甘蓝型油菜单倍体遗传转化优化试验

2015油菜综合实验报告

油菜综合实验报告一、实验目的与意义 1. 了解油菜的花器构造和开花习性，练习和掌握油菜去雄杂交技术，了解和掌握油菜自交技术。 2. 学习油菜考种及产量测定方法；了解和掌握油菜形态特征和品质特征。二、实验用品 1.材料甘蓝型油菜或白菜型油菜品种 2.仪器用具剪刀、镊子、网袋、纸袋、回形针、纸牌、铅笔等。三、实验内容 1.花器构造油菜属十字花科(Cruciferae)芸薹属（Brassica），常异花授粉(甘蓝型和芥菜型，天然异交率一般为5%-10%，最高不超过30%)或异花授粉(白菜型，天然异交率一般为 80%-90%以上)作物。油菜的花序为总状无限花序，由主花序和分枝花序组成。在花序上互生许多单花，花由花柄、花萼、花冠和雄蕊等组成。花瓣4片与花萼4 片互生，作十字形排列，称十字

花冠。雄蕊6枚，侧面的一对为短花丝，中央的两对为长花丝，特称四强雄蕊。雌蕊由2心皮组成，由假隔膜(胚座框)将子房隔成两室。胚珠着生在心皮的边缘，为侧膜胚座。 2．开花习性油菜的开花顺序是先主花序，第一分枝、第二分枝花序依次由上而下开放，同一花序的花朵无论是主花序还是分枝花序都是由下向上依次开放。油菜单株花期的长短因品种、气候和裁培条件而异，一般为20-30天，每天开花时间一般在上午7时到12时，以9-11时开花最盛。油菜开花散粉的最适相对湿度为75%-85%，最适温度约为14-18℃。10℃以下开花数减少，5℃以下一般不开花。油菜花的雌蕊较雄蕊先熟，且生活力较强，开花前后7天内柱头均具有受精能力，但以2-3天内受精结实率最高。油菜的花粉落在柱头上45分钟后即可萌发，经1-24小时完成受精过程。 3．油菜的自交不亲和性在油菜杂种优势的利用上，可用优良的自交不亲和系作母本，优良品种作父本，产生强优势的杂交种用于生产，以提高油菜的产量。由于甘蓝型和白菜型油菜的自交不亲和系具有自交不亲和基因，在开花前1-2天柱头上可形成一种由特殊蛋白质组成的“隔离层”，它作为一种“感受器”能识别和阻止相同基因型的花粉发芽，一般套袋自交很难得到种子，因此自交不亲和系的保持和繁殖就必须在柱头未形成这类蛋白质的蕾期选株，并采用人工剥蕾后套袋自交或其它方法进行。

油菜的三种类型

油菜的品种及分类农学0903 朱晨熹2009301200305 油菜，又叫油白菜，苦菜，是十字花科植物油菜的嫩茎叶，原产我国，颜色深绿，帮如白菜，属十字花科白菜变种。凡是十字花科芸苔属中栽培作为油用的植物，统称为油菜。其中包括很多种类。我国栽培的油菜，按其形态和特性可分为三大类型：芥菜型，白菜型，甘蓝型。 1、芥菜型油菜该类型通称高油菜、苦油菜、辣油菜或大油菜，原产于我国西部和西北部。植株高大，株型松散，分枝纤细，分枝部位高，分枝多，主根发达。幼苗基部叶片小而窄狭，披针形，有明显的叶柄，叶面皱缩，且具刺毛和蜡粉，叶缘一般呈琴状，并有明显的锯齿，叶片和种子都有浓郁的辛辣味，这是从芥菜演化而来的残留遗迹。。薹茎叶具短叶柄，叶面稍有皱缩。花瓣较小，不重叠，四瓣分离，角果细而短，种子有辣味，呈黄、红、褐色或黑色，籽粒小，种皮多呈黄色或棕红色，千粒重l～2克，含油率30％左右，油的食味较差。含油量低，一般在30％～35％，高的达60％以上，且油分品质较差，不耐藏，生育期较长，产量低，但抗旱、耐瘠性较强。代表品种有牛尾梢、涟水小油菜、新油1号等。在我国西南、西北和华北等地种植较多。 2、白菜型油菜油菜三大类型之一。学名Brassia campestris L.。包括原产中国的芸薹和油白菜。染色体组为aa,n=10。白菜型油菜是原产于我国西北地区的大白菜演化来的，植株矮小，分枝较小，茎秆纤细，有薄而光滑的椭圆形叶片。边缘有明显的琴状缺刻，上有刺毛，覆被一层薄薄的腊粉，又称为小油菜、矮油菜和甜油莱，我国大部分地区都能种植。另一种白菜型油菜是从小白菜演化来的，在古籍中称为油青菜。它的特点是株型高大，分枝性强，茎秆粗壮，基叶发达，半直立的。宽大的叶片呈随圆形成或卵圆形，全缘或波状，无琴状缺刻。我国各地称为白油菜、油白菜、油菜白等。白菜型油菜籽粒变异极大，千粒重2～3克，有些品种可达4～5克，含油量在40％以上。籽粒大小不一，种皮多为棕红色、褐色或黑色，千粒重2～3克，含油率在35～45％之间。该类型又称小油菜或甜油菜。其植株矮小，幼苗生长较快，须根多；基叶椭圆、卵圆或长卵型，叶上举，有多刺毛或少刺毛，被有蜡粉或不被蜡粉，苞茎而生；分枝少或中等，花大小不齐，花瓣两侧相互重叠，自交结实性很低。种子有褐色、黄色或五花子色，大小不一，千粒重3g；含油量中等，一般在35％～38％，高的达45％以上。该类型生育期短，成熟较早，耐瘠薄，抗病力弱，生产潜力小，稳产性差。该类型还可分为两个种：（1）北方小油菜：古代文献中称为芸薹，株型矮小，分枝少，茎秆细，基叶不

