加的体积小于100ul，不会影响其他成分的稀释程度。每孔铺1万个细胞，准备4个孔的细胞数，即4×104。 7、铺上胶：按1:1比例混合0.7% Argrose上胶和20%FBS+2×1640+2×PS，每种细胞需 先配2ml（20%FBS+2×1640+2×PS）+2ml0.7% Argrose上胶于离心管中混匀，放入42℃水浴锅中保持。再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔盘中，每孔1ml。待上层琼脂凝固后，置于5%CO2，37℃，培养2－3 周。 8、间隔2天补加200ul 10%FBS+1640+1×PS，以防过于干燥。 9、计数克隆：把平皿放置在倒置显微镜下（100×），在镜下随机选择10个视野，计数 视野中大于50个克隆数(﹥0.05mm的克隆)和所有克隆数，克隆形成率=大于50个克隆数\所有克隆数×100%。每孔加入1ml的0.005%结晶紫染色1h以上，镜下拍照。
细胞克隆形成实验
细胞xx形成实验 当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。 每个克隆含有50以上的细胞，大小在之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。 细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大： 一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。 实验方法： 平板集落形成实验、软xx集落形成实验 (a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。 平板xx形成实验基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。 置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。 软xx培养xx形成试验基本步骤： (1)取对数生长期细胞，用%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。然后根据实验要求作梯度倍数稀释。 (2)用蒸馏水分别制备出%和%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。 (3)按1:1比例使%的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。 (4)按1:1比例让%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入的细胞悬液，充分混匀，注入铺有%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。 待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。
选修三第二讲细胞工程(克隆技术)二动物细胞工程
选修三第二讲细胞工程（克隆技术） 二动物细胞工程 ［课时作业］ 一、选择题 1.（2010-苏州 棋拟）下列关于细胞工程的叙述，不正确的是（） ■ A.电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合 B.去除植物细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理 C.小鼠骨葩瘤细胞和经抗原免疫的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体 D.动植物细胞培养都需要经过脱分化处理 解析：植物细胞培养需要经过脱分化处理，而动物细胞培养不需要，电剌激可诱导植物 原生质体或动物细胞融合。用纤维素酶、果胶酶可去除殖物细胞壁，用胰蛋白酶可将动物组织分散成单个细胞。小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体。 答案：D 2.某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞（甲）和正 常肝细胞（乙）进行动物细胞培养。下列说法正确的是（） A.在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理 B.细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是刺澈细胞的呼吸 C.甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出现停止增殖的现象 D.仅用该培养液也能用来培养乙肝病毒 解析：胃蛋白酶最适pH值接近于2 ,呈酸性，而细胞培养液的pH值接近于中性，所 以不能用胃蛋白酶处理。CO2的作用是调节细胞培养液的pH值。由于存在细胞接触抑制现象，在原代培养过程中,会岀现停止增殖的现象，需要传代培养获劇胞株和细胞系；病毒在活细胞内才能増殖，不能用培养细胞的培养液逬行培养。 答案：C 3.利用细胞工程方法，以SARS病毒核衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体。下列相关叙述 正确的是（） A.用纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，产生的血清抗体为单克隆抗体 B.体外培养单个效应B（浆）细胞可以获得大量针对SARS病毒的单克隆抗体
(完整版)细胞集落形成实验
细胞集落形成实验方法介绍 非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。 集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100% （一）原理 细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。 （二）实验用品 1.材料：Hela细胞。 2.器材：（直径60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。 3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。 （三）方法 1.平板克隆形成试验 本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。 (1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。 (2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。 (3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。 (4)培养皿置37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。 (5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。 2.软琼脂集落形成试验