烟草遗传转化实验

烟草遗传转化实验文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]

实验八植物细胞悬浮培养实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。实验器材：超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。实验材料：烟草叶片愈伤组织。实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入150ml 三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。烟草遗传转化实验实验目的

油菜品比试验田间记载标准

油菜品比试验田间记载标准一、田间观察记载项目及方法 1、物候期观察记载（1）播种期：实际播种日期(以月/日表示，以下同) （2）出苗期：预选密度的75%的幼苗出土，子叶平展张开；穴播以穴计算，条播以面积计算。（3）抽苔期：50%以上植株主茎开始延伸，主茎顶端离子叶节达10cm。（4）初花期：全区有25%的植株开始开花。（5）终花期：全区有75%以上花序完全谢花(花瓣变色，开始枯萎)。（6）成熟期：全区有50%以上角果转黄变色，且种子呈成熟色泽（以主花序中上部的角果为考察对象，当果皮呈现成熟色泽即成熟）。（7）收获期：实际收获日期。（8）生育日数：出苗至成熟的天数。以24小时为一天。 2、品种一致性的观察记载（1）幼苗生长一致性：于五叶期前后观察幼苗之大小，叶片之多少。有80%以上幼苗一致者为“齐”；60%-80%幼苗一致者为“中”；生长一致的幼苗不足60%者为“不齐”。（2）植株生长整齐度：于抽苔盛期观察植株的高低、大小和株型。有80%以上植株一致者为“齐”；60-80%植株一致者为“中”；生长一致的植株不足60%者为“不齐”。（3）成熟一致性：于成熟时观察，有80%以上植株成熟一致者为“齐”；60%-80%植株一致者为“中”；成熟一致的植株不足60%者为“不齐”。 3、抗逆性调查（1）抗寒性(冻害)：冻害症状： ①根拔（又称抬根或掀苗）现象当气温下降至-0.50C以下时，夜间根际土壤结冰，体积膨大，将根抬起，白天气温升高，冻土融化下沉，致使苗根外露而受冻。 ②叶片受冻叶片受冻有三种最常见的现象：叶片僵化：叶片在早晨全部僵化，表现为细胞间隙结冰，叶片呈油绿色，脆而易断，到中午前后随着气温的升高，僵化叶片逐渐融化变软而复原，如温度再低或低温持续时间较长，则叶片因

“3414”肥料试验方案设计

肥料效应田间试验 1. 试验目的肥料效应田间试验是获得各种作物最佳施肥量、施肥比例、施肥时期、施肥方法的根本途径，也是筛选、验证土壤养分测试方法、建立施肥指标体系的基本环节。通过田间试验，可以掌握各个施肥单元不同作物优化施肥数量，基、追肥分配比例，施肥时期和施肥方法；摸清土壤养分校正系数、土壤供肥能力、不同作物养分吸收量和肥料利用率等基本参数；构建作物施肥模型，为施肥分区和肥料配方提供依据。 2. 试验设计肥料效应田间试验设计，取决于研究目的。（1）全国农业技术推广服务中心“测土配方施肥技术规范”推荐采用“3414”设计方案，我省在具体实施过程中可根据研究目的采用“3414”完全实施方案、“3414”部分实施方案及“3414”扩展实施方案。（2）有机肥及中、微量元素应用效果试验。（3）配方肥校正试验 3.“3414”完全实施方案全称为:二次回归D—最优设计（3414方案）肥料试验设计 (1)“3414”方案设计吸收了回归最优设计处理少、效率高的优点，是目前国内外应用较为广泛

的肥料效应田间试验方案。“3414”是指氮、磷、钾3个因素、4个水平、14个处理。4个水平的含义：0水平指不施肥，2水平指当地最佳施肥量，1水平=2水平×0.5，3水平=2水平×1.5（该水平为过量施肥水平）。（与码值计算得到的结果相同,原因是此方案不含带有小数的码值。“311—B”，“311—A”等含带有小数的码值。） (2)该方案除了可应用14个处理，进行氮、磷、钾三元二次效应方程的拟合以外，还可分别进行氮、磷、钾中任意二元或一元效应方程的拟合。 (3)其具体操作参照有关的试验设计与统计技术手册。二次回归D—最优设计（3414方案）肥料试验设计 “3414”试验设计的码值方案处理 X1X2X3 号 1000 2022 3122 4202 5212 6222 7232 8220 9221