2019届高考生物二轮复习克隆技术教案(浙江专用)
列叙述正确的是() A．三者都涉及基因工程技术 B．三者都是在细胞或细胞器水平上的操作 C．克隆动物属于无性生殖范畴 D．人工种子的胚状体是由受精卵发育而成的 【解析】乳腺生物反应器采用了基因工程技术，人工种子和克隆动物都采用了细胞工程技术，克隆动物是由重组细胞发育成完整的个体，该个体并非由受精卵发育而来，因此克隆动物属于无性生殖的范畴，人工种子的胚状体是由植物组织培养获得的，并非由受精卵发育而来。 【答案】 C 关于哺乳动物细胞体外培养的难易程度，下列表述正确的是()
A．乳腺癌细胞易于乳腺细胞；胚胎细胞易于脂肪细胞 B．乳腺细胞易于乳腺癌细胞；胚胎细胞易于脂肪细胞 C．乳腺细胞易于乳腺癌细胞；脂肪细胞易于胚胎细胞 D．乳腺癌细胞易于乳腺细胞；脂肪细胞易于胚胎细胞 【解析】哺乳动物的乳腺细胞和脂肪细胞都是高度分化的细胞，体外培养难度大，乳腺癌细胞能够恶性增殖，容易进行体外培养，胚胎细胞具有很强的分裂增殖能力，容易进行体外培养，A正确。 【答案】 A 1. (1)均能打破物种之间的生殖隔离，克服远缘杂交不亲和的障碍。 (2)均能按照人的意愿定向改良生物性状。 2．不同点 (1)原理不同：细胞工程是细胞(或细胞核)的全能性，细胞膜的流动性及细胞增殖；基因工程是DNA分子组成、结构和遗传密码的统一性。 (2)操作水平不同：细胞工程是细胞或细胞器水平；基因工程是分子水平。 (3)工具酶不同：细胞工程用到纤维素酶和果胶酶(植物体细胞杂交)或胰蛋白酶(动物细胞培养)；基因工程用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶。 (4)目的不同：细胞工程是为了改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品；基因工程是创造出人们需要的新的生物类型和生物产品。 3．联系 (1)转基因植物的获得离不开植物组织培养。 (2)转基因动物的培育离不开动物细胞培养。 下列生物工程技术中，不属于细胞工程的是() A．通过试管动物大量繁殖优良动物 B．利用含有人胰岛素基因的大肠杆菌生产胰岛素 C．通过体细胞克隆技术培养出克隆羊 D．将某人的肝癌细胞在实验室中繁殖成一个细胞系
4重组表达质粒的构建——基因的克隆
重组表达质粒的构建——基因的克隆 长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。 选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。 原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种： 1）酶切连接 这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。 2）TA克隆 TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3′末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3′末端A正好匹配。这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3′末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。 3）TOPO克隆 TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。主要原理是在T载体的T碱基上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，其克隆效率提高数倍，并且操作极其简单，整个反应体系不需要在添加连接酶成分。如果在线性化平端载体上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，平端连接将不再是难题，如果再配合一个致死基因ccdB （Control of cell death）使用，凡是没有插入外源核酸序列的空载体自连，转入大肠杆菌可以正常表达ccdB蛋白，破坏细菌DNA gyrase(促旋酶)，造成细菌染色体降解而死亡；而插入外源核酸序列的会干扰ccdB蛋白的正常表达，细菌可以正常存活，平端克隆高背景问题这样得以完美解决。 4）Gateway技术 该技术所依赖的基础是lambda噬菌体的位点特异性重组反应。需要限制酶切回收、T4 Ligase连接；该方法一步就可以完成，只需要将基因克隆到入门载体（Entry Vector）,依赖载体上的特定的重组序列和重组酶，将外源基因克隆到具有相同重组序列的载体上；入门载体一般包含两个attL1和attL2,中间夹杂一个ccdB自杀基因，自连的空载体在转入大肠杆菌中都不会存活。入门载体构建成功之后，就可以轻松地将入门载体和目的载体质粒混合加入重组酶即可发生重组，生成所需要的融合质粒，当然还有一个副产品质粒。这种克隆方法适合于将一个基因批量化构建到不同载体系列中进行功能测试。这种技术也适合于大批量的文库构建，具体细节在此就不做赘述。 该技术主要的缺点是：该技术系统使用的酶非常昂贵，而且酶非常不稳定；其次，适合于gateway技术的载体非常少，只有一个厂家生产而且昂贵，来源受限；对于大片度（>10Kb）的效率很低，与传统的酶切-T4连接技术相比没有优势。 5）Infusion技术 这个是目前比较流行的克隆技术，可以任意载体任意基因片段快速实现多片段、长片段定点定向克隆，
2017届高考生物二轮复习基因工程与克隆技术学前诊断