油菜试验研究观察记载项目和标准

油菜试验研究观察记载项目和标准油菜试验观察记载项目及标准一、物候期观察记载 1．播种期：实际播种日期（以月/日表示，以下同） 2．出苗期：以预选密度的75%的幼苗出土，子叶张开平展为标准，穴播以穴计算，条播以面积计算。 3．现蕾期：以50%以上植株轻轻揭开2~3片心叶，即可见明显的绿色花蕾为标准。 4．抽苔期：以50%以上植株主茎开始延伸，主茎顶端离子叶节达10厘米为标准。 5．初花期：以全区有25%植株开始开花为标准。 6．盛花期：以全区有75%以上花序已经开花为标准。 7．终花期：以全区有75%以上花序完全谢花（花瓣变色，开始枯萎）为标准。 8．成熟期：以全区有50%以上角果转黄变色，且种呈成熟色泽为标准。 9．收获期：实际收获日期。 10．生育日期（包括播种至出苗，出苗至现蕾等）：以24小时为一天，各种生育日数前一物候期出现之当日不足24小时，不能作一天计。二、品种一致性的观察记载 1．幼苗生长一致性：于五叶期前后观察幼苗之大小，叶片之多少。有80%以上幼苗一致者为“齐”；60%~80%幼苗一致者为“中”；生长一致的幼苗不足60%者为“不齐”。 2．植株生长整齐度：于抽苔盛期观察植株的高低、大小和株型。有80%以上植株一致者为“齐”；60%~80%植株一致者中”；生长一致的植株不足60%者为“不齐”。 3．成熟一致性：于成熟时观察，有80%以上植株成熟者为“齐”；60%~80%以上植株成熟一致者为“中”；成熟一致的植株不足60%者为“不齐”。三、抗逆性调查 1．抗寒性（冻害）：在融雪或严重霜冻解冻后三至五天观察。以随机取样法每小区调查30~50株。（1）冻害植株百分率：表现有冻害的植株占调查植株总数的百分数。（2）冻害指数：对调查植株逐株确定冻害程度，冻害程度分0、1、2、3、4、五级，各级标准如下： “0”植株正常，未受冻害； “1”仅个别大叶受害，受害叶层局部萎缩呈灰折色； “2”有半数叶片受害，受害叶层局部或大部萎缩、焦枯，但心叶正常； “3”全部叶片大部受害，受害叶局部或大部萎缩、焦枯心叶正常或受轻微冻害，植株淌云彩恢复生长。 “4”全部大叶和心叶均受冻害，趋向死亡。分株调查后，按下列公式计算冻害指数：冻害指数（%）=[（1×S1+2×S2+3×S3+4×S4）/调查总株数×4] ×100 式中：S1、S2、S3、S4为1-4级各级冻害株数。 2．白锈病：于终花期后15天调查一次。每小区随机调查50株，按分级标准逐株调查记载，统计发病率及病情指数，计算方法同冻害指数和冻害百分率。严重度分级标准如下： “0”无病 “1”1/5以下主花序发病或五个以下角果发病 “2”1/5~3/5主花序发病，引起肿胀弯曲成“龙头拐”状，或花瓣肥肿变绿色、灰白色、畸

“法施得快先生液体肥”在花椰菜上施用的肥效试验

龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/7f898892.html, “法施得快先生液体肥”在花椰菜上施用的肥效试验作者：付德俊李俊许艳斌吕家贵来源：《农村经济与科技》2016年第22期（1.通海县土壤肥料工作站，云南通海 652700；2.秀山街道办农科站，云南通海652700） [摘要]鉴于当前化肥使用效率低下和农业面源污染严重的情况，为实现化肥使用量零增长这一目标，通海县进行了积极的探索，引进“法施得快先生液体肥”在花椰菜上进行肥效试验，探讨不同处理对花椰菜生长以及病虫害的影响。 [关键词]面源污染；法施得快先生液体肥；肥效试验 [中图分类号]S662.1 [文献标识码]A 通海县地处滇中，国土面积721平方公里，位于北纬20度55分11秒-24度14分60秒。东经102度30分60秒-102度52分53秒。海拔在1350-2443m，由坝子和丘陵、河谷三种地貌组成。全县常住人口超过30万，耕地面积有16万亩，农民人均不足0.6亩。而全县只是蔬菜种植面积每年都有40万亩，复种指数高是我县的最大特点，大多数田块复种每年在3-4 茬，每年施用在农业生产上的化肥量达到 5.9万t。大量施用化肥，农产品品质下降，土壤有害物质超标，同时污染地下水，农业生态环境遭到破坏，形成恶性循环，难以实现可持续发展。鉴于当前化肥使用效率低下和农业面源污染严重，农业部前不久表示，将在全国范围内实施化肥使用量零增长行动，力争到2020年主要农作物化肥使用量实现零增长。为了实现化肥使用量零增长这一目标，通海县进行了积极的探索，引进“法施得快先生液体肥”在花椰菜上进行肥效试验。 1 试验材料与方法（1）供试肥料：“法施得快先生液体肥”是由法施得国际有限公司生产，授权云南威鑫农业科技有限公司销售的肥料。“法施得快先生液体”肥1号（16：21：13）具有粗根壮根、提苗壮苗的优势、液体肥2号（25：7：18）具有根深叶茂、强壮植株的优势、液体肥3号（14：8：28）具有壮果膨果、颜色鲜亮的优势；钟祥凯龙楚兴化工有限责任公司生产的复合肥（16-5-23）；史丹利化肥贵港有限公司生产的复合肥（16-5-28）；云南云天化股份有限公司生产的尿素（含氮量46.4%）。（2）供试作物：花椰菜，品种：森马斯。