“基因工程与克隆技术”学前诊断 考点一基因工程与蛋白质工程 β肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题： (1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的__________序列发生改变。 (2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作________(填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作________________________。 (3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的____________，以其作为模板，在______________酶的作用下反转录合成cDNA。cDNA与载体需在____________________酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。 (4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取________，用相应的抗体进行__________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。 解析：(1)基因是具有遗传效应的DNA片段，遗传信息储存在基因碱基对的排列顺序中。 (2)蛋白质工程是指通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求，故题中所述不属于蛋白质工程。(3)利用逆转录法获取目的基因时，需先提取mRNA，在逆转录酶的作用下逆转录合成cDNA。cDNA与载体需要在限制酶和DNA连接酶的作用下拼接构建成基因表达载体，才可导入受体菌。(4)检测目的基因是否翻译成蛋白质，需要从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。 答案：(1)碱基对(2)不属于没有对现有的蛋白质进行改造(3)mRNA 逆转录限制酶和DNA连接(4)蛋白质抗原—抗体 2．下图是科学家利用大肠杆菌生产人胰岛素的部分过程。请结合相关知识回答问题： (1)除图示方法获得目的基因(人胰岛素基因)外，还可通过__________的方法获得目的基因。 (2)图示所获得的人胰岛素基因在大肠杆菌中不能表达，需要质粒为其提供________________等调控因子；质粒含有一个或多个__________切割位点，供目的基因插入
细胞工程概述,克隆技术的条件和发展
细胞工程概述 细胞工程： 细胞工程：应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤在细胞整体水平或细胞器水平上，遵循细胞的遗传和生理活动规律，有目的地制造细胞产品的一门生物技术。 知识点拨： 1、操作水平：细胞水平或细胞器水平。 2、目的：按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。 知识拓展： 1、细胞工程与基因工程一起代表着生物技术最新的发展前沿，伴随着试管植物、试管动物、转基因生物反应器等相继问世，细胞工程在生命科学、农业、医药、食品、环境保护等领域发挥着越来越重要的作用。 2、研究内容： （1）动植物细胞与组织培养 （2）细胞融合（新的物种或品系、单克隆抗体） （3）细胞核移植（无性繁殖、克隆动物） （4）染色体工程（多倍体育种，例：八倍体小黑麦） （5）胚胎工程（优良品种、试管婴儿） （6）干细胞与组织工程（胚胎干细胞、组织干细胞） （7）转基因生物与生物反应器（转基因动物、转基因植物） 克隆技术的条件和发展 克隆技术的条件和发展： 1、克隆的条件： （1）具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞（如乳腺上皮细胞）； （2）能有效调控细胞核发育的细胞质物质（如去核卵的细胞质）； （3）完成胚胎发育的必要的环境条件（如诱导核—质重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境）。 2、克隆技术的发展：人们研究自然界克隆的规律，利用各种生物技术手段，发展了从分子到细胞、个体的各种克隆技术。 知识拓展：
1、微生物克隆：即由一个细菌分裂（复制）出多个和它完全一样的细菌而形成菌落。遗传工程克隆：例如，DNA克隆或基因克隆。用特定的限制性核酸内切酶切割某个DNA分子（目的基因），把它重组到被限制性核酸内切酶切割出匹配末端的载体分子上，再把这样的杂合分子导入特定的宿主细胞（如细菌），这一导入过程叫转化。 2、个体水平上的克隆：即不通过两性细胞的结合，从一个单一的细胞繁殖出生物个体。
第8章 细胞重组与克隆技术
第8章细胞重组与克隆技术 8.1细胞重组 8.1.1细胞重组定义 指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。 8.1.2细胞重组的特点与意义 8.1.3细胞重组方式 细胞重组的方式基本分为以下三种： （1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。 （2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。 （3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞。 8.1.4细胞重组材料的获得 8.1.4.1 胞质体（cytoplast)的获得 定义：是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 制备方法：用细胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发其排核。借助细胞松驰素的这种作用，结合高速离心可以得到胞质体。 制取容器及条件 结构特点：植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同，具有内质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等骨架系统，各细胞器仍占有固有的位置。 8.1.4.2 核体的获得 定义：与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。 制备方法： 8.1.4.3 微细胞(microcell)的获得 定义：又可被称为微核体，是只含有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。 制备方法：秋水仙素及其衍生物和长春花碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。 将从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞作为材料，通过显微操作技术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇（PEG）等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们重新装配成新的活细胞。 8.1.5 显微操作技术 借助显微操作仪进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位的变化等等操作。 8.2克隆技术 植物界——吊兰 动物界——孙悟空 8.2.1 克隆(clone)的定义 本意——是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。目前——指一种实现无性繁殖的操作，而不是一般意义上的无性繁殖（或无性繁殖操作）。关键技术——核移植。 克隆的三个层面 分子克隆：分子水平上的克隆。如基因克隆。 细胞克隆：细胞水平上的克隆。如制备单克隆抗体的杂交瘤细胞的克隆。 动物克隆或植物克隆：个体水平上的克隆。如利用营养繁殖和组织培养技术生产的植物。8.2.2 克隆的理论基础 细胞全能性。 细胞的分化。 植物界 *克隆现象在植物界普遍存在，既可以是自然的，也可以是人工的。
细胞实验操作流程
细胞冻存、复苏及传代操作流程 1. 试剂与仪器： 1.1 试剂 PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL； 青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL； FBS：Gibco公司，货号10091-148 500 mL； DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号10-013-CVR 500 mL；RPMI 1640 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL； DMSO：SIGMA公司，货号：D8418； PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 1.2 仪器 生物安全柜： 离心机： 37℃恒温水浴箱： -80℃冰箱： 4℃冰箱： 荧光倒置显微镜： 37℃恒温培养箱： 液氮罐： 2、实验方法： 2.1 细胞冻存 配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。 将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离
心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。 悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。 将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。2.2 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿）37℃培养箱静置培养。次日更换1次培养液，继续培养。 2.3 细胞传代 状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。 悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。 ①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。 ②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。 3、注意事项 1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常
gateway重组技术
河南农业大学牧医工程学院 1 Gateway 基因克隆 Gateway 基因克隆是由Invitrogen 公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA 片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA 转移成为可能。 这一技术在插入的目的DNA 片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone ）。据Invitrogen 宣称Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA 保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA 片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology ）。 一、Gateway 基因克隆的原理及机制 Gateway 被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector ）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector ，目的载体）上。 Gateway 的原理是建立在噬菌体DNA 定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF 、Int ）的作用下，lambda 的attP 位点和大肠杆菌基因组的 attB 位点可以发生定点重组，lambda 噬菌体DNA 整合到大肠杆菌的基因组DNA 中，两侧产生两个新位点：attL 和attR 。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis 和IHF 、Int 的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB 和attP 位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