3414肥料方案

肥料“3414”完全方案设计 “3414”方案设计吸收了回归最优设计处理少、效率高的优点，是目前应用较为广泛的肥料效应田间试验方案。“3414”是指氮、磷、钾3个因素、4个水平、14个处理。4个水平的含义：0水平指不施肥，2水平指当地推荐施肥量，1水平（指施肥不足）=2水平×0.5，3水平（指过量施肥）=2水平×1.5。为便于汇总，同一作物、同一区域内施肥量要保持一致。如果需要研究有机肥料和中、微量元素肥料效应，可在此基础上增加处理。表4-1 “3414”试验方案处理（推荐方案）试验编号处理N P K 1 N0P0K00 0 0 2 N0P2K20 2 2 3 N1P2K2 1 2 2 4 N2P0K2 2 0 2 5 N2P1K2 2 1 2 6 N2P2K2 2 2 2 7 N2P3K2 2 3 2 8 N2P2K0 2 2 0 9 N2P2K1 2 2 1 10 N2P2K3 2 2 3 11 N3P2K2 3 2 2 12 N1P1K2 1 1 2 13 N1P2K1 1 2 1 14 N2P1K1 2 1 1 该方案可应用14个处理进行氮、磷、钾三元二次效应方程拟合，还可分别进行氮、磷、钾中任意二元或一元效应方程拟合。例如：进行氮、磷二元效应方程拟合时，可选用处理2～7、11、12，求得在以K2水平为基础的氮、磷二元二次效应方程；选用处理2、3、6、11可求得在P2K2水平为基础的氮肥效应方程；选用处理4、5、6、7可求得在N2K2水平为基础的磷肥效应方程；选用处理6、8、9、10可求得在N2P2水平为基础的钾肥效应方程。此外，通过处理1，可以获得基础地力产量，即空白区产量。 1、试验地选择试验地应选择平坦、整齐、肥力均匀，具有代表性的不同肥力水平的地块；坡地应选择坡度平缓、肥力差异较小的田块；试验地应避开道路、堆肥场所等特殊地块。 2、试验作物品种选择田间试验应选择当地主栽作物品种或拟推广品种。

油菜试验记载方法与标准

油菜试验记载方法与标准一、生育期：播种期：实际播种时间，以月/日表示。出苗期：75%幼苗出土并子叶张开展平。移栽期：实际移栽期，以月/日表示。抽苔期：75%以上植株主茎伸长，顶端离子叶节10厘米。初花期：25%植株开花。终花期：75%以上花序停止开花。成熟期：75%以上角果显枇杷黄色或主轴中段角果内种子开始变色。收获期：实际收割时间，以月/日表示。全生育日数：出苗至成熟的天数。二、生长动态：一般在苗期、越冬期、抽苔期、始花期各进行一次测量，选择有代表性植株10株，考查以下项目。叶龄：指主茎上已展开的叶片数（进行标记）。绿叶数：指调查时主茎上已展开的绿叶数（不包括子叶）。最大叶片长宽度：长度，从叶片着生处量到叶片的顶端；宽度，测量叶身最宽处。（长柄叶、短柄叶、无柄叶的测量要求见附图）根颈粗：子叶节至出生侧根之间，最粗处的直径（cm）。单株鲜重、干重：包括地上部和地下部。可将根、茎、叶等分别测定鲜重。将称量的样本置于105℃烘箱中，烘30min，然后降至80℃烘至恒重时的重量为干重（单位：g）。

叶面积：测定方法采用长宽系数法测定，也可采用打孔称重法测定。叶面积指数：指群体叶面积与土地面积之比。开展度：指越冬期单株叶片展开的最大宽度。三、室内考种项目和记载标准（每区或品种（系）取样10株）。株高：自子叶节至全株最高部分的长度，以厘米表示。根颈粗：指子叶节处直径，以厘米表示。分枝位高度：指子叶节至第1个一次有效分枝的间距，以厘米表示。一次有效分枝数：指主茎上着生的分枝，具有1个以上有效角果的分枝数。二次有效分枝数：指一次分枝上着生具有1个以上有效角果的分枝数。主轴有效长度：指主花序上第一个有效角果至顶端有效角果之距，以厘米表示。结角密度：指主花序长度，与总有效角果数之比，以个/厘米表示。全株有效角数：指主花序、一次分枝、二次分枝上具有1粒以上的角果总数。角果长度：即果身长度（不包括果柄和果喙）。见附图角果宽度：指角果最宽部位的宽度。见附图每角果粒数：在典型植株上，按比例分段，随机摘取20个正常角果，计算平均种子数。千粒重：用晒干纯净种子，随机取样3份，分别称重取差异不超过3%的平均值，以克表示。单株生产力：考种的单株分别脱粒称重，求其平均值（单位：g）。产量：以区实收产量为准，晒干后扬净称重，以公斤表示，折合亩产量。产量计算时准确到小数点后两位。（或以测定水份含量后折算）种子品质：测定采用近红外光谱分析。