细胞克隆形成实验
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高中生物克隆技术
高中生物克隆技术2019年3月21日 （考试总分：100 分考试时长： 120 分钟） 一、单选题（本题共计 20 小题，共计 100 分） 1、（5分）下列有关克隆绵羊“多利”的说法正确的是 ①“多利”的诞生属无性繁殖 ②“多利”的诞生采用了核移植技术 ③“多利”的诞生采用了胚胎移植技术 ④“多利”的诞生说明动物细胞具有全能性 ⑤动物细胞培养是整个技术的基础 ⑥“多利”的诞生采用了胚胎分割技术 A．①④⑤⑥ B．①②③④ C．①②③⑤ D．①②④⑤ 2、（5分）下图为真核细胞内某基因（15N标记）结构示意图，该基因的全部碱基中C占30%。下列说法正确的是 A．若该基因中含有180个碱基，则该基因中含有的氢键数目为180个 B．将该基因置于14N培养液中复制3次后，含15N的DNA分子占1/8 C．DNA解旋酶只作用于①部位，限制性核酸内切酶只作用于②部位 D．该基因的一条核苷酸链中（C+G）/（A+T）为3：2 3、（5分）SPL蛋白是植物中广泛存在的一类调控基因转录的分子。不同植物的SPL蛋白结构不同，但均有一个大约由80个氨基酸构成的结构相同的功能区，可识别并结合到某些基因的特定区域。SPL基因最初是从植物花序cDNA文库中得到的。下列相关叙述正确的是 A．SPL是80个氨基酸构成的蛋白质 B．SPL基因能在花序细胞中表达 C．SPL可催化特定基因的翻译过程 D．SPL在不同绿色植物中功能差异较大 4、（5分）在下列选项中，需要采用植物组织培养技术的有几项 ①利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，获得多倍体植株 ②获取大量的马铃薯脱毒苗 ③利用基因工程培育抗棉铃虫的植株 ④利用花药离体培养得到单倍体植株 ⑤无子西瓜的快速大量繁殖 ⑥快速繁殖花卉和蔬菜等作物A．3项 B．4项 C．5项 D．6项 5、（5分）下列关于基因工程的叙述中，正确的是 ①基因工程是人工进行基因重组的技术 ②基因治疗是基因工程技术的应用 ③基因工程打破了物种与物种之间的界限 ④DNA探针可用于病毒性肝炎的诊断、遗传性疾病的诊断、改造变异的基因、检测饮用水病毒含量A．②③④ B．①②③ C．①②④ D．①③④ 6、（5分）下列对动物核移植技术的描述不正确的是 A．通过体细胞核移植方法生产的克隆动物是对提供体细胞核的动物进行了100%的复制 B．体细胞核移植的过程中可通过显微操作去除卵母细胞中的细胞核 C．体细胞核移植过程中通常采用MⅡ中期的卵母细胞作为受体细胞 D．哺乳动物核移植包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植 7、（5分）下列关于各种酶作用的叙述，正确的是 A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与核糖连接 B．限制酶将DNA分子切成两个片段可产生两分子的水 C．限制酶和DNA连接酶作用的化学键相同 D．纤维素酶和果胶酶处理植物细胞直接获得杂种细胞 8、（5分）乙羊的卵母细胞核被甲羊的体细胞核置换后，这个卵母细胞经过多次分裂，再植入丙羊的子宫内发育，结果产下一只羊羔。下列叙述正确的是 A．直接在体外对甲羊的体细胞进行诱导也能培养出胚胎来 B．羊羔的性状完全与甲羊相同 C．该过程可以很好地证明动物细胞的全能性 D．此项技术可用于保护濒危物种 9、（5分）2018年1月国际顶尖学术期刊《Cell》杂志报道，我国科学家以一只雌性猕猴胎儿成纤维细胞为核供体成功克隆两只猕猴，成为全球首例体细胞克隆灵长类动物。相关叙述错误的是 A．这项技术证明高度分化的动物体细胞具有全能性 B．研究中需要使用成熟卵母细胞作为移植核的受体 C．培育出的两只雌性猕猴的基因组成几乎完全相同 D．克隆猕猴的成功为大量培育灵长类遗传病模型动物提供了可能 10、（5分）单克隆抗体与血清抗体相比，其优越之处在于 A．单克隆抗体可作为某些药物的载体 B．单克隆抗体可以在体外制备 C．单克隆抗体特异性强、灵敏度高，并可大量制备 D．单克隆抗体的制备过程简单，操作方便 11、（5分）有关基因工程的应用及安全性的说法中，正确的是 A．用基因工程方法培育的抗虫植物也能抗病毒 B．在同一DNA分子中，限制酶的识别序列越长，酶切点出现的概率越大 C．以受精卵为受体细胞时，先要用Ca2+处理细胞以使其处于感受态
Gateway重组克隆技术
Gateway? 重组克隆技术 经典的克隆工作流程包括许多步骤，尤其是传统的限制性内切酶克隆方法。这种传统的方法限制了克隆的成功率。 例如，当其可能会在目的基因内部进行切割， 从而截短插入片段，并使得基因无法用于下游表达时，某些限制性内切酶是不能使用的。采用传统的克隆方法， 需要额外的片段回收步骤，而且在克隆大片段DNA 时，将会遇到重组效率降低， 从而需要浪费费很多时间以筛选到所需的克隆的问题- 所有这些步骤都会耗费大量的时间和精力，而且成功还无法得到保障。 而Gateway? 重组克隆技术则不存在这些问题。 极好的通用性 相反，Gateway? 重组克隆技术则规避了这些克隆限制，使您几乎能够使用任何表达系统。Gateway? 重组克隆采用了99% 有效且可逆的一小时重组反应， 并且不使用限制性内切酶、连接酶、亚克隆步骤，也不需要对不计其数的菌落进行筛选，从而节省您的时间、金钱和精力。Gateway? 技术自推出后便为研究界广泛采用， 仅参考文献便超过1500 篇。此技术使跨学科研究的合作变得简单方便，而且能从这些研究团体中获得众多载体用于真正的多学科科学研究。 最后，MultiSite Gateway? 技术等最新进展使得Invitrogen 的 Gateway? 克隆成为蛋白质表达和功能分析的理想克隆方法。 Gateway? 技术的优点 只需一小时，室温克隆反应便能快速产生您所需的克隆，效率高达99% 以上 无需使用限制性内切酶或连接酶便能保持片段正确的插入方向和阅读框，从而，获得可直接进行表达的克隆 从靶标鉴定到验证始终使用同一个克隆，无需重新测序，从而确保结果在整个实验过程中一致 使DNA 插入片段从一个表达载体穿梭到另一个表达载体，既提高了灵活性，同时还简化了克隆工作流程