油菜试验记载标准及相关表格

附件1 油菜品种试验记载标准 1气候概况及自然灾害对试验的影响何种因素、时间及影响程度。 2播种期实际播种日期（以月/日表示，下同）.如遇特别干旱不能及时出苗，需记载播种后的降雨及灌溉情况。 3现蕾期以50%以上植株可见明显的绿色花蕾为标准。 4初花期以全区有25%植株开始开花为标准。 5终花期以全区有75%以上植株完全谢花（花瓣变色，开始枯萎）为标准。 6成熟期以全区有50%以上角果转黄变色，且种子呈成熟色泽为标准。 7收获期实际收获日期。 8品种生长势和一致性 8.1调查时间抽苔后期观察植株的高低、大小和株型。 8.2分级标准生长势分“强”、“中”、“弱”三级；一致性分齐、中、不齐三级。80%以上植株一致者为“齐”；60%-80%4株一致者为“中”；生长一致的植株不足60%^为“不齐”。 9抗逆性调查 9.1抗寒性

9.1.1调查时间在融雪或严重霜冻解冻后三至五天调查 9.1.2评价方法表现有冻害的植株占调查植株总数的百分数。 9.2抗倒伏性 9.2.1 调查时间在成熟期进行目测调查。 9.2.2分级标准分直、斜、倒三级。主茎下部与地面角度在80度以上为“直”；80度至45 度者为“斜”；小于45度者为倒。 9.3抗病性青荚后期记载各品种菌核病、病毒病的田间发生情况。按抗、中、感三级记录。20%以下植株明显感病者为“抗”；20%-50%植株明显感病者为“中”；50% 以上植株明显感病者为“感”。 10考种项目 10.1株高子叶节至全株最高部位的长度，精确至0.1cm； 10.2分枝部位子叶节至主茎上第一个有效分枝间的长度，精确至0.1cm； 10.3有效分枝数至少有一个有效角果的分枝总数，包括一次分枝和二次分枝，精确至0.1个；10.4有效角果数含有1粒以上饱满或半饱满种子的角果总数，包括主花序有效角果数和全株有效角果数，精确至0.1角； 10.5每角粒数

甘蓝型油菜矮杆基因Bnrgads的克隆和功能分析

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文是否保密否如需保密，解密时间年月日独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意．研究蝴：到怨帆汐／，9年乡月罗日学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力．注：保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文)在解密后适用于本授权书．学位敝作者签名：割超导师张壕、趁签名日期：．zofo牟-、乡月9日签名日期如p年彳月，6日。注；请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间

一—————————————————————————————————————————————一——一—— 甘蓝型油菜矮杆基因Bnrga．ds的克隆和功能分析目录摘；要．I Abstract ．．．III 缩略语表VI 第一章文献综述．1 1．1禾本科作物矮杆突变体的遗传研究和应用1 1．1．1水稻矮杆突变体的遗传研究和应用l 1．1．2小麦矮杆突变体的遗传研究和应用2 1．2油菜矮杆突变体遗传研究现状．3 1．3高等植物矮杆性状的机理研究5 1．3．1赤霉素与植物矮化5 1．3．1．1 GA生物合成途径与植物矮化．5 1．3．1。2 GA信号转导途径与植物矮化7 1．3．2油菜素内酯和植物矮化12 1．3．2．1 BR生物合成和植物矮化．．13 1．3．2．2 BR信号转导途径和植物矮化．．15 1．3．3生长素与植物矮化．．1 5 1．3．3．1生长素生物合成和植物矮化15 1．3．3．2束缚型生长素的形成和植物矮化16 1．33．3生长素的极性运输与植物矮化16 1．3．3．4生长素信号转导途径和植物矮化．17 1．4本研究的目的和意义．．17第二章材料和方法一19 2．1植物材料．1 9 2．2矮杆基因的定位19 2．2．1定位群体的构建19 2．2．2基因组DNA的提取．．19 2．2．3 BSA法和SSR分析．．20 2．2．4 PAGE凝胶制备和电泳检测．．21

农杆菌介导油菜转化实验

农杆菌介导的油菜遗传转化操作流程一、所需试剂母液配制方法 1. MS母液配制方法见小孢子培养部分。 2. 6-BA（6-苄基嘌呤）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g 6-BA用微量HCl溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。 3. NAA（α-萘乙酸）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g NAA用微量NaOH溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。 4. 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g 2,4-D用微量NaOH溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。 5. AgNO3：称取0.5 g AgNO3溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤。 6. AS（乙酰丁香酮）：溶解于DMSO（二甲基亚砜），母液浓度为100 mM，0.22 μm有机系滤膜过滤，分装成小份保存。 7. Kan（卡那霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。 8. Carb（羧苄青霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22 μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。 9. Cef（头孢霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。二、操作流程 1. 无菌受体材料的准备选取饱满、干净的油菜种子用75%乙醇浸泡1 min，然后在0.1%升汞中灭菌10~15 min，无菌水冲洗4~5次，用无菌滤纸吸干多余的水分，接种于1/2 MS（添加10 g/L 蔗糖，0.7 % 琼脂，pH 5.8）培养基上，25~28℃下暗培养，待种子萌发再移至光下培养，光照16 h/d，强度 2000 lx左右。 2. 受体材料的预处理取4~6 d的无菌苗子叶或下胚轴作为转化受体。用解剖刀切下完整的子叶（带1~2 mm子叶柄）或下胚轴（5~10 mm），将切下的外植体置于预培养基（MS +30 g/L 蔗糖 + 0.7% 琼脂 + 1 mg/L 6-BA + 1 mg/L 2,4-D，pH 5.8）上进行预培养2~3 d，材料切口处刚开始膨大时即可进行接种浸染。 3. 供体菌株培养 1) 固体培养基和液体培养基的配制：此处给出常用LB培养基（Luria-Bertani）培养基的配制方法。 LB液体培养基：称取胰蛋白胨（bacto-tryptone）10 g，酵母提取物

马铃薯遗传转化方法

农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系 Steve Millam 摘要：马铃薯是一种全球性的重要农作物，其块茎作为营养丰富的食物，产量很高。马铃薯之所以成为大量研究的焦点，是因为它既作为一种主要粮食作物，又能作为所关注的化合物的潜在重要来源。转基因技术的发展和应用已经用于马铃薯上，并以此来引进基础且实用的新奇目标特征。本文描述了一个快速、高效和低成本的马铃薯遗传转化系统，与平常的转化相比，其转化效率可超过40%。基于核酸印迹法的平均值计算，证实了每个外植体切片在转基因上的独立性。将节间切片与农杆菌一起培养，然后在卡那霉素的筛选下，经历一个双阶段的愈伤组织诱导/出芽系统。用这种描述的方法可以获得很高的幼芽再生率，而且经过2次继代培养后，离体茎段从伤口末端生根，保证有95%的外植体被转化。这种转基因状态可以通过分子分析来证实。马铃薯的块茎生长也促使了大范围的进一步的研究。 1．介绍马铃薯是最早用于遗传转化的植物之一。Ooms等人在1986年用农杆菌浸染马铃薯Desiree品种的组织并使组织再生，这成为马铃薯转化的直接证据。转基因品种Desiree和Bintje所用的农杆菌由Stiekma等人提供。de Block报道了一种以叶圆片作为靶组织，且与基因型无关的转基因方法。Visser等人以茎段和叶片为外植体，提出了包括再生和转化在内的两步法，并作为目前众多已使用的实验方案的基础。各种马铃薯组织相对容易的根系再生也支持了这些已经报道的马铃薯遗传转化系统。目前许多正在使用的实验方案都报道了一个两步再生法，及先进行愈伤组织诱导，再进行根系再生。在愈伤组织诱导阶段通常会尽可能避免马铃薯体细胞突变。第一步通常是加入1-5mg/L的玉米素（zeatin）或者玉米素核苷（zeatin riboside），并结合低浓度的生长素（通常是的萘乙酸（NAA）或者吲哚乙酸（IAA））,以此促进外植体产生愈伤组织。第二步，将玉米素浓度降低20%，将生长素浓度降低10倍，同时加入赤霉素来刺激根系再生。每个外植体的再生速率都很高，经过4-6周可生出第一批根，培养10-12周后可每个外植体都会长出至少10条根。以卡那霉素（kanamycin）或者潮霉素（hygromycin）作为筛选标记可以很容易地用肉眼进行分析，然后切除可能与转化无关的根。那些含有抗生素抗性基因的苗将会很明显从茎的切口处长出根，而那些非转基因的苗将不会生根或者从不定位点生根。使用不同的栽培品种或者组织，其转化效率也不同。但是根据重复实验的记录显示，从最初的外植体到确定的转基因单株的比率在40%到100%之间。

小麦遗传转化技术的研究进展

X X 学院本科毕业论文小麦遗传转化技术的研究进展所在学院专业名称申请学士学位所属学科年级学生姓名、学号指导教师姓名、职称完成日期

摘要摘要最近几年小麦遗传转化方法的研究发展快速。自报道第一株转基因小麦以来，小麦转基因育种研究取得了很大的成就。转基因技术实现的小麦遗传转化进一步补充了经典小麦育种的不足，可利用基因库的限制被有效的降低了，取得了可喜的进展。为了实现小麦转基因工程育种更好更快的发展，人们尝试了利用基因枪、花粉管通道、超声波、离子束注入、激光穿刺和农杆菌介导等方法转化小麦。经过十多年的努力，研究者对小麦转基因技术的研究取得了实实在在的进展。目前，基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法是主要的小麦遗传转化方法，研究涉及小麦各种抗性、品质改良、提高产量等方面。本文介绍、比较，分析了小麦遗传转化的主要方法，包括其基本原理、优缺点及其影响因素，以期通过本文人们能更好的了解小麦遗传转化技术及其进展，促进其持续改进和提高。关键词：小麦，遗传转化，基因枪法，农杆菌介导法，花粉管通道法 Ⅰ

Abstract ABSTRACT In recent years wheat genetic transformation method developing so fast.Since the first reports of transgenic of wheat, wheat transgenic breeding research has achieved great things.Wheat genetic transformation of transgenic technology to further complement the classic deficiencies of the wheat breeding, effectively reducing the restrictions on the use of gene libraries, has made encouraging progress. In order to realize the wheat genetically modified engineering breeding better and faster development, people try using gene gun, pollen tube channel, ultrasonic, ion beam injection, laser puncture and agrobacterium mediated transformation method such as wheat. After ten years of hard work, the researchers on wheat transgenic technology research made real progress. At present, the gene marksmanship, agrobacterium-mediated technique and pollen tube channel is the main method of wheat genetic transformation method, research involves the wheat all resistances, quality improvement, increase production, etc. This paper introduces, the comparison, analyzes the main method of wheat genetic transformation, including its basic principle, advantages and disadvantages and its influencing factors, so as to through this article, people can better understand the wheat genetic transformation technology and its progress, and promote continuous improvement and improve. Key words:Wheat, genetic transformation, gene marksmanship, agrobacterium-mediated technique, pollen tube channel method Ⅱ

水稻遗传转化体系Protocol

水稻遗传转化体系Protocol Introduction 1．水稻的遗传转化研究历史与现状 20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源 3]。1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1 ~ 获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼 13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5 ~ 独立的转化植株)。 2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11] a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。 b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究 c. 转基因抗旱水稻 d. 转基因营养高效利用水稻

植物遗传转化研究进展

植物遗传转化研究进展重庆师范大学生命科学学院生物科学（师范）专业 2009级指导教师摘要：植物遗传转化是一项农业生物技术，它通过某种途径或技术将外源基因导入受体细胞的全基因组中，并使之在受体细胞中得以充分表达。目前一些重要农作物转基因品种已经或即将投入到实际应用，随着研究的不断深入,本文对植物遗传转化的技术作出了新的展望。关键词：植物遗传转化；植物遗传转化方法；应用；进展 Abstract：Plant genetic transformation is a kind of agricultural biotechnology.It delivers to the whole-genome of receptor cells through a certain approach or technique to make the exogenous genes fully expressed in receptor cells. At present, genetically modified varieties of some important crops have been or are about to put into the practical use. with the deepening of the research,this paper makes a new outlook of the plant genetic transformation technology. Key words: Plant genetic transformation; the approaches of plant genetic transformation; application; progress 植物遗传转化是指以植物的器官、组织、细胞或原生质体作为受体，通过某种技术或途径转入外源基因，获得使外源基因稳定表达的可育植株。遗传转化也称为转基因技术。转基因植物的研究始于20世纪70年代。到了20世纪80年代，由于基因操作技术的提高和目的基因构建模式等内容的基本完成，植物转基因技术便应运而生。1983年获得了第一例转基因烟草，使植物基因工程发生了质的飞跃，植物转基因技术也已经得到了广泛的应用和发展，人们开始对外源基因导入植物细胞的方法进行大量的探索，建立了多种方法用于植物的基因转化。目前应用最普遍的植物基因的遗传转化方法主要有农杆菌介导法和DNA直接转入法[1,2]。

烟草遗传转化实验(仅供参照)

实验八植物细胞悬浮培养实验目的：学习和掌握植物细胞悬浮培养的操作技术与方法。实验器材：超净工作台、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、250 mL 、500 mL三角瓶、镊子、酒精灯等。配置MS液体培养基（2，4-D 2 mg/L+1%甘露醇 +3% 蔗糖，pH 5.8）分装于250ml的三角瓶中，每瓶50ml。实验材料：烟草叶片愈伤组织。实验方法： 1.70%乙醇净化工作台并擦洗干净，将所用的材料、工具、培养基等放入工作台。打开紫外灯和风机，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。 2. 在超净台上用无菌镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织，放入 150ml三角瓶中并轻轻夹碎,每个三角瓶加入培养基20-30ml，每瓶接种1-2g愈伤组织，按愈伤组织与液体培养基1∶10的比例，以保证最初培养物中有足够量的细胞。 3.接种后的三角瓶用天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速 100-120rpm，25℃下培养以及散射光条件下，进行振荡悬浮培养。 4.每周更换新鲜液体培养基两次，每次更换1/3。每次更换新鲜培养基时称取重量。 5. 每个人接种悬浮培养细胞1瓶，观察并记录细胞生长情况。 6. 培养7天后，制作细胞生长曲线：为了解县浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图：鲜重法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮培养物，离心收集后，称量细胞的鲜重，以鲜重为纵座标，培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。

烟草遗传转化实验实验目的烟草是遗传转化的模式植物，已经建立了一套完善的转化再生体系。本实验以烟草为实验材料，了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤，掌握遗传转化的基本操作技术。实验要求：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解转基因植物筛选的方法。实验原理根癌农杆菌是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称为Ti质粒。野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T－DNA 区，含致瘤基因；另一个是毒性区，在T－DNA的切割、转移与整合过程中起作用。用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒载体系统的构建，是将野生Ti质粒中的致瘤基因删除，并在T－DNA区域内插入适当的选择标记和多克隆位点。 p BI121载体是常用的植物表达载体，载体的骨架是pUC18，以CaMV35S启动子驱动的新霉素磷酸转移酶基因NPTII为卡那霉素（kan）抗性选择标记基因，含有卡那霉素抗性基因作为筛选基因。β－葡萄糖苷酶gus基因作为报告基因，转化的获得的转基因细胞、组织或植株，具有抗卡那霉素的特性，经组织化学染色呈蓝色。实验器材摇床、超净工作台、小型离心机、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签。实验材料植物材料：烟草无菌苗农杆菌与载体：农杆菌LBA4404 p BI121 YEB培养基：牛肉膏(5 g/L)、蛋白胨(5 g/L)、酵母提取物(1 g/L)、蔗糖(5 g/L)、MgSO4 (0.5 g/L)、pH 7.0 烟草分化培养基：MS + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L IAA 烟草生根培养基：MS + 0.5mg/L IAA 卡那霉素（Kan）母液：50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。头孢霉素（cef）母液：300mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。利福平(rif): 50mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。

拟南芥的遗传转化技术

拟南芥的遗传转化技术 1种子消毒处理用70%的乙醇浸泡2分钟，用15% （体积比）NaClO溶液旋转洗涤10分钟，无菌水漂洗5次。 2播种和移栽用无菌水重悬浮消毒处理的种子，均匀分散到1/2MS固体培养基表面上，培养皿倒置，4°C春化两天，25°C正置暗培养一天，再置于22°C的组织培养室中正常培养。待苗长至四片叶子时，将其移栽到营养土中，置于22°C恒温环境中，16h光照/8h黑暗培养，初期可适当绕些营养液。 3拟南芥幼苗修剪植株长出顶生花序时，去除其顶生花序，以刺激腋生花序的生长，注意避免伤及腋生花序。准备侵染前，剪除角果以及开放过的花朵。 4拟南芥的遗传转化 4.1农杆菌感受态细胞的制备及转化 (1)取-80℃超低温冰箱中保存的农杆菌菌株GV3101，在（含50mg/LRif和 100mg/L Kan)的YEB培养基平板上划线，28℃培养约36-48 h。（单菌落）(2)挑取单菌落GV3101接种于5ml LB液体培养基（含50mg/LRif和100mg/L Kan) 中，28℃200rmp/min振荡培养过夜；（活化） (3)取2ml菌液转入100ml LB液体培养基(含50mg/LRif和100mg/LKan)中继续培养至OD600=0.5；（增殖培养） (4)转入50ml无菌离心管中，冰浴30min，4℃，4000r/min离心10min，弃上清； (5)加入10ml预冷的150mmol/L NaCl重悬菌体； (6)4℃，4000rmp/min 离心10min，弃上清； (7)加入1/10体积预冷的50 mmol/L CaC12重悬菌体；

(8)分装于无菌l.5ml离心管中，100ul/管，4℃保存备用；取1ug提取纯化的重组质粒DNA，加入200u1感受态细胞中，混匀； (9)冰浴10min，转入液氮冷冻5min，迅速置于37℃水浴，热激5min； (10)加入500ul LB液体培养基，28°C，200rmp/min振荡培养2-3h； (11)5000r/min 离心2min，弃上清； (12)剩余菌液(残留100ul左右)用移液器反复抽吸悬浮，然后均匀涂布于LB平板(含50mg/L Rif，100mg/LKan)表面，28℃培养2-3d。 4.2 含有重组质粒的农杆菌的PCR鉴定挑取LB平板上的单菌落，接种于5ml LB液体培养基（含50mg/L利福平Rif,100mg/L Kan)中，28℃培养1-2d，以未转化的农杆菌作对照，进行菌落PCR 鉴定。 4.3花序法侵染拟南芥 (1)挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基(含50mg/L Rif和100mg/L Kan)中， 28℃200rmp/min振荡培养过夜； (2)取2ml 菌液转入100ml LB 液体培养基(含50mg/LRif 和100mg/L Kan), 28℃ 200rmp/min振荡培养至OD600值为1.0-1.5左右； (3) 6000rmp/min，离心10min，弃上清； (4) 1ml 5%蔗糖溶液悬浮，6000rmp/min，离心2min，弃上清； (5) 重复步骤4； (6) 加入5%蔗糖溶液重悬菌体，至OD600值为0.4-0.7左右； (7) 浸泡前按0.05%体积比加入silwet 77表面活性剂； (8) 浸泡前绕水，并将已经结的荚剪去，将花苞浸泡于上述溶液中1min； (9) 将植株倒置，黑暗培养24h，取出，正常生长培养